CC BY
1BIOLOGICAL SCIENCES
Костюк Н.В.
доцент кафедры биологии ФГБОУ ВО «Тверской ГМУ» Минздрава России
Белякова М.Б.
старший преподаватель кафедры биохимии с курсом КЛД ФДПО ФГБОУ ВО
«Тверской ГМУ» Минздрава России Егорова Е.Н.
зав. кафедрой биохимии с курсом КЛД ФДПО ФГБОУ ВО «Тверской ГМУ» Минздрава России
Петрова М.Б.
зав. кафедрой, профессор кафедры биологии ФГБОУ ВО «Тверской ГМУ» Минздрава России
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИНЦИПОВ «ПОТОЛОЧНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ» ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПАРАКРИННЫХ ЭФФЕКТОВ ЗРЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ В СОВМЕСТНЫХ
КУЛЬТУРАХ
USING OF THE PRINCIPLES OF CEILING CULTIVATION FOR STUDYING OF PARACRINE EFFECTS OF MATURE ADIPOCYTES IN CO-CULTURES
Kostiuk N. V.
Associate Professor of the Department of Biology, Tver State Medical University, Russian Federation
Belyakovа M.B.
Lecturer of the Department of Biochemistry with the course of Clinical laboratory diagnostics,
Tver State Medical University, Russian Federation
Egorova E.N.
Associate Professor, Head of the Department of Biochemistry with the course of Clinical laboratory diagnostics, Tver State Medical University, Russian Federation
Petrovа M.B.
Professor, Head of the Department of Biology, Tver State Medical University, Russian Federation АННОТАЦИЯ
Предложен способ сокультивирования, сочетающий «потолочную» культуру зрелых адипоцитов и монослойную культуру адгезированных клеток. Эффективность способа продемонстрирована на примере совместного культивирования зрелых адипоцитов и дифференцирующихся в адипогенном направлении мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани. Способ может быть полезен для изучения долгосрочных эффектов паракринных взаимодействий, в том числе при тестировании фармакологических препаратов.
ABSTRACT
A method of co-cultivation combining the ceiling culture of mature adipocytes with a monolayer culture of adherent cells is proposed. The effectiveness of the method is demonstrated by the example of co-cultivation of mature adipocytes and induced for adipogenesis mesenchymal stromal cells of adipose tissue. The method can be useful for studying the long-term effects of paracrine interactions, including the testing of pharmacological agents.
Ключевые слова: сокультивирование, «потолочная» культура, зрелые адипоциты, паракринные взаимодействия in vitro.
Keywords: co-cultivation, ceiling culture, mature adipocytes, paracrine interactions in vitro.
Введение. Этиология и патогенез таких болезней цивилизации, как ожирение, метаболический синдром, сахарный диабет, липодистрофия, тесно связаны с функционированием клеток жировой ткани. Разработка эффективных методов профилактики и лечения этих болезней, а также поиск новых фармацевтических препаратов, регулирующих обменные процессы в жировой ткани, требуют глубокого понимания молекулярных механизмов взаимодействия адипоцитов с другими клетками и тканями организма. Наиболее информативными в данном ключе оказываются методы совместного культивирования (сокультивирования) изолированных клеток разных типов. При этом поддержание жировых клеток, как в гомогенной, так и в сме-
шанной культуре представляет определенные трудности. Зрелые адипоциты обладают низкой адгезией, поскольку сферическая форма затрудняет образование прочных контактов с поверхностью культурального пластика, а малая плотность триг-лицеридов способствует флотации клеток.
