CC BY
79
ТЕХНОЛОГИЯ ХРАНЕНИЯ И ПЕРЕРАБОТКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРОДУКЦИИ
Известия ТСХА, выпуск 5, 2015 год
УДК 663.252.2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НОВЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ФРУКТОВЫХ ВИН
А.А. ВОЛЧОК1, А.М. РОЖКОВА1, И.Н. ЗОРОВ1, С.С. ЩЕРБАКОВ3, А.П. СИНИЦЫН12
(1 Институт биохимии им. А.Н. Баха; 2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; 3 РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева)
Проведено исследование воздействия новых мультиэнзимных композиций, применяемых при изготовлении фруктовых вин на стадии получения сусла, на качество готовой продукции. Изучаемые ферментные комплексы были ранее получены в ходе селекции и при помощи генной инженерии из микроскопического гриба РепШШит verruculosum, секретирующего эффективный комплекс целлюлоз.
Приведены основные характеристики мультиферментных комплексов, а также представлены характеристики полученных с их использованием фруктовых вин, что дает возможность судить о потенциальных возможностях использования данных ферментных препаратов в промышленных масштабах. В ходе работы регистрировался выход сусла из мезги после ферментативной обработки и такие показатели, как относительная вязкость сусла, содержание в нем взвесей. В готовых винах определяли ряд физико-химических показателей и цветовые характеристики.
Полученные данные достоверно подтверждают эффективность использования новых мультиферментных комплексов в винодельческой промышленности.
Ключевые слова: ферментные препараты, ферментативная обработка, РетсИНит verruculosum, фруктовые вина, виноделие.
Технология изготовления фруктовых вин характерна своей специфичностью, связанной с применением сырья, различного по химическому составу и требующего разных условий и методов переработки. Производство вин этого типа часто бывает сопряжено с такими трудностями, как небольшой выход сусла из плодовой мезги, сложности прессования, замедленное осветление сусла, возникновение помутнений и изменение цветовых характеристик продукта [4].
На данный момент наиболее эффективным решением данных технологических проблем многими производителями признана ферментативная обработка сырья, предшествующая процессам прессования и фильтрации [7, 9]. В последние 5-10 лет на рынке вспомогательных материалов предлагается большое разнообразие ферментных препаратов, нацеленных на облегчение осветления сусла, стабилизацию вин против помутнений коллоидной природы, достижение гармоничного и разнообразного аромата готового продукта [1]. В связи с возрастающей потребностью производителей в ферментных комплексах, обладающих набором необходимых для достижения положительных результатов активностей в оптимальном соотноше-
123
нии, в лаборатории биотехнологии ферментов Института биохимии им. А.Н. Баха (ИНБИ РАН) непрерывно ведутся работы по получению новых ферментных препаратов. Исследования действия на различные плодовые субстраты ферментных комплексов, эффективно гидролизующих пектин и целлюлозосодержащее сырье, позволили получить данные о целесообразности их использования в винодельческом производстве.
В качестве объектов исследования выступали ферментные препараты BI 3-227.7 и BI 3-227.4, полученные на основе рекомбинантного штамма Penicillium Verruculosum и давшие наилучшие результаты по выходу сока из плодовой мезги, а также увеличению содержания в сусле восстанавливающих сахаров в ранее проводимых экспериментах [5].
Методика исследования
В качестве плодового и ягодного сырья использовали рябину сортовую, желтую сливу и садовую черную смородину. Все субстраты были получены и переданы для исследований работниками МСХА имени К.А. Тимирязева.
Исследуемые ферментные препараты были получены путем котрансформации целевыми плазмидами с генами пектин-лиазы Р canescens бета-глюкозида-
зы A. niger ^Ш) с трансформирующей плазмидой pSTA 10 ауксотрофного штамма-реципиента Р verruculosum 537. Процессы создания рекомбинантных штаммов и ферментных препаратов, их свойства, а также методы определения ферментативных активностей подробно описаны в работе [3]. Препараты представляли собой кремовый порошок (лиофилизат культуральной жидкости рекомбинантных штаммов плесневого гриба Р verruculosum), легко растворимый в воде. В таблице 1 приведены их основные характеристики.
