CC BY
8УДК 575.222.2:632.4.01/0.8:632.952
Е.В. Воронкова1, В.И. Лукша1, О.Н. Гукасян1, А.Г. Жуковский2, С.Ф. Буга 2, Е.А. Волуевич1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР-ПДРФ МЕТОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МУТАЦИИ G143A УСТОЙЧИВОСТИ К СТРОБИЛУРИНАМ В ИЗОЛЯТАХ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕПТОРИОЗА ЛИСТЬЕВ ПШЕНИЦЫ
1 ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, Академическая, 27 2 РУП «Институт защиты растений НАН Беларуси» Республика Беларусь, 223011, Минский р-н, д. Прилуки, ул. Мира, 2
Введение
Септориоз (пятнистость) листьев пшеницы является одним из самых распространенных и вредоносных заболеваний этой культуры во всем мире, включая Европу, Северную и Южную Америку, Австралию. Он вызывается грибом Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schröter., принадлежащим к отделу Ascomyceta (сумчатые грибы). Патоген поражает как мягкую, так и твердую пшеницу [1-3]. Предполагают, что он возник вместе со своим основным растением-хозяином (пшеницей) в странах Плодородного полумесяца [4] и распространился в другие страны мира с помощью переносимых ветром аскоспор и/или инфицированных тканей растений. В условиях эпифитотии септориоз способен привести к серьезным потерям урожая зерна: до 40% [5] и даже до 60% у некоторых сортов пшеницы [6]. В Беларуси эта болезнь распространена достаточно широко и является весьма вредоносной [7].
Для контроля патогена используют различные методы. Наряду с созданием генетически устойчивых сортов, применяют различные агротехнические мероприятия, из которых наиболее эффективна обработка вегетирую-щих растений фунгицидами, в частности системными фунгицидами, принадлежащими к группе стробилуринов (QoIs ингибиторов) [8, 9]. Стробилурины, новейший класс фунгицидов для контроля грибных патогенов растений, широко используются в растениеводстве. К этому классу относятся 8 различных фунгицидов, зарегистрированных в 85 странах мира для использования на более чем 80 сельскохозяйственных культурах, в том числе и один из самых продаваемых в мире препаратов азок-систробин [10]. Однако отмечено быстрое развитие устойчивости в популяциях патогенов к
фунгицидам данного класса. Так, например, было показано, что частота устойчивых изоля-тов возбудителя мучнистой росы ячменя Blumeria graminis Г sp. ^^I может увеличиться от 2% до 58% в течение одного сезона после трех применений фунгицидов [11]. В ряде исследований показано, что у разных видов Mycospharella устойчивость к стробилуринам также развивалась очень быстро [12, 13, 14]. Впервые она была обнаружена ретроспективно в Великобритании в 2001 г. на обработанных фунгицидами полях пшеницы с очень низкой частотой встречаемости резистентных изолятов [15], а затем, в 2002 г., резистентность была отмечена уже в пяти европейских странах [16]. В 2003 г. частота и распространение резистентности резко увеличились в различных географических регионах континента, достигая особенно высоких уровней в странах северной Европы [16]. Мониторинг популяций М. graminicola в Западной Европе в течение последних 20 лет показал медленный, но постоянный сдвиг в сторону уменьшения чувствительности гриба к стробилуринам [1619]. По данным мониторинга, проведенного в 2007-2009 гг. во Франции, изоляты дикого типа, чувствительные к действию фунгицидов, почти полностью исчезли.
Степень риска, связанного с устойчивостью к фунгицидам, зависит от механизма действия активного вещества препарата, методологии использования фунгицидов и от эволюционного потенциала гриба, против которого применяется средство химзащиты [5, 6]. Особенность класса стробилуринов заключается в том, что их действие нацелено не на ядерные гены, как у большинства современных фунгицидов, а на митохондриальный геном.
Эти фунгициды ингибируют митохондриаль-ное дыхание у грибов в результате остановки переноса электронов в дыхательной цепи на участке цитохром bc1 белкового комплекса (комплекса III), что приводит к возникновению дефицита энергии из-за отсутствия аденозин-трифосфата (АТФ) [10, 21]. Так как митохон-дриальное дыхание требуется всем грибам, стробилурины эффективны против широкого спектра грибных патогенов растений, включая аскомицеты, базидиомицеты и дейтеромице-ты, а также оомицеты.
