CC BY
15УДК 633.63:575:632.52.577.1 doi.org/10.24412/2413-5518-2021-9-40-43
Использование молекулярных маркеров для отбора генотипов сахарной свёклы, устойчивых к гетеродерозу
Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук
Е.А. СЛЕПОКУРОВА, мл. научн. сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (е-mail: biotechnologiya@mail.ru)
Введение
Причиной огромных потерь урожая и ухудшения его качества могут стать вредители, болезни и абиотические факторы среды, поэтому изучение генетики устойчивости к ним генотипов сахарной свёклы имеет исключительное значение.
Корневая (галловая) нематода Meloidogyne ssp. вызывает в основном корневое угнетение. Галловые нематоды провоцируют гниение головок корнеплодов и образование корневых галлов на главных и придаточных корнях. Поскольку применение химических средств, убивающих растительных нематод, нема-тоцидов ограничено по соображениям, касающихся охраны окружающей среды, современные методы контроля над нематодами включают в себя ротацию культур с использованием, например, Raphanus Sativus var. oleiformis. Однако наиболее верная стратегия — это селекция устойчивых гибридов на генетической основе [1—3].
Установлено, что гены, обеспечивающие устойчивость к нематоде, отсутствуют у возделываемых гибридов сахарной свёклы. Устойчивость к галловой нематоде впервые была выявлена у морской свёклы (B. vulgaris ssp. maritima L.) и далее интрогрессирована в культурную сахарную свёклу (Beta vulgaris L.). Моногенную устойчивость к нематоде у сахарной свёклы удалось получить путём введения в сахарную свёклу генов от трёх диплоидных диких видов (B. procumbens, B. patellaris и B. webbiana). Сорта, несущие транслокацию, характеризовались потерями урожая и ухудшением его качества, поэтому предпринимались попытки изолировать гены устойчивости для переноса их в линии сахарной свёклы с высокой селекционной ценностью. Некоторые молекулярные маркеры, отобранные в транслокациях дикого вида B. procumbens,
являлись повторами, гибридизующимися исключительно с ДНК дикой свёклы, что делало их идеальными пробами для фингерпринтинга различных селекционных линий и отбора транслокационно-специфических клонов из геномных библиотек [4—7]. В связи с этим значительный интерес и актуальность представляет изучение гена устойчивости к гетероде-розу, его генетические вариации в различных генотипах сахарной свёклы.
Материалы и методы
Для проведения молекулярно-генетических экспериментов использовали зелёную массу двухнедельных проростков растений сахарной свёклы (МС-формы, сростноплодные опылители ОП, гибриды отечественной и иностранной селекции). Выделение геномной ДНК из растительной ткани осуществляли при помощи 20 % SDS и 3,5 М ацетата аммония, а также наборами для выделения ДНК (ООО «Син-тол») [8]. Качество выделенной ДНК было определено путём электрофореза в 1%-ном агарозном геле с бромистым этидием. Полученная ДНК растворялась в 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 7,8, содержащем 0,1 мМ ЭДТА, и использовалась для проведения ПЦР-анализа. Классическая полимеразно-цепная реакция была поставлена на амплификаторе «Genius» (Великобритания).
В работе был применён специфический маркер ModNemF/R для выявления гена устойчивости к нематодам [6]:
ModNemF 5/ CGAGCTGCTTGACGGGTTGTC 3/
ModNemR 5/ TCCTCAGAATTGCTGAAG 3/.
Секвенирование осуществляли методом Сэнгера на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500 (ООО «Евроген»).
40 САХАР № 9 • 2021
Результаты и обсуждение
Для профилактики инфицирования нематодами при посеве сахарной свёклы необходимо использовать генотипы, устойчивые к болезни, вызываемой данными возбудителями. Известно, что эффективные источники устойчивости к болезням у культурных растений, как правило, представлены популяциями из геноцентров эволюции культуры. И для понимания генетических основ формирования толерантности представляет интерес изучение дикой формы свёклы B. corolliflora Zoss., обладающей полигенной устойчивостью к болезням [9].
Амплификацию ДНК растений сахарной свёклы на наличие гена устойчивости к галловым нематодам проводили с использованием пары специфических праймеров к гену R6m-1 ModNemF/R. В результате проведения полимеразно-цепной реакции установлено, что не у всех изучаемых генотипов сахарной свёклы обнаружен искомый участок гена устойчивости к галловой нематоде. Так, у образцов № 6 (ОП 19179) и № 8 (Митика) не было выявлено ДНК-ампликонов. У остальных изученных материалов был обнаружен ПЦР-продукт размером ~500 п. н., что соответствует размеру искомого участка гена (рис. 1).
Среди образцов, в которых обнаружен ожидаемый ПЦР-продукт, присутствуют как устойчивые, так и чувствительные растения. Объясняется это наличием в генотипах определённых однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в гене R6m-1. Для выявления молекулярно-генетических вариаций некоторые образцы были отсеквенированы и выравнены по нукле-отидным последовательностям в программе Geneious Prime (рис. 2).