Т а б л и ц а 1
Характеристики изучаемых мультиферментных комплексов*
Показатель Ферментный препарат
В1_3-227.4 В1_3-227.7
Концентрация белка, мг/г препарата 854 ± 39,77 503 ± 33,60
Целлюлазная (МКЦ) активность, ед/г препарата 3346 ± 388,84 3194 ± 310,6
Целлюлазная (КМЦ) активность, ед/г препарата 170 ± 19,92 174 ± 14,90
р-глюкозидазная активность, ед/г препарата 3999 ± 388,11 395 ± 25,49
Пектинлиазная активность, ед/г препарата 2694 ± 388,38 1164 ± 113,2
Киланазная активность, ед/г препарата 3490 ± 288,28 5310 ± 334,9
* МКЦ — микрокристаллическая целлюлоза; КМЦ — карбоксиметил-целлюлоза.
Образцы фруктовых вин получали в лабораторных условиях по технологическим схемам, представленным в таблице 2. При изготовлении вин использовали препараты, наиболее эффективно проявившие себя в предварительных испытаниях с точки зрения повышения выхода сусла из мезги [5].
124
Т а б л и ц а 2
Схемы изготовления фруктовых вин в лабораторных условиях
Рябина сортовая, сухой виноматериал Черная смородина, слива, сладкие некрепленые виноматериалы
Технологическая схема без стадии ферментативной обработки мезги Технологическая схема, включающая в себя стадию ферментативной обработки мезги Технологическая схема без стадии ферментативной обработки мезги Технологическая схема, включающая в себя стадию ферментативной обработки мезги
1. Мойка сырья, сортировка 1. Мойка сырья, сортировка
2. Дробление, внесение в мезгу воды с таким расчетом, чтобы концентрация титруемых кислот в конечном продукте составляла 5 г/дм3 2. Дробление, внесение в мезгу воды с таким расчетом, чтобы концентрация титруемых кислот в конечном продукте составляла 6,8 г/дм3
3. Сульфитация мезги (К28205, «Мегахим», РФ) до 80 мг/дм3 3. Сульфитация мезги (К2Э205, «Мегахим», РФ) до 80 мг/дм3
4. Мацерация мезги в течение 24 ч при 25°С 4. Мацерация мезги в присутствии ферментного препарата В1 3-227.7 (0,03% от массы мезги) в течение 24 ч при 25°С 4. Мацерация мезги в течение 24 ч при 50°С (для сливы), при 25°С (для черной смородины) 4. Мацерация мезги в присутствии ферментного препарата В1 3-227.4 (0,03% от массы мезги) в течение 24 ч при 50°С (для сливы), при 25°С (для черной смородины)
5. Прессование мезги (лабораторный механический пресс вместимостью 1,5 дм3) 5. Прессование мезги (лабораторный механический пресс вместимостью 1,5 дм3)
6. Внесение в сусло сахара до 220 г/ дм3 (сахарный сироп 80%), сульфитация сусла до 120 мг/дм3 6. Внесение в сусло сахара до 220 г/дм3 (сахарный сироп 80%), сульфитация сусла до 120 мг/дм3
7. Осветление отстаиванием (24 ч), отделение осадка 7. Осветление отстаиванием (24 ч), отделение осадка
8. Сбраживание сусла до содержания в нем 15 г/ дм3 сахара при 20°С. Внесение винных дрожжей «France universal» (произв. Франция) 500 г/625 дм3, внесение в сусло 0,6 г/дм3 (NH4)H2PO4 (Sigma, USA) 8. Сбраживание сусла до содержания в нем 15 г/ дм3 сахара при 20°С. Внесение винных дрожжей «France universal» (произв. Франция) 500 г/625 дм3, внесение в сусло 0,6 г/дм3 (NH4)H2PO4 (Sigma, USA)
9. Дображивание в течение 15 сут. 9. Внесение сахара (сахарный сироп 80%) до концентрации 150 г/ дм3, дображивание в течение 30 сут.