Известны различные варианты сокультивирования адипоцитов с другими клетками животных и человека. В самом простом случае клетки двух типов выращивают в смешанной монослойной культуре [9]. Метод подходит для изучения взаимного влияния клеток на процессы пролиферации, апоптоза, фагоцитоза, однако затрудняет оценку биохимических изменений в клетках определенного типа. ^ V. с соавторами предложили сочетать
монослойную культуру мышечных клеток и суспензионную культуру зрелых адипоцитов [12]. Подобный подход может быть оправдан только при кратковременных экспериментах, поскольку во взвешенном состоянии меняется метаболизм адипоцитов, снижается их жизнеспособность. Все большее распространение находит способ сокуль-тивирования адипоцитов с использованием полупроницаемых мембранных вкладышей (например, Transwell® системы). В подобной культуре мембрана пространственно разделяет клеточные популяции и одновременно служит субстратом для клеточной адгезии. Известны примеры размещения популяции зрелых адипоцитов как в нижней [3], так и в верхней камере [6] культурального сосуда. Очевидным недостатком обоих описанных вариантов является мало предсказуемое распределение адипоцитов в объеме культуральной камеры. Жировые клетки могут существовать в виде монослоя, находиться во взвешенном или флотировавшем состоянии. Отсюда неоднородность свойств адипоцитов, трудности с их отделением и количественным учетом.
В 1987 г. Sugihara H. с соавторами предложили способ «потолочного» культивирования (ceiling culture) адипоцитов [10], где выталкивающая сила Архимеда из фактора противодействующего адгезии клеток превращается в фактор способствующий ей. Жировые клетки помещают в матрас, доверху заполненный питательной средой. В течение нескольких дней флотирующие адипоциты самопроизвольно прикрепляются к «потолку» - верхней части культурального сосуда. Хотя «потолочное» культивирование позволяет длительно поддерживать в жизнеспособном состоянии популяцию адипоцитов с однотипной локализацией, для совместного культивирования нескольких типов клеток данный подход никогда не применялся. Неразборная конструкция матраса затрудняет одновременные манипуляции с клеточными популяциями, занимающими разные части сосуда. Использование этого способа ограничивают также необходимость предварительного создания адгезивного слоя на второй стороне культурального сосуда, большой расход питательных сред и клеточного материала.
В связи с вышесказанным целью данной работы ставилась адаптация способа «потолочного» культивирования для изучения паракринных эффектов адипоцитов в совместных культурах.
Материалы и методы. Биологический материал получали от белых беспородных крыс весом 150-200 г. с соблюдением норм биоэтики. В работе использовали подкожный жир из бедренной области.
Выделение зрелых адипоцитов осуществляли по методике, описанной Hazen S.A. с соавторами [5] с некоторыми модификациями. Образцы ткани измельчали ножницами и инкубировали с раствором коллагеназы I типа (200 ед./мл) в среде Игла в модификации Дульбеко (DMEM, «Invitrogen», США) со стептомицином и пенициллином (500 ед./мл) при 37 0C в течение 60 минут при периодическом встряхивании. Адипоциты суспендировали
The scientific heritage No 13 (13),2017 в растворе. Непереваренные фрагменты ткани отделяли путем фильтрования через сито с размером ячеек 250 мкм. Клеточную взвесь центрифугировали 10 мин. со скоростью 1000 об./мин. Раствор фермента и осадок стромально-васкулярной фракции удаляли. Флотировавшие адипоциты ресуспен-дировали в растворе Хенкса и центрифугировали в тех же условиях. Процедуру отмывки повторяли трехкратно.
Для получения флотировавшего монослоя адипоциты вносили в ячейки 24-луночного планшета в количестве 104. Ячейки доверху заполняли питательной средой DMEM с антибиотиком (100 ед./мл) и 10% фетальной телячьей сывороткой (FBS, «Gibco», США). Поверх каждой ячейки размещали покровное стекло размером 17х17 мм, избегая образования пузырьков воздуха. Планшет накрывали крышкой и инкубировали при 37 0С в атмосфере 5% СО2. Спустя двое суток, когда всплывшие адипоциты прикреплялись к поверхности покровных стекол, их использовали для исследований.