У большинства патогенов, в том числе М. graminicola, устойчивость к стробилури-нам обусловлена однонуклеотидным полиморфизмом в митохондриальным гене cyt b [12, 13, 22]. При наличии этой точковой мутации гуанин замещается на цитозин в кодоне 143, что приводит к замене глицина на аланин (G143A) в белке цитохром b [23]. Данная мутация препятствует связыванию стробилурина на участке, являющемся мишенью действия фунгицида, что приводит к восстанавлению способности митохондрий гриба к дыханию. Резистентность изолятов за счет мутации G143A позволяет им выжить при обработках стробилурином в концентрации в 100 раз выше, чем требуется для гибели чувствительных изолятов. Было показано, что в популяциях некоторых патогенов мутация в гене cyt b присутствовала еще до того, как были введены в обращение QoIs фунгициды, то есть она возникает спонтанно, однако существенное накопление этой мутации в популяции патогенов обусловлено давлением отбора, оказываемым фунгицидом [22]. Попытка снизить такое давление в популяциях М. graminicola использованием ряда агрохимических приемов, оказалась малоуспешной. Так уровень устойчивости гриба к стробилуринам за счет распространения митохондриальной мутации G143A в Великобритании увеличился с 35% до 80% в 2003-2004 гг. Аналогичную тенденцию наблюдали и в других северо-западных европейских странах [24, 25]. Быстрое распространение митохондриальных гаплотипов, характеризующихся наличием мутации G143A, в Европе (с 8-ми в 2002 г. до 24-х к 2004 г.) позволило предположить, что это последствие нескольких независимых мутационных событий. Действительно, было показано, что устой-
чивость к стробилуринам появилась независимо, в результате, по меньшей мере, четырех повторяющихся мутаций в том же самом сайте цитохрома Ь, а не путем перемешивания различных генетических фонов через половую рекомбинацию [26, 27]. Выявлено, что повторяющиеся независимые мутации приводили к появлению аллеля резистентности к QoIs в различных географических районах на разных генетических фонах. После этого частота устойчивых гаплотипов гриба увеличивалась в результате сильного отбора фунгицидом, и устойчивые изоляты распространялись аско-спорами с помощью ветра [27], создавая поток генов в направлении с запада на восток.
Биологические особенности M graminicola способствуют быстрому распространению устойчивых к фунгицидам гаплотипов. Это гаплоидный, гетероталличный аскомицет, воспроизводящийся как половым (аскоспо-рами), так и бесполым (пикнидиоспорами) путем. В течение одного вегетационного периода растения-хозяина (пшеницы) он может дать несколько генераций. При этом гриб сохраняется и выживает на растительных остатках (на листьях и стерне), передаваясь из одного сезона в другой. Половое размножение играет важную роль в генетическом разнообразии популяций М graminicola, в результате чего патоген характеризуется высокой биологической приспособленностью [28]. Молекулярно-генетический анализ популяций Ы. graminicola показал высокий поток генов внутри и между популяциями [29-31]. Генетические популяционные исследования, основанные на экспериментах, проведенных в полевых условиях, показали, что патоген может значительно измениться в течение одного вегетационного периода в соответствии с генотипами растения-хозяина [32]. Это объясняет, почему даже очень низкие частоты мутации устойчивости в гене cyt Ь в исходной популяции могут привести к быстрой потере эффективности QoIs [15]. Изучение характера наследования устойчивости Ы. graminicola к стробилуринам показало, что чувствительные к фунгициду изоляты выступают при размножении гриба в качестве отцовского родителя. В результате этого появляющиеся потомки, несущие мутацию в митохондриальном геноме, передающемся от материнского родителя,
являются устойчивыми к стробилуринам. Данный процесс не зависит от различий в приспособленности и наследовании ядерных генов, которое проходит в соответствии с менделев-ской схемой расщепления [33]. Таким образом, быстрое распространение мутации G143A и развитие резистентности к стробилуринам у M. graminicola во многих странах Европы определяется высокой частотой точечных мутаций, затрагивающих один сайт и материнским наследованием признака резистентности у этого гермафродитного, биполярного, гете-роталличного гриба [33].