10. Осветление отстаиванием (24 ч), отделение осадка 10. Осветление отстаиванием (24 ч), отделение осадка
11. Фильтрование виноматериала (если требуется), хранение в укупоренных стеклянных бутылках при 4°С 11. Фильтрование виноматериала (если требуется), хранение в укупоренных стеклянных бутылках при 4°С
125
Содержание взвесей в образцах сусла определяли гравиметрически, отделяя взвеси центрифугированием.
Содержание взвесей рассчитывали по формуле:
С = (m2 - m1) • 100/V,
где m2 — масса центрифужной пробирки с осадком взвесей, г; mj — масса пустой центрифужной пробирки, г; V — объем пробы, см3.
Для определения вязкости сусла образцы предварительно центрифугировали при 8000 об/мин. в течение 10 мин. Вискозиметр Оствальда термостатировали при 20°С, вносили 5 см3 анализируемого раствора и инкубировали 5 мин. Определяли время истечения раствора в двух повторностях.
Вязкость образцов сусла определяли, исходя из калибровочной кривой вискозиметра, построенной с использованием жидкостей с известной вязкостью.
Определение характеристик окраски вин проводилось спектрометрическим экспресс-методом по специальным формулам [6].
Физико-химические показатели образцов вин определяли в соответствии с государственными стандартами РФ [2]. Массовую концентрацию сахаров в виномате-риалах определяли методом Шомоди-Нельсона [8]. Используемые в экспериментах реактивы были марки х.ч. и ч.д.а «ДиаМ», «Реахим», Helicon (Россия), Panreac (Испания).
Результаты и их обсуждение
В таблице 3 представлены результаты замеров выхода из плодовой мезги самотечных и прессовых фракций сусла в процессе изготовления вин. Показан выход сусла в дм3 в пересчете на 1 т сырья. Стоит также заметить, что в ходе эксперимента использовалась мезга, разбавленная водой, по причине чрезмерной кислотности субстратов.
Т а б л и ц а 3
Выход сусла из мезги в ходе изготовления фруктовых вин
Субстрат Ферментный препарат Выход самотечных фракций сусла из 1 т мезги, дм3 Выход прессовых фракций сусла из 1 т мезги, дм3 Общий выход сусла из 1 т мезги, дм3
Рябина сортовая BI 3-227.7 358* 414 772,1
Без ф.п. 228,9 524,3 753,3
Слива BI 3-227.4 710,9 147,7 858,6
Без ф.п. 242,7 316,4 559
Черная смородина BI 3-227.4 618,2 242,7 860,9
Без ф.п. 545,5 275 820,5
* Здесь и далее доверительный интервал соответствует точности прибора: ±5 дм3 (0,005 дм3 ■ 1000, где 1000 — поправочный коэффициент при пересчете на 1 т мезги).
126
Как видим из таблицы, использование ферментных препаратов в технологии приготовления фруктовых вин заметно увеличило выход самотечных, наиболее ценных фракций сусла. Общий выход сусла также возрос, но этот показатель сглажен большим выходом прессовых фракций из образцов мезги, не обработанной ферментными препаратами.
В таблице 4 представлены результаты, полученные в результате измерения относительной вязкости сусла из различных видов сырья и количества в нем взвесей.