Выделение МСК производили из жировой ткани крыс по методу Zuk P.A. et. al. [14] в модификации, описанной ранее [15]. Жировую ткань дезинтегрировали с помощью коллагеназы I. После инактивации фермента эквивалентным объемом среды DMEM, содержащей 10% FBS, клетки осаждали центрифугированием. Осадок отбирали, ре-суспендировали, удаляли эритроциты путем гемолиза, повторно осаждали и пропускали через нейлоновое сито 100 мкм. Клетки культивировали в чашках Петри в среде DMEM с антибиотиком и 10% FBS в стандартных условиях. На следующий день для удаления неприкрепившихся клеток питательную среду заменяли свежей. В дальнейшем смену среды проводили каждые 2-3 сут. При достижении субконфлюентного состояния клетки снимали трипсином-ЭДТА и пересевали в новые чашки.
Индукцию адипогенной дифференцировки проводили по методу, описанному Hauner H. с соавторами [4]. МСК третьего пассажа выращивали в 24-луночном планшете до достижения 80 % кон-флюэнтности. В ячейки вносили 1000-кратный индуцирующий коктейль (1 мкл на мл среды), создающий конечные концентрации инсулина (5 мкг/мл), дексаметазона (1 мкмоль/л), изобутилме-тилксантина (500 мкмоль/л). Через двое суток индуцирующую среду заменяли питательной средой, содержащей инсулин (5 мкг/мл). Спустя семь дней, когда в индуцированных клетках обозначились первые липидные капли, МСК использовали для сокультивирования со зрелыми адипоцитами.
Сокультивирование зрелых адипоцитов и индуцированных МСК. Покровные стекла с прикрепившимися адипоцитами с сохранением ориентации клеточного монослоя размещали поверх ячеек с индуцированными или неиндуцированными МСК. Замену питательной среды на аналогичную (DMEM+инсулин или DMEM соответственно) осуществляли каждые 2-3 дня. Совместные культуры
инкубировали в стандартных условиях в течение 5 дней.
Морфологические исследования. Прижизненную оценку состояния клеточных популяций проводили визуально с использованием микроскопов с прямой (Биолам, ЛОМО) и инвертированной (Мик-ромед-И) оптическими схемами. Фотографии клеток были получены с помощью камеры Canon EOS 1100D. Снимки анализировали с привлечением программы ToupView. Жизнеспособность клеток оценивали окрашиванием трипановым синим с последующим подсчетом клеток с помощью автоматического счетчика TC20TM Automated Cell Counter, BioRad. Морфологию клеток изучали после окраски по Романовскому-Гимза, наличие жировых капель доказывали окраской липофильным красителем Oil Red O (ORO).
Количественная оценка накопления липидов. О запасах жира в адипоцитах судили по количеству поглощенного липофильного красителя Oil Red O. Краситель экстрагировали с влажных препаратов растворами изопропанола возрастающей концентрации (от 60% до 100 %). Экстракты колориметри-ровали при длине волны 540 нм. Результаты представляли в относительных единицах. Для популяции клеток, выращенных на дне сосуда, за единицу принимали оптическую плотность экстракта ORO c
монокультуры неиндуцированных МСК. Для популяции клеток, выращенных на покровной пластине, за единицу принимали оптическую плотность экстракта ORO c монокультуры адипоцитов, поддерживаемых в среде DMEM.
Статистическая обработка результатов. Исследование проведено в 6 повторах. Для каждой группы рассчитывали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего. Достоверность различий между группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.
Результаты собственных исследований.
Характеристика монослоя флотировавших адипоцитов. Выделенные из жировой ткани зрелые адипоциты вносили в ячейки 24-луночного планшета, доверху заполняли питательной средой и накрывали покровным стеклом. Спустя сутки подсчитывали количество седиментировавших и флотировавших адипоцитов. Характер распределения зависел от технологии введения клеточной суспензии (рис. 1). При внесении клеточной суспензии на дно ячейки (вариант 1) соотношение осевших и всплывших адипоцитов было близко 1:2. При наслаивании клеточной суспензии поверх питательной среды, заполняющей не менее половины объема ячейки (вариант 2), всплывало около 90 % зрелых адипоцитов.