Особенности наследования мутации G143 A, приводящей к быстрому развитию резистентности к фунгицидам среди популяций M. graminicola, указывают на необходимость мониторинга ее распространения в регионах выращивания зерновых культур, в частности на посевах пшеницы. Проведение такого мониторинга с помощью фитопатологических тестов достаточно трудоемко, дорогостояще и требует значительных затрат времени, что усложняет задачу. Torri-ani с соавторами предложили метод ПЦР-ПДРФ
детекции мутации G143A в изолятахM. gramini-со1а [27, 34]. Они показали его достаточно высокую эффективность для оценки развития устойчивости в различных регионах западной Европы и определения путей миграции этой мутации. В Беларуси молекулярно-генетические исследования по изучению мутаций, определяющих устойчивость к фунгицидам у фи-топатогенных грибов, ранее не проводились, несмотря на высокую эффективность методов ПЦР-диагностики, показанную в различных областях, и значимость такой диагностики для оптимизации химической защиты от патогенов сельскохозяйственных культур. В связи с этим, задачей данного исследования была разработка методологии оценки изолятов грибаM. gramini-со1а на наличие мутации G143A, включавшей как оптимизацию методики выделения и очистки ДНК гриба, так и подбор оптимальных условий проведения ПЦР-ПДРФ анализа. В задачи исследования также входило выявление мутации среди изолятов гриба из коллекции Института защиты растений НАН Беларуси, собранных в разных регионах страны.
Материалы и методы
Для отработки метода ПЦР-диагностики устойчивости M. graminicola к стробилури-нам использовали пять литовских изолятов гриба, которые были охарактеризованы зарубежными исследователями как резистентные и чувствительные к стробилуринам на основе биотеста. Эти изоляты были предоставлены сотрудникам РУП «Институт защиты растений НАН Беларуси» (ИЗР НАНБ), чтобы их можно было использовать в качестве положительных и отрицательный контролей данного признака в настоящих молекулярно-генетических исследованиях. Диагностику наличия мутации G143A осуществляли с использованием маркера Mgcytb/Fnu4HI (Sat1) [34] у 85 изолятов, собранных в разных регионах Беларуси с пораженных болезнью сортов мягкой пшеницы сотрудниками ИЗР НАНБ.
Мицелий гриба выращивали на твердой ага-ризованной среде способом нанесения ино-кулюма наплывом слоя жидкой питательной среды, содержащей споры, на твердый слой (первый способ) и нанесением инокулюма микробиологической петлей на твердую питательную среду (второй способ). Выделение
и очистку ДНК из мицелия гриба после его растирания в жидком азоте осуществляли с использованием стандартного набора «Genomic DNA Purification Kit» (Thermo scientific EU) по модифицированной нами методике.
Наличие мутации G143A устойчивости к стробилуринам у изолятов М. graminicola определяли методом ПЦР-ПДРФ. Использовали пару праймеров MgcytbF/R: MgcytbF 5'TCGTTACTGGTG TTACACTTGC 3' и MgcytbR 5'GCCATAACATAATTCTCGCTGT-CACC3' с последующей рестрикцией полученного амплифицированного фрагмента эндо-нуклеазой Fnu4Hl/Satl (Thermo scientific EU). Праймеры синтезированы в ОДО «Праймтех» (г. Минск, Беларусь).
Базовые условия ПИР соответствовали [34] с последующей модификацией, экспериментально адаптированной для использованных нами реактивов и модели термоциклера. Для получения ПЦР-фрагментов на основе большинства препаратов ДНК использовали Вю-Тад-полимеразу производства Dialat (г. Москва, Россия) с сопутствующими реактивами для ПЦР этого же производителя.