Т а б л и ц а 4
Физические свойства полученного плодового сусла
Ферментный препарат, используемый в процессе настаивания сусла на мезге Показатели самотечных фракций сусла Показатели прессовых фракций сусла
вязкость сусла, сПз массовая концентрация взвесей в сусле, г/100 см3 вязкость сусла, сПз массовая концентрация взвесей в сусле, г/100 см3
Рябина сортовая
В1 3-227.7 0,28 ± 0,021 1,03 ± 0,11 0,39 ± 0,031 2,03 ± 0,14
Без ф.п. 0,33 ± ,021 1,184 ± 0,12 0,46 ± 0,038 2,18 ± 0,15
Слива желтая
В1 3-227.4 0,74 ± 0,035 1,93 ± 0,12 1,06 ± 0,1 2,93 ± 0,17
Без ф.п. 0,79 ± 0,041 2,17 ± 0,13 1,11 ± 0,13 3,17 ± 0,16
Черная смородина
В1 3-227.4 0,31 ± 0,025 1,47 ± 0,12 0,43 ± 0,034 2,47 ± 0,19
Без ф.п. 0,38 ± 0,026 1,87 ± 0,13 0,53 ± 0,042 2,87 ± 0,15
Преимуществами ферментативной предобработки сырья относительно нефер-ментированных образцов стали более низкая вязкость, объяснимая меньшим содержанием в сусле биополимеров, а также снижение концентрации взвесей в ферментированном сусле.
Выбранный для обработки черной смородины и сливы ферментный препарат В1 3-227.4 характерен выраженными Р-глюкозидазной и пектин-лиазной активностями и позволяет добиться видимого разжижения богатых пектиновыми веществами субстратов (3-8% пектиновых веществ от массы сырого вещества) в короткий срок. Для ферментативной обработки рябины, содержащей комплекс целлюлозы и геми-целлюлоз, целесообразно использовать ферментный препарат В1 3-227.7, отличающийся набором соответствующих активностей, а также включающий в себя пектин-лиазу. Качественные характеристики полученных виноматериалов представлены в таблице 5.
По результатам физико-химической оценки образцов виноматериалов можно судить о целесообразности применения ферментных комплексов с точки зрения изменения качества получаемого продукта. Ферментированные вина обладают более
127
Т а б л и ц а 5
Физико-химические характеристики полученных фруктовых вин
Показатель Образцы фруктовых вин
сухое вино, рябина сортовая сладкое вино, слива желтая сладкое вино, черная смородина
В1 3-227.7 Без ф.п. В1 3-227.4 Без ф.п. В1 3-227.4 Без ф.п.
Объемная доля этилового спирта, % об. 12,70 ± 0,40 12,70 ± 0,30 13,53 ± 0,30 13,50 ± 0,55 14,44 ± 0,30 14,40 ± 0,40
Массовая концентрация приведенного экстракта, г/дм3 13,53 ± 1,03 13,53 ± 0,90 13,53 ± 0,80 13,57 ± 0,77 14,44 ± 0,69 14,45 ± 1,09
Массовая концентрация сахаров, г/дм3 0,38 ± 0,07 0,37 ± 0,06 100 ± 3,1 101 ± 3,5 100 ± 2,80 101,5 ± 3,09
Массовая концентрация титруемых кислот, г/дм3 5,33 ± 0,24 5,39 ± 0,29 6,63 ± 0,36 6,72 ± 0,29 7,80 ± 0,33 7,87 ± 0,36
Массовая концентрация летучих кислот в пересчете на уксусную кислоту, г/дм3 0,48 ± 0,013 0,55 ± 0,015 0,38 ± 0,012 0,43 ± 0,014 0,25 ± 0,010 0,34 ± 0,014
Общее содержание SO2, мг/дм3 100 ± 9,98 101,8 ± 9,50 113 ± 10,18 112,6 ± 9,67 116 ± 9,30 117 ± 11,50
Содержание свободного Э02, мг/дм3 44,2 ± 2,31 44,8 ± 2,66 67,8 ± 3,51 67,6 ± 3,20 69,6 ± 2,90 70,2 ± 2,88
Интенсив. цвета 1,967 ± 0,023 1,067 ± 0,025 0,179 ± 0,006 0,121 ± 0,003 6,283 ± 0,230 6,117 ± 0,220
Оттенок 0,83 ± 0,05 0,73 ± 0,05 2 ± 0,10 1,96 ± 0,09 0,93 ± 0,09 0,92 ± 0,09
насыщенным цветом; кроме того, в опытных образцах виноматериалов было зафиксировано незначительное снижение концентрации летучих кислот, предельное содержание которых в продукте строго регламентировано.
