CC BY
5
В нашей работе использовались МСК, полученные от контрольной группы (возраст не более 65 лет) и пожилых доноров (возраст старше 65 лет). Кроме того, нами использовались МСК, индуцированные к накоплению старческих признаков за счет продолжительного культивирования (более 10 пассажей: группа репликативное старение).
Индукцию адипогенной дифференцировки осуществлялась при помощи дексаметазона, инсулина и IBMX. Для оценки эффективности дифференцировки клеток использовали цитофлуоресцентное окрашивание с помощью красителя Nile Red. Кроме того, дифференци-ровка оценивалась методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией по экспрессии ключевых маркеров дифференцировки [2]. Для оценки активности инсулин-зависимых внутриклеточных сигнальных каскадов использовался метод иммуноблоттинга. Изучение про-лиферативного потенциала осуществлялась, используя иммуногистохимическое окрашивание на белок Ki67. Для анализа кальциевого ответа на инсулин использовался флуоресцентный кальциевый краситель Fluo-8.
В нашей работе мы обнаружили, что у многих пожилых доноров наблюдается снижение чувствительности к инсулину, коррелирующее со сниженной способностью к пролиферации и адипогенной дифференцировке. При оценке внутриклетоного кальция в ответ на инсулин наблюдались 2 вида кальциевых ответов: плавный прирост, характерный для клеток, полученных от контрольной группы, и кальциевая осцилляция, характерная для пожилых доноров. Интересно, что МСК, полученные от пожилых доноров, обладали высокой степенью гетерогенности с точки зрения их пролиферативного и дифференциро-вочного потенциалов, а также чувствительности к инсулину. В дальнейшем мы планируем установить причины подобной гетерогенности.
Литература:
1. Sorokina A.G. и др. Cardiovascular Therapy and Prevention.
2022. № 8 (20). C. 3051.
2. Kulebyakin K. и др. Frontiers in Cell and Developmental Biology.
2021. (9).
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПАНТОВ МАРАЛА В КОМБИНАЦИИ С АМИКАЦИНОМ ДЛЯ КУПИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ОСТЕОМИЕЛИТА
В.О. Золотухин, А.А. Андреев, А.А. Глухов, В.В. Шишкина
Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко Минздрава России, Воронеж, Россия
e-mail: Vladimir.zolotuxin@gmail.com
Ключевые слова: хирургия, остеомиелит, панты марала, хирургическая санация.
Остеомиелит — наиболее сложный вариант развития воспаления костной ткани, которое диагностируется в 3-24% после открытых переломов и в 1-7% после остеосинтеза [1]. Рецидивы заболевания встречаются у 20-30% больных, а частота ампутаций и функциональной неполноценности достигает 10,3-56,8% случаев [1, 2].
Целью данного исследования являлось изучение эффективности применения пантов марала и амикацина в купировании хронического остеомиелита.
Исследование проведено на самцах крыс линии Wistar с массой 300 ± 20 граммов на базе НИИ ЭБМ ВГМУ им Н.Н. Бурденко. Моделирование хронического остеомиелита проводили согласно патенту: «способ моделирования хронического травматического остеомиелита». Животные были разделены на 5 групп: В 1-й контрольной группе лечение не проводилось. В остальных группах выполняли 2-этапную гидрохирургическую санацию (ГХС). В 1-й опытной группе ГХС и внесение в область раны пантов марала до полного заполнения полости. Во 2-й опытной группе — введение антибиотика амикацина в дозировке 15 мг/кг. В 3-й опытной группе использовали сочетанное применение пантов марала и амикацина в дозировке 1:2. Оценку эффективности проводили на 7-е, 14-е, 28-е, и 90-е сутки исследования на основании данных гистологического исследования.
В 1 -й контрольной группе на протяжении всего эксперимента прослеживается гистологическая картина воспаления. Во 2-й контрольной группе начиная с 14-х суток эксперимента наблюдается пролиферации остеобластов. На 90-е сутки эксперимента наблюдается образование новых сосудов, появление грануляционной ткани в области дефекта и остеогенез в периосте и костномозговом канале.
В 1-й опытной группе динамика аналогична динамике 1-й контрольной группы, на 90-е сутки происходит формирование ложных суставов в месте патологического перелома с большим количеством остеобластов и ней-трофилов. Во 2-й опытной группе к 60-м суткам наблюдается полное заполнение дефекта молодой костной тканью. На 90-е сутки происходит формирование консолидированной костной мозоли. В 3-й опытной группе разрастание грануляционной ткани наблюдается уже на 1 4-е сутки вместе с признаками эндостального окостенения. На 90-е сутки полностью завершается регенерация костной ткани.
Использование комбинированного препарата, состоящего из амикацина (в дозировке 15 мг/кг) и порошкообразных пантов марала в соотношении 2:1, ведет к купированию очага остеомиелита и формированию костной мозоли на 90-е сутки исследования.
Литература:
1. Золотухин В.О. Научное обозрение. Педагогические науки.
2019. № 5-3. С. 60-64.
2. Золотухин В.О., Глухов А.А., Андреев А.А. Гены и Клетки. —
2019. — Т. 14, № S. — С. 97-98.