Реакционная смесь в конечном объеме включала: препарат ДНК в концентрации от 50 до 100 нг; MgCl2 - 1,8 мМ; каждого из dNTP - по 0,1 мМ; праймеров (прямого и обратного) - по 0,2 мкМ (200 нМ); ВюТа^-ДНК-полимеразу -
1 ед; однократный буфер для BioTag-ДНК-полимеразы (166 мМ (NH4)2SO4, 670 мМ Tris-HCl pH 8,8 при 25 °С и 0,1% Tween-20) с доведением объема до конечного деионизиро-ванной водой. Предложенная [34] программа для ПЦР оказалась приемлемой для использования на термоциклере GenAmp PCR System 2700 (2720), Applied Biosystems, США и позволяла получать воспроизводимый результат. Программа включала начальную денатурацию в течение
2 мин при 96 °С; далее 35 циклов по 60 с при 96 °С, 60 с при 50 °С и 1 мин при 72 °С; финаль-
Результаты
В нашей стране молекулярно-генетическая диагностика грибов рода Mycosphaerella проводилась впервые, поэтому одной из задач исследования была отработка методики получения препаратов ДНК патогенного гриба в количестве и качестве, удовлетворяющем целям эксперимента и позволяющем осуществлять диагностику наличия хозяйственно значимых мутаций у любого коллекционного образца. Было определено, что для успешного выделения тотальной ДНК в концентрации, дающей возможность идентифицировать митохондриальную мутацию, достаточно мицелия, выращенного в одной микробиологической чашке Петри. При этом способ нанесения инокулюма наплывом слоя жидкой питательной среды, содержащей споры, на твердый слой, или нанесением инокулюма микробиологической петлей на твердую питательную среду, особой роли не играл. Однако второй способ был более предпочтительным, т.к. позволял собирать с поверхности чистый и сухой мицелий, что при выделении ДНК путем растирания в жидком азоте позволяло добиться лучшего результата при гомогенизации и разрушении клеточных стенок гриба.
Из литературы известны случаи неудач при получении препаратов ДНК патогенных грибов. Использованная нами методика выделения и очистки ДНК с помощью набора «Genomic DNA Purification Kit» после предварительного разрушения клеток мицелия в жидком азоте дала возможность получить качественные препараты ДНК у всех изучаемых изолятов. Однако
ную элонгацию в течение 5 мин при температуре 72 °С. В результате амплификации получали специфический продукт размером около 650 п.н.
Рестрикцию продукта ПЦР осуществляли в соответствии со следующим протоколом: реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 10 мкл ПЦР-продукта, 0,4 мкл рестрикта-зы SatI (Fnu4HI) и 2 мкл рекомендуемого для этой рестриктазы G-буфера 10* с доведением объема до конечного деионизированной водой. Реакцию рестрикции проводили в термостате при 37 °С в течение 16 часов. Размеры продуктов рестрикции определяли при горизонтальном электрофорезе в 2%-ном агарозном геле при напряжении тока 80 V в течение 1 ч с использованием маркера молекулярного веса «Сибэнзим» (Россия) 100-1000 п.н.
и обсуждение
для получения гарантированного результата в стандартную методику, предлагаемую производителем, следует внести ряд модификаций. В частности, мы увеличили время лизиса с рекомендуемых производителем 5 до 20 минут, что позволяет достичь гораздо лучшего лизиса клеток грибных гиф, содержащих хитин. Нами также увеличено время центрифугирования гомогената после обработки его хлороформом с рекомендуемых 2 мин при 10 000 об/мин, что оказалось недостаточным при выделении ДНК из мицелия грибов, до 15 мин при 12 000 об/мин. Также было необходимо увеличить до 15 мин и время центрифугирования после осаждения. При меньшем времени центрифугирования преципитата «таблетка» может не образоваться, а ДНК в виде длинных тяжей вылиться вместе с водной фракцией. Для окончательного осаждения ДНК мы рекомендуем использовать не этанол, как описано в стандартной методике, прилагаемой к набору, а изопропанол с добавлением 45 мкл пятимоляр-ного раствора ацетата аммония, и осаждение проводить в морозильной камере (минус 20оС) в течение 18-24 часов. Период замораживания можно исключить или сократить до 10-20 мин, однако выход ДНК при этом может существенно понизиться. Данная модифицированная методика позволяет получать при оптимальном количестве исходного материала каждого изолята до 3000 нг/мкл очищенного препарата ДНК гриба, пригодного не только для ампли-
фикации с использованием специфического праймера, но и для других целей, например, для идентификации генотипов или популяци-онных исследований с помощью произвольных праймеров. На рис. 1 приведен пример исполь-
зования ISSR-праймера UBC857 для оценки качества препаратов тотальной ДНК, полученных при описанном выше модифицированном способе ее выделения, и полиморфизма изоля-товМ. graminicola литовского происхождения.