и о н о ч
и «
А
100
80
60
40
20
Вариант 1
Вариант 2
Рис. 1. Распределение зрелых адипоцитов в объеме кулътуралъной ячейки. Светлые столбцы - осевшие адипоциты, темные столбцы - всплывшие адипоциты.
0
Для оценки прочности прикрепления клеток стеклянную пластину с монослоем адипоцитов переносили в новую ячейку, доверху заполоненную питательной средой. Спустя сутки на дне ячейки фиксировались одиночные жировые клетки, их число не превышало 50 на лунку. При повторных процедурах переноса число открепившихся клеток не увеличивалось.
Зрелые адипоциты были идентифицированы по накоплению красителя Oil Red O. Популяция всплывающих адипоцитов по существу являлась
однородной, т.к. загрязнение другими типами клеток не превышало 5 %. В ходе культивирования изменений типичной морфологии зрелых адипоцитов отмечено не было.
Жизнеспособность свежеизолированных адипоцитов, определенная с помощью трипанового синего, составляла 90-95 % и на протяжении 5 дней культивирования не менялась.
Влияние зрелых адипоцитов на накопление липидов индуцированными МСК. Мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани выращивали на дне ячеек 24-луночного планшета до достижения
конфлюэнтности. Клетки индуцировали к адипо-генной дифференцировке добавлением смеси инсулина, дексаметазона и изобутилметилксантина. Спустя 2 суток культуру переводили на среду БМБМ+инсулин. Через неделю, когда появились признаки липогенеза, переходили к совместному культивированию со зрелыми адипоцитами. Контролем служили монокультуры МСК и адипоцитов, поддерживаемые в среде БМБМ с добавлением или без добавления инсулина.
В ходе совместного культивирования, количество запасенных липидов, как в индуцированных, так и в неиндуцированных МСК, увеличивалось более чем в 10 раз по сравнению с исходным уровнем (рис. 2А). Влияние зрелых адипоцитов на процесс накопления липидов неиндуцироваными МСК
было сопоставимо с действием индуцирующего коктейля в монокультуре мезинхимальных стро-мальных клеток. Однако морфологически две популяции существенно отличались (рис. 3). В монокультуре клетки содержали по несколько крупных жировых включений. Для совместной культуры, напротив, характерны множественные мелкие ли-пидные капли.
Запас липидов в монослое зрелых адипоцитов, прежде всего, зависел от присутствия в питательной среде инсулина (рис. 2Б). Под действием этого гормона количество липидов в клетках возрастало и одновременно сокращалось число адипоцитов малого диаметра. Присутствие МСК в совместной культуре не оказывало значимого влияния на накопление липидов зрелыми адипоцитами.
<и
ad н о
о"
О
о и н о <и X S К о
50 -|
40 -
30 -
20 -
10 -
A
Адипоциты
МСК
Адипоциты+МСК
Б
Адипоциты
МСК
Адипоциты+МСК
Рис. 2. Накопление липидов в ходе 5-ти дневного сокультивирования: А - на дне ячейки; Б - на покровной
пластине. Светлые столбцы - питательная среда БМЕМ; темные столбцы - питательная среда БМЕМ+инсулин; пунктирная линия - количество липидов в 1-ый день сокультивирования, среда БМЕМ; сплошная линия - количество липидов в 1-ый день сокультивирования, среда БМЕМ+инсулин. * - достоверно по сравнению с соответствующей монокультурой МСК при р<0,05.
*
0
Рис. 3. Липогенез в популяции индуцированныхМСК (14 дней от момента индукции, окраска ORO). А - неиндуцированные МСК; Б - неиндуцированные МСК+адипоциты; В - индуцированные МСК;
Г - индуцированные МСК+адипоциты.