ПОИСК ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МИТОХОНДРИЙ В ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛАХ, ПРОИЗВОДНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Д.Б. Зоров1 2, Л.Д. Зорова1 2, С.И. Ковальчук3, В.А. Попков1' 2, В.П. Черников4, А.А. Жарикова5, А.А. Хуторненко2, С.Д. Зоров1' 5, К.С. Плохих6, Р.А. Зиновкин1, Е.А. Евтушенко7, В.А. Бабенко1, 2, И.Б. Певзнер1, 2, Ю.А. Шевцова2, 5, К.В. Горюнов2, Е.Ю. Плотников1, 2, Г.Т. Сухих2, Д.Н. Силачев1, 2
1 Институт физико-химической биологии
им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова, Москва, Россия
3 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва, Россия
4 НИИ Морфологии человека РАН, Москва, Россия,
5 Факультет Биоинженерии и Биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
6 НИЦ Курчатовский Институт, Москва, Россия
7 Биологический Факультет МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия,
e-mail: zorov@belozersky.msu.ru
Ключевые слова: митохондрии, терапия, стволовые клетки, экстраклеточные везикулы.
С недавнего времени наряду с клеточными технологиями возникло целое направление по субклеточным технологиям, которые, в частности, в терапии ряда патологий предполагают трансплантацию митохондрий и использование экстраклеточных везикул (ЭВ), производимых стволовыми клетками.
Есть свидетельства наличия митохондриальных компонентов в ЭВ, хотя данные о том, что ЭВ содержат компетентные в энергетическом плане митохондрии отсутствуют. Это определило задачу данной работы как решение вопроса: содержат ли ЭВ, образуемые в среде культивации мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека, функциональные митохондрии?
Просвечивающая электронная микроскопия позволила проследить за образованием ЭВ из МСК через почкование клеточной мембраны или путем организации пула ЭВ, собираемых внутри МСК. Были получены два препарата ЭВ через дифференциальное центрифугирование среды культивации в разных режимах, которые исследовались на предмет наличия митохондриальных компонентов и полностью функциональных митохондрий. ЭВ в обоих препаратах характеризовались сильной гетерогенностью форм, подтвержденной как просвечивающей, так и крио электронной микроскопией, и размеров, определяемых по дзета потенциалу и через анализ траекторий наночастиц.
Проточная флуориметрия с использованием двух митохондриальных красителей (MitoTracker Green, окрашивающих все митохондрии и TMRE, окрашивающих лишь энергизованные митохондрии) не позволила выявить однозначно интерпретируемый митохондриальный сигнал. Использование того же метода с применением 10-нонил акридинового оранжевого привело к доказательству его взаимодействия с ЭВ, что позволило предположить наличие кардиолипина, являющегося маркерным липидом внутренних мембран митохондрий.
С использованием праймеров на компоненты мито-хондриальной и ядерной ДНК (мДНК и яДНК соответственно) удалось не только обнаружить эти виды, нои отметить обогащение мДНК в ЭВ: если в МСК принять соотношение мДНК/яДНК=1, то в ЭВ это соотношение было около 20. Вестерн блот анализ выявил наличие в ЭВ целого ряда митохондриальных белков, однако подвижность части этих пептидов при ЭФ в ПААГ отличалась от стандартного поведения.
Анализатор кислорода SeaHorse позволил зарегистрировать потребление кислорода ЭВ при использовании субстратов комплексов I-III дыхательной цепи митохондрий. Однако скорость этого потребления не менялась при добавлении как разобщителя (СССР), так и ингибиторов цитохромоксидазы (цианида и азида), что говорит о том, что это потребление кислорода нельзя однозначно приписать дыханию.
Масс-спектрометрия выявила целый ряд митохондри-альных белков внешних и внутренних мембран, межмембранного пространства и матрикса.
Таким образом в ЭВ присутствуют митохондриальные компоненты, а функциональных митохондрий обнаружить не удалось. Поддержано грантом РНФ № 19-14-00173п.
ВЛИЯНИЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА
4 НА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ
КЛЕТКИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ
Е.С. Зубкова1, А.П. Калинин1, И.Б. Белоглазова1,
М.Ю. Меньшиков1, Е.В. Парфёнова1, 2
1 ФГБУ НМИЦК им. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
2 ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: cat.zubkova@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки,
воспаление, митохондрии, интерлейкинз-4.
Использование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) является одним из ведущих методов клеточной терапии, обеспечивающим прочную связь между клиническими и фундаментальными исследованиями. Одним из популярных способов повышения эффективности клеточной терапии с помощью МСК является их обработка цитокинами. Мы выявили, что у МСК, инкубировавшихся в присутствии интерлейкина 4 (ИЛ4) повышается резервная респираторная емкость, в то время как МСК, инкубировавшиеся в присутствии провоспалительных ци-токинов показали тенденцию к ее снижению. Известно, что количество митохондрий тесно связано с энергетическими потребностями клетки и может варьироваться в зависимости от многих факторов, таких как стресс и окислительно-восстановительный баланс. Мы оценили количество митохондрий на клетку с помощью окрашивания витальным флуоресцентным митохондриальным зондом — MitoTracker Red CMXRos и последующего анализа методами спектрофлуориметрии и обнаружили увеличение количества митохондрий на клетку в МСК, инкубировавшихся в присутствии ИЛ4 и тенденцию к уменьшению их числа в мСк, инкубировавшиеся в присутствии провоспалительных цитокинов, что может быть обусловлено усилением в них экспрессии факторов, ассоциированных с митофагией. Одна из функций митофа-гии — это удаление поврежденных митохондрий и таким образом предотвращение накопления митохондриаль-ных реактивных форм кислорода (АФК) и повреждения клеток [1]. Мы оценили генерацию супероксид радикала,