M St la Stlb St3a St3b St4a St4b St5a St5a St5b St6a St6a St6b
3000
UBC S57
Рис. 1. Результаты разделения методом электрофореза продуктов амплификации ДНК литовских изолятов Mycosphaerella graminicola (Septoria tritici) с произвольным ISSR-праймером UBC 857 M - маркер молекулярного веса 100-3000 п.н.; St1—St6 ДНК взята от соответствующих изолятов гриба; a - размножение гриба при нанесении спор на агар микробиологической петлей; b - размножение гриба нанесением спор в виде суспензии в полужидком агаре
Для выявления митохондриальной мутации резистентности к фунгицидам G143A нами была использована пара ПЦР-праймеров MgcytbF/R с последующим разрезанием ам-плифицированного фрагмента эндонуклеазой Fnu4Hl (Satl). Условия ПЦР-реакции, предложенные [34], в целом, оказались приемлемыми для использования в наших условиях, однако при амплификации ДНК некоторых генотипов наблюдалось появление неспецифических фрагментов, которые впоследствии могли помешать правильной интерпретации результатов рестрикции. Снижение в реакционной смеси концентрации MgCl2 с 2 до 1,8 мМ и повышение концентрации нативной ДНК с 10 до 50-60 нг позволило воспроизводимо получать один фрагмент размером 652 п.н.
После рестрикции амплифицированного фрагмента эндонуклеазой Fnu4Hl (Satl) наблюдается получение двух фрагментов молекулярным весом 442 и 210 п.н. у образцов, чувствительных к действию фунгицида, и трех
фрагментов весом 298 п.н., 210 п.н. и 144 п.н. у изолятов, несущих мутацию G143A. Несмотря на то, что по данным биотеста зарубежных коллег из Литвы среди предоставленных ими пяти изолятов присутствовали устойчивые к фунгициду генотипы, не было выявлено ни одного изолята с митохондриальной мутацией G143A (рисунок 2А). Причина этого явления, по нашему мнению, - высокая вариабельность базовой резистентности к стробилуринам изолятов M. graminicola, что неоднократно отмечалось в научной литературе [26, 27], и, вероятно, недостаточная эффективность использованного биотеста по этой причине.
Для повышения эффективности выявления мутационной изменчивости у грибов, приводящей к развитию резистентности к химическим средствам защиты растений, разработаны разные молекулярно-генетические методы, основанные на анализе не только мутации в митохондриальном гене, как в настоящем исследовании, но и ряда мутаций в ядерных
генах, являющихся мишенями для разных фунгицидов. Например, сообщалось об исследованиях нуклеотидной последовательности ядерного гена, контролирующего фермент диметилазу, в связи с развитием устойчивости к азолам (ОМЪ) у изолятов M graminicola [3537]. При проведении некоторых исследований можно использовать метод РТ-ПЦР (ПЦР в реальном времени) в случае наличия однону-клеотидных замен ^КР), что уже сообщалось и в отношении мониторинга мутации 0143А в
популяциях разных грибных патогенов по анализу ДНК аскоспор [14]. С помощью использованного нами метода ПЦР-ПДРФ выявления митохондриальной мутации 0143А развитие резистентности к фунгицидам у возбудителя септориоза оценивается также эффективно. Так, у изолятов белоруской популяции гриба данная мутация была идентифицирована неоднократно (рис. 2В). Причем, изоляты-носители мутации обнаружены на полях разных сельскохозяйственных предприятий.
* М 58 59 61 63 65 66 67 68
М 511 Э15 -__1000
.1000 ЬИЗА 500 0143 А С143А 0143А 0143 А
— 400 —
400 р Ц^НР1
М^уЙи'заА В
200 А
Рис. 2. Пример ПЦР-ПДРФ анализа, проведенного для изолятов Mycosphaerella graminicola, показывающий
наличие/отсутствие митохондриальной мутации G143А. А - изоляты, взятые из литовской популяции; В - изоляты, взятые из белорусской популяции. Мутация резистентности G143A определяется по наличию трех рестрикционных фрагментов ДНК: 298, 210
и 144 п.н. и присутствует у изолятов № 58, 61, 66, 67, 68. Отсутствие мутации характеризуется наличием двух фрагментов размером 442, 210 п.н. (изоляты № 59, 63, 65).