128
Увеличение интенсивности цвета образцов фруктовых вин, изготовленных по схемам, включающим в себя ферментативную обработку мезги, происходит благодаря мацерирующему эффекту мультиферментных комплексов.
Применение новых мультиферментных комплексов позволяет более полно раскрыть свойства, присущие различному плодовому и ягодному сырью. Образцы плодовых вин, полученных с помощью ферментных препаратов, обладали более ярким ароматом и полным насыщенным вкусом по сравнению с контрольными.
Выводы
В лабораторных условиях был изготовлен ряд образцов фруктовых вин, в технологию которых была включена стадия мацерации в присутствии новых ферментных препаратов, сочетающих в себе целлюлолитические, гемицеллюлолитические и пектинлиазную активности, соотношение которых определило их специфичность для используемого плодового сырья. В результате удалось увеличить выход продукта из плодовой мезги и получить легкоосветляемые вина с меньшим содержанием летучих кислот и повышенной интенсивностью окраски. В ферментированном сусле было зафиксировано меньшее содержание взвесей по сравнению с контрольными образцами (без фермента), опытные образцы сусла отличались меньшей вязкостью. Ферментативная обработка мезги позволила улучшить органолептические характеристики плодовых вин.
Полученные в ходе проведенной работы данные говорят об эффективности использования мультиферментных комплексов нового поколения в технологии фруктовых вин.
Библиографический список
1. Агеева Н.М., Маркосов В.А. Влияние ферментных препаратов на состав ароматобра-зующих компонентов в красных столовых винах // Журнал «Виноделие и Виноградарство». 2013. № 3. С. 19-22.
2. Ашапкин В.В. Контроль качества продукции физико-химическими методами. М.: ДеЛи принт. 2005. Т. 4. С. 85-95.
3. Бушина Е.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н. и др. Создание комплексных ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз для переработки свекловичного жома. // Журнал «Прикладная биохимия и микробиология». 2012. Т. 48. № 5. С. 543.
4. Волчок А.А., Бушина Е.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Щербаков С.С., Синицын А.П. Ферментные комплексы нового поколения для соковой промышленности // Журнал «Биотехнология». 2013. № 5. С. 78-89.
5. Волчок А.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Щербаков С.С., Синицын А.П., Бушина Е.В. Использование ферментных комплексов нового поколения для обработки различных плодово-ягодных субстратов // Журнал «Виноделие и Виноградарство». 2012. № 1. С. 20-21.
6. Мехузла Н.А. Сборник международных методов анализа и оценки вин и сусел. М.: «Пищевая промышленность», 1993. 319 с.
7. Liew Abdullah A.G., Sulaiman N.M., Aroua M.K., MegatMohdNoor M.J. Response surface optimization of conditions for clarification of carambola fruit juice using a commercial enzyme. Journal of Food Engineering. 2007. 81. Р. 65-71.
8. Nelson N.J. Biol. Chem. 1944. 153. Р. 375-379.
9. Ranveer Singh Jayani, Shivalika Saxena, Reena Gupta. Microbial pectinolytic enzymes: A review. Process Biochemistry. 2005. 40. Р. 2931-2944.
129
THE USE OF NEW MULTI-ENZYME COMPLEXES IN THE PRODUCTION OF FRUIT WINES
A.A. VOLCHOK1, A.M. ROZHKOVA1, I.N. ZOROV1, S.S. SHCHERBAKOV3, A.P. SINITSYN1-2
(1 A.N. Bach Institute of Biochemistry, RAS; 2 Lomonosov Moscow State University; 3 Russian Timiryazev State Agrarian University)
This work presents the study results on the impact of new multi-enzymatic preparations on the final product quality when they are used in the production of the wort for fruit wines. The studied enzymes were developed during selection and gene engineering from micro-fungus Penicillium verruculosum which secrets efficient cellulasic complex.