Обсуждение результатов. Совместное культивирование животных клеток - прием, широко используемый в биологии и фундаментальной биомедицине для изучения взаимного влияния клеток друг на друга, в том числе относящихся к разным органам и тканям. Сокультивирование также лежит в основе создания «искусственных» тканей. При всем многообразии существующих способов со-культивирования, в работе со зрелыми адипоци-тами обнаруживается их общий недостаток - популяции жировых клеток оказываются неоднородными по своей локализации. Наряду с адгезированными присутствуют взвешенные и флотировавшие адипоциты. Это сказывается на продолжительности жизни и особенностях метаболизма клеток, затрудняет наблюдение и количественный учет результатов.
Обойти трудности, связанные с самопроизвольным отрывом адипоцитов от поверхности пластика, пытаются, заменяя жировые клетки индуцированными клетками-предшественниками. Для этих целей используют МСК, первичные и линейные преадипоциты [2, 9, 13]. Неудобства работы с клетками-предшественниками связаны не только с продолжительностью подготовительного этапа эксперимента - процесс дифференцировки занимает 23 недели. Популяция оказывается гетерогенной, т.к. содержит дифференцированные и недифференци-
рованные клетки. Кроме того морфо-функциональ-ные характеристики дифференцированных in vitro клеток далеки от типичных зрелых адипоцитов, заполненных единственной жировой каплей. Еще один способ ограничения самопроизвольного отрыва адгезированных адипоцитов - заключение жировых клеток в состав полимерного геля. Популяция клеток второго типа располагается поверх геля с адипоцитами в виде суспензии [8] или монослоя [1] либо может быть включена в состав другого геля [7]. При этом не ясно, в какой мере гель ограничивает диффузию медиаторов паракринных взаимодействий, что затрудняет интерпретацию результатов.
Предлагаемый нами способ сокультивирова-ния позволяет иначе решить проблему неоднотипной локализации зрелых адипоцитов. В основу положен известный принцип «потолочного» культивирования [10]. Сосуд для сокультивирования представляет собой ячейку многолуночного планшета, доверху заполненный питательной средой и накрытый покровным стеклом. В сосуде последовательно формируется два клеточных монослоя: традиционный монослой адгезированных клеток на дне и монослой флотировавших адипоцитов на «потолке». Для формирования монослоя адипоцитов достаточно поместить клеточную суспензию в ячейку планшета, доверху заполненную питательной средой. Под действием выталкивающей силы
адипоциты занимают положение в верхней части сосуда и прикрепляются к поверхности с подходящими адгезивными свойствами. В этих условиях нежировые клетки опускаются на дно сосуда, что обеспечивает дополнительную очистку популяции адипоцитов. В наших экспериментах загрязнение монослоя флотировавших адипоцитов другими типами клеток не превышало 5 %. По данным Tholpady S.S. et all. при 2-3 кратном повторении цикла открепления-флотации можно добиться практически 100 % чистоты популяции [11]. Монослой флотировавших адипоцитов обладает достаточной адгезией, чтобы выдержать манипуляции в ходе сокультивирования. При переносе покровной пластины с прикрепленными к ней адипоцитами в новую ячейку количество жировых клеток на дне не превышает 50 штук. Таким образом связанное с откреплением адипоцитов загрязнение дна ячейки не может служить источником серьезной погрешности.
В качестве иллюстрации применимости предлагаемого подхода для изучения паракринных эффектов мы оценивали влияние зрелых адипоцитов на адипогенную дифференцировку МСК. К совместному культивированию переходили лишь после того, как в индуцированных МСК появлялись первые липидные капли. Тем самым удавалось вычленять межклеточные взаимодействия на поздних этапах дифференцировки. Полученные результаты свидетельствуют о стимуляции липогенеза в новых жировых клетках в присутствии зрелых адипоци-тов.