Развитие резистентности к фунгицидам стало обычным явлением после внедрения и широкого использования односайтовых фунгицидов: метилбензимидазолов (MBCs), азолов (рМЪ) и стробилуринов ^оЬ). Усовершенствованные методы мониторинга и детекции устойчивости предоставляют новую информацию о том, как популяции патогенов реагируют на отбор фунгицидами. Однако пока нет точного способа предсказать, когда или где устойчивость может появиться. Вместо этого акцент делается на задержке, насколько это возможно, появления устойчивости и управлении проблемой, если она возникает. Чувствительные диагностические анализы, которые определяют основные генетические изменения, ответственные за
устойчивость, могут обеспечить ранний прогноз потенциальных проблем и помогают оценить влияние различных антирезистентных стратегий на развитие устойчивости в полевых условиях. Разработка методов ПЦР-анализа в этом отношении весьма перспективна. Использование ПЦР позволяет не только обнаружить мутацию резистености, но и определить ее частоту в популяции патогена, что дает точную информацию о появлении и развитии устойчивости к фунгициду гораздо быстрее и более точно, чем это было возможно с использованием биоанализа. Молекулярные методы также являются ценными инструментами для оценки влияния различных технологий защиты растений и методов управления, направленных на недо-
пущение развития резистентности к фунгицидам. Хотя в краткосрочной перспективе подходы, основанные на применении ПЦР-анализа, не улучшат нашу способность предотвращать развитие устойчивости к химическим средствам защиты растений, они должны обеспечивать раннее предупреждение о возникающих
проблемах и давать выигрыш во времени для принятия соответствующего решения. В долгосрочной перспективе понимание молекулярной и генетической основы устойчивости приведет к лучшим и научно-обоснованным подходам к оценке и управлению проблемами в случае их возникновения.
Заключение
Впервые в Беларуси разработана и применена методика идентификации митохондриальной мутации, связанной с развитием устойчивости к стробилуринам у Mycosphaerella graminicola, возбудителя септориоза пшеницы, основанная на ПЦР-ПДРФ анализе. Предложены оптимальные условия для выделения и очистки ДНК, позволяющие провести ПЦР-анализ любого изолята гриба. Оптимизированы условия проведения ПЦР-ПДРФ анализа, что дало возможность оценить на наличие мутации G143A
коллекцию изолятов M. graminicola, предоставленную РУП «Институт защиты растений НАН Беларуси», и выявить резистентные к фунгициду генотипы фитопатогена. В дальнейшем этот метод может быть применен для мониторинга мутации устойчивости к стробилуринам в популяции возбудителя септориоза листьев пшеницы, что позволит оперативно реагировать на изменение фитопатогенной ситуации в стране и оптимизировать стратегию защиты посевов от болезни.
Список использованных источников
1. Gharbi, M.S. Breeding for resistance to Sep-toria tritici in durum wheat / M.S. Gharbi, M. De-ghais, A.F. Ben // Proc. of durum wheat conference. Zaragoza, Spain. - 2000. - P. 397-401.
2. Goodwin, S.B. Back to basics and beyond: increasing the level of resistance to Septoria tritici blotch in wheat / S.B. Goodwin // Australasian Plant Pathol. - 2007. - Vol. 36. - P. 532-538.
3. Mapping quantitative resistance to Septoria tritici blotch in spelt wheat / M.R. Simon [et al.] // Eur. J. Plant. Pathol. - 2010. -Vol. 128. - P. 317-324.
4. Zhan, J. The global genetic structure of the wheat pathogen Mycosphaerella graminicola is characterized by high nuclear diversity, low mito-chondrial diversity, regular recombination, and gene flow / J. Zhan , RE. Pettway , B.A. McDonald // Fungal Genet Biol. - 2003. - Vol. 38. - P. 286-297.
5. Eyal, Z. Integrated control of Septoria diseases of wheat / Z. Eyal // Plant Dis. - 1981. -Vol. 65. - P. 763-768.
6. Raman, H. Molecular Breeding for Septoria tritici Blotch Resistance in Wheat / H. Raman, A. Milgate // Cereal Research Communications. - 2012. - Vol. 40, № 4. - P. 451-466.