This article provides the main characteristics of multi-enzyme complexes and results of in-lab fruit-wine production with enzymatic agents use, which provides an opportunity for the use of the enzymes in the industrial-scale production. In the course of the experiment the yield of must, its relative viscosity and suspended particles content in fermented samples were registered. A number of physical and chemical parameters and color intensity characteristic of final beverage were recorded.
Obtained data clearly shows high efficiency of usage of new-generation enzymatic agents in fruit-wine industry.
Key words: enzyme preparations, enzymatic treatment, Penicillium verruculosum, fruit-wines, wine making.
Волчок Анастасия Александровна — асп., и. о. м. н. с. Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Института биохимии им. А.Н. Баха (119071, Москва, Ленинский проспект 33, стр. 2; тел.: (906) 783-17-44; е-таЛ: nanka-net@mail.ru).
Рожкова Александра Михайловна — к. х. н., ст. науч. сотр. Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Института биохимии им. А.Н. Баха (119071, Москва, Ленинский проспект 33, стр. 2; тел.: (910) 464-47-91; е-таП: amrojkova@yahoo.com).
Зоров Иван Никитич — к. х. н., ст. науч. сотр. Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Института биохимии им. А.Н. Баха (119071, Москва, Ленинский проспект 33, стр. 2; тел.: (903) 687-44-00; е-mail: inzorov@mail.ru).
Щербаков Сергей Сергеевич — д. т. н., проф. кафедры виноградарства и виноделия РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550, Москва, Тимирязевская 49; тел.: (910) 456-35-67; е^П: sov06@yandex.ru).
Синицын Аркадий Пантелеймонович — д. х. н., зав. лабораторией биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Института биохимии им. А.Н. Баха (119071, Москва, Ленинский проспект 33, стр. 2); зав. лабораторией физико-химии ферментативной трансформации полимеров химического факультета, МГУ имени М.В. Ломоносова (119991, Москва, Ленинские горы 1/3; тел.: (916) 611-48-57; е-mail: apsinitsyn@gmail.com).
130
Volchok Anastasiya Alexandrovna — PhD-student, the acting researcher, A.N. Bach Institute of Biochemistry, RAS (119071, Moscow, Leninskiy prospect 33/2b, tel.: +7 (906) 783-17-44; e-mail: nanka-net@mail.ru).
Rozhkova Aleksandra Mikhailovna — PhD in Chemical Sciences, leading researcher, A.N. Bach Institute of Biochemistry, RAS (119071, Moscow, Leninskiy prospect 33/2b, tel.: +7 (910) 464-47-91; e-mail: amrojkova@yahoo.com).
Zorov Ivan Nikitich — PhD in Chemical Sciences, leading researcher, A.N. Bach Institute of Biochemistry, RAS (119071, Moscow, Leninskiy prospect 33/2b, tel.: +7 (903) 687-44-00; e-mail: inzorov@mail.ru).
Shcherbakov Sergey Sergeevich — Doctor of Technical Sciences, Professor, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 49; tel.: +7 (910) 456-35-67; e-mail: sov06@yandex.ru).
Sinitsyn Arkadiy Panteleimonovich — Doctor of Chemical Sciences, Head of the Laboratory of Biotechnology, A.N. Bach Institute of Biochemistry, RAS (119071, Moscow, Leninskiy prospect 33/2b); Head of the Laboratory of Physics and Chemistry of Polymer Enzymic Transformation, The Faculty of Chemistry, Lomonosov Moscow State University (119991, Moscow, Leninskie Gory, 1/3; tel.: +7 (916) 611-48-57; e-mail: apsinitsyn@ gmail.com).
131