Заключение. Комбинирование «потолочной» культуры адипоцитов с типичными монослойными культурами открывает широкие возможности моделирования внутритканевых и межтканевых взаимодействий. «Потолочное» культивирование адипо-цитов позволяет получать популяцию клеток с однотипной локализацией. Конструкция сосуда для сокультивирования поддерживает свободный обмен молекулами любого размера между клеточными популяциями. При этом сохраняется возможность контроля диффузии метаболитов за счет дополнительных полупроницаемых вкладышей. Полагаем, что предлагаемый способ может быть полезен для изучения долгосрочных эффектов па-ракринных взаимодействий, в том числе при тестировании фармакологических препаратов.
Список литературы
1. Amemori S., Ootani A., Aoki S. et. al. Adipocytes and preadipocytes promote the proliferation of colon cancer cells in vitro // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007. V. 292. N. 3. P. 923-929.
2. Cai L., Wang Z., Ji A. et. al. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity // PLoS One. 2012. V. 7. N. 5. doi: 10.1371/jour-nal.pone.0036785.
3. Dirat B., Bochet L., Dabek M. et. al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion // Cancer Research. 2011. V. 71. N. 7. P. 2455-2465.
4. Hauner H., Wabitsch M., Pfeiffer E.F. Differentiation of adipocyte precursor cells from obese and nonobese adult women and from different adipose tissue sites // Horm Metab Res Suppl. 1988. V. 19. P. 3539.
5. Hazen S.A., Rowe W.A., Lynch C.J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. // Journal of Lipid Research. 1995. V. 36. P. 868-875.
6. Janke J., Engeli S., Gorzelniak K. et. al. Mature adipocytes inhibit in vitro differentiation of human preadipocytes via angiotensin type 1 receptors // Diabetes. 2002. V. 51. N. 6. P. 1699-1707.
7. Pellegrinelli V., Rouault C., Rodriguez-Cuenca S. et. al. Human adipocytes induce inflammation and atrophy in muscle cells during obesity //Diabetes. 2015. V. 64. N. 9. P. 3121-3134.
8. Pellegrinelli V., Rouault C., Veyrie N. et. al. Endothelial cells from visceral adipose tissue disrupt adipocyte functions in a three-dimensional setting: Partial rescue by angiopoietin-1 // Diabetes. 2014. V. 63. N. 2. P. 535-549.
9. Santander A.M., Lopez-Ocejo O., Casas O. et. al. Paracrine interactions between adipocytes and tumor cells recruit and modify macrophages to the mammary tumor microenvironment: The role of obesity and inflammation in breast adipose tissue // Cancers (Basel). 2015. V. 7. N. 1. P. 143-178.
10. Sugihara H., Yonemitsu N., Miyabara S. et. al. Proliferation of unilocular fat cells in the primary culture // Journal of Lipid Research. 1987. V. 28. N. 9. P. 1038-1045.
11. Tholpady S.S., Aojanepong C., Llull R. et all. The cellular plasticity of human adipocytes // Ann Plast Surg. 2005. V. 54. N. 6. P. 651-656.
12. Vu V., Kim W., Fang X., et. al. Coculture with primary visceral rat adipocytes from control but not streptozotocin-induced diabetic animals increases glucose uptake in rat skeletal muscle cells: Role of adi-ponectin // Endocrinology. 2007. V. 148. P. 44114419.
13. Xie L., Ortega M.T., Mora S. et. al. Interactive changes between macrophages and adipocytes // Clin Vaccine Immunol. 2010. V. 17. N. 4. P. 651-659.
14. Zuk P. A., Zhu M., Ashjian P. et all. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Molecular Biology of the Cell. 2002. V. 13. P. 42794295.
15. Костюк Н.В., Белякова М.Б., Черноруцкий М.В. и др. Морфологические особенности популяций мезенхимальных стромальных клеток человека в зависимости от свойств культурального пластика // Современные проблемы науки и образования. 2016. № 2. URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24170 (дата обращения: 01.06.2017).