7. Буга, С.Ф. Теоретические и практические основы химической защиты зерновых культур от болезней в Беларуси / С.Ф. Буга. - Несвиж, 2013. - 239 с.
8. Godwin, J.R. Azoxystrobin: Implications of biological mode of action, pharmacokinetics and resistance management for spray programmes against Septoria diseases of wheat / J.R. Godwin, D.W. Bartlett, S.P. Heaney // Septoria on Cereals: a Study of Pathosystems; J.A. Lucas, P. Bowyer, H.M. Anderson eds. - CABI Publishing, Wallingford, UK. - 1999. - P. 299-315.
9. Jordan, V.W.L. Disease management in less-intensive, integrative wheat systems / V.W.L. Jordan, J.A. Hutcheon // Septoria on Cereals: A Study of Pathosystems / J.A. Lucas, P. Bowyer, H.M. Anderson eds. - CABI Publishing, Wallingford, UK. - 1999. - P. 263-272.
10. The strobilurin fungicides / D.W. Bartlett [et al.] // Pest Manag Sci. - 2002. - Vol. 58. -P. 649-662.
11. Following the dynamics of strobilurin resistance in Blumeria graminis f.sp tritici using quantitative allele-specific real-time PCR measurements with the fluorescent dye SYBR Green / B.A. Fraaije [et al.] // Plant Pathol. - 2002. -Vol. 51. - P. 45-54.
12. Sierotzki, H. Point mutation in cytochrome b gene conferring resistance to strobilurin fungicides in Erysiphe graminis f. sp tritici field isolates / H. Sierotzki, J. Wullschleger, U. Gisi // Pestic Biochem and Phys. - 2000a. - Vol. 68. -P. 107-112.
13. Mode of resistance to respiration inhibitors at the cytochrome bc1 enzyme complex of My-cosphaerella fijiensis field isolates / H. Sierotzki [et al.] // Pest Management Science. - 2000b. -Vol. 56. - P. 833-841.
14. Role of ascospores in further spread of QoI-resistant cytochrome b alleles (G143A) in field populations of Mycosphaerella graminicola / B.A. Fraaije [et al.] // Phytopathology. -2005. - Vol. 95. - P. 933-941.
15. Resistance development to Qol inhibitors in populations of Mycosphaerella graminicola in the UK / B.A. Fraaije [et al.] // Modern Fungicides and Antifungal Compounds IV; H.W. Dehne, U. Gisi, K.H. Kuck, P.E. Russell eds. - BCPC, Alton, UK. - 2005a. - P. 63-71.
16. Dynamics of Mycosphaerella graminicola populations in response to selection by different fungicides / U. Gisi [et al.] // Modern Fungicides and Antifungal Compounds IV; H.W. Dehne, U. Gisi, K.H. Kuck, P.E. Russell eds. - BCPC, Alton, UK. - 2005. - P. 73-80.
17. Sensitivity of Cyp51 genotypes to DMI fungicides in Mycosphaerella graminicola / C. Chassot [et al.] // Modern Fungicides and Antifungal Compounds V; H.W. Dehne, U. Gisi, K.H. Kuck, P.E. Russell eds. - DPG Seeb-sterverlag, Braunschweig, Germany. - 2008. -P. 129-136.
18. Field strategies to manage fungicide resistance in Mycosphaerella graminicola, the causal agent of wheat leaf blotch / P. Leroux [et al.] // Modern Fungicides and Antifungal Compounds V; H.W. Dehne, U. Gisi, K.H. Kuck, P.E. Russell eds. - DPG Seebsterverlag, Braunschweig, Germany. - 2008. - P. 143-149.
19. Birch, C.P.D. When can reduced doses and pesticide mixtures delay the build-up of pesticide resistance? A mathematical model / C.P.D. Birch, M.W. Shaw // J. Appl. Ecol. - 1997. - Vol. 34. -P. 1032-1042.
20. Shaw, M.W. Models of the effects of dose heterogeneity and escape on selection pressure for pesticide resistance / M.W. Shaw // Phytopathology. - 2000. - Vol. 90. - P. 333-339.
21. Wiggins, T.E. Mode of action of the new methoxyacrylate antifungal agent ICIA5504 / T.E. Wiggins, B.J. Jager // Biochemical Society Transactions. - 1994. - Vol. 22. - P. 68.
22. Field resistance to strobilurin (Qol) fungicides in Pyricularia grisea caused by muta-
tions in the mitochondrial cytochrome b gene / Y.S. Kim [et al.] // Phytopathology. - Vol. 2003, № 93. - P. 891-900.
23. Mechanisms influencing the evolution of resistance to Qo inhibitor fungicides / U. Gisi [et al.] // Pest. Manag. Sci. - 2002. - Vol. 58. -P. 859-867.
24. Paveley, N.D. Decision support to rationalise wheat fungicide use / N.D. Paveley // Brighton Crop Protection Conference on Pests and Disease. - 1994. - P. 679-686.
25. Determinants of fungicide spray decisions for wheat / N.D. Paveley [et al.] // Pesticide Science. - 1997. - Vol. 49. - P. 379-388.
26. Intraspecific comparison and annotation of two complete mitochondrial genome sequences from the plant pathogenic fungus Mycosphaerella graminicola / S.F.F. Torriani [et al.] // Fungal Genet Biol. - 2008a. - Vol. 45. - P. 628-637.
27. Torriani, S.F.F. Qol resistance evolution in European populations of M. graminicola / S.F.F. Torriani // Mitochondrial genomes of plant pathogenic fungi. Diss., Eidgenössische Technische Hochschule ETH Zürich. - № 18123. -2008b. - P. 123-142.
28. Chen, R.S. Sexual reproduction plays a major role in the genetic structure of populations of the fungus Mycosphaerella graminicola / R.S. Chen, B.A. McDonald // Genetics. - 1996. - Vol. 142. - P. 1119-1127.
29. McDonald, B.A. DNA restriction fragment length polymorphisms among Mycosphaerella graminicola (an amorph Septoria tritici) isolates collected from a single wheat field / B.A. McDonald, J.P. Martinez // Phytopathol. - 1990a. -Vol. 80. - P. 1368-1373.
30. McDonald, B.A. Restriction fragment length polymorphisms in Septoria tritici occur at a high frequency / B.A. McDonald, J.P. Martinez // Current Genetics. - 1990b. - Vol. 17. -P. 133-138.
31. Genotypic diversity of the wheat leaf blotch pathogen Mycosphaerella graminicola (an amorph) Septoria tritici in Germany / F. Schnieder [et al.] // Eur. J. Plant Pathol. -2001. - Vol. 107. - P. 285-290.
32. Local adaptation and effect of host genotype on the evolution of pathogens: an experimental test in a plant pathosystem / J. Zhan [et al.] // J. Evol. Biol. - 2002. - Vol. 15. -P. 634-647.
33. Strobilurin fungicides cannot prevent sex and cause preferential mating in the wheat sep-toria tritici blotch pathogen Mycosphaerella graminicola / S.B. Ware [et al.] // Ware, S.B. Aspects of Sexual Reproduction in Mycosphaerella Species on Wheat and Barely: Genetic tudies on Specificity, Mapping, and Fungicide Resistance / PhD thesis. Wageningen. - 2006. - Р. 101-122.
34. Qol resistance emerged independently at least 4 times in European populations of Mycosphaerella graminicola / S.F.F. Torriani [et al.] // Pest Manag Sci. - 2009. - Vol. 65. - P. 155-162.
35. Polley, R.W. Surveys of diseases of winter-wheat in England and Wales, 1976-1988 /
R.W. Polley , M R. Thomas // Ann Appl Biol. -1991.- Vol. 119. - P. 1-20.
36. Delye, C. A mutation in the 14 alpha-de-methylase gene of Uncinula necator that correlates with resistance to a sterol biosynthesis inhibitor / C. Delye , F. Laigret , M.F. Corio-Costet // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63. -P. 2966-2970.
37. Wyand, R.A. Sequence variation in the CYP51 gene of Blumeria graminis associated with resistance to sterol demethylase inhibiting fungicides / R.A. Wyand, J.K.M. Brown // Fungal Genet. Biol. - 2005. - Vol. 42. -P. 726-735.
Дата поступления статьи 3 мая 2014 г.