В результате генетического анализа описаны несколько SNPs (C/T, G/T, G/C, G/A), вставки
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K- M
Рис. 1. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов, полученных с применением праймера ModNemF/R. Обозначения образцов: 1 - F119170; 2 - F119176; 3 - МС10039; 4 - МС11018; 5 - ОП19172; 6 - ОП19179; 7 - Шаннон; 8 - Митика; 9 - Хамбер; 10 - В. сотШАот Zoss. М - маркер молекулярных масс ДНК Оепе^иЫг™ (ThermoScientific, США), К-- ПЦР-смесь без ДНК
(—/G, —/С) и делеции (A/—) как в геноме отечественных генотипов (позиционируемые как устойчивые), так и в иностранных селекционных материалах. Если сравнить последовательности участков ДНК геномов из базы данных NCBI (на фото — Nem06 F) и растения B. corolliflora Zoss. (устойчивый генотип по данному признаку) с растениями № 9 (Хамбер), то можно предположить, что именно SNPs C/T и G/T приводят к сбою в работе гена устойчивости. То есть данные однонуклеотидные замены, возможно, инициируют замещение аминокислоты в полипептиде; это приводит к синтезу иного белка или вообще прекращению синтеза (stop codon DNA), что, в свою очередь, вызывает сбой в работе сигнальных, а следовательно, и защитных белков. Играют ли остальные однонукле-отидные замены, делеции и вставки ключевую роль в формировании устойчивости к данной болезни, будет выявлено при дальнейшем генетическом анализе.
Заключение
Молекулярно-генетическое исследование гена устойчивости к нематодам R6m-1 (ПЦР-анализ, сек-венирование) позволило выявить делеции, инсерции и однонуклеотидные замены (C/T, G/T, G/C), которые, возможно, и приводят к модификации гена, замещая исходную аминокислоту. Исходя из результатов биоинформационного анализа, можно предположить, что по наличию определённых полиморфизмов (SNPs) в исследуемом гене сахарной свёклы с большой долей вероятности можно судить об устойчивости изучаемых селекционных материалов к воздействию нематод.
Генетический контроль устойчивости сахарной свёклы ко всем вредителям и болезням изучить пока не удалось, однако селекция на устойчивость к ним продолжается. Она основывается на молекулярном анализе коллекции образцов дикой и культурной свёклы, оценке их устойчивости, выделении и использовании устойчивых форм для гибридизации с целью повышения устойчивости гибридов сахарной свёклы. Представленные экспериментальные исследования имеют значительный теоретический и практический интерес для селекции устойчивых к гетеро-дерозу гибридов данной культуры.
Список литературы
1. Reuther, M. Nematode-tolerant sugar beet varieties — resistant or susceptible to the Beet Cyst Nematode Heterodera schachtii? / M. Reuther, Ch. Lang, M.W. Grundler // Sugar Industry. - 2017. - No. 5. -142. - P. 277-284. DOI: 10.36961/si18397.
2. Ghaemir, R. Molecular insights into the compatible and incompatible interactions between sugar beet and the beet cyst nematode / R. Ghaemir, E. Pourjam, N. Safaie //
Identity Nem06 F
Ген 1 ;_nem 06 F;_A2 Ген 2;_nem 06 F;_G2 Ген 3N500;_nem 06 F;_G1 Ген 4;_nem 06 F;_A3 Ген 9;_nem 06 F;_E2 Ген 10m500;_nem 06 F;_C2 Identity Nem06 F
Ген 1;_nem06 F;_A2 Ген 2;_nem 06 F;_G2 Ген 3N500;_nem 06 F;_G1 Ген 4;_nem 06 F;_A3 Ген 9;_nem 06 F;_E2 Ген 10m500;_nem 06 F;_C2
Identity Nem06 F
Ген 1 ;_nem 06 F;_A2 Ген 2;_nem 06 F;_G2 Ген 3N500;_nem 06 F;_G1 Ген 4;_nem 06 F;_A3 Ген 9;_nem 06 F;_E2 Ген 10m500;_nem 06 F;_C2
Identity
Nem06 F
Ген 1;_nem06 F;_A2 Ген 2;_nem 06 F;_G2 Ген 3N500;_nem 06 F;_G1 Ген 4;_nem 06 F;_A3 Ген 9;_nem 06 F;_E2 Ген 10m500;_nem 06 F;_C2 Identity Nem06 F
Ген 1;_nem06 F;_A2 Ген 2;_nem 06 F;_G2 Ген 3N500;_nem 06 F;_G1 Ген 4;_nem 06 F;_A3 Ген 9;_nem 06 F;_E2 Ген 10m500;_nem 06 F;_C2 Identity Nem06 F
Ген 1;_nem06 F;_A2 Ген 2;_nem 06 F;_G2 Ген 3N500;_nem 06 F;_G1 Ген 4;_nem 06 F;_A3 Ген 9;_nem 06 F;_E2 Ген 10m500;_nem 06 F;_C2
AAAGGGAACTCAAATGTTAAA TAATTGTAGGTСAGGA-AATGGAАСАAGTTTCAAGATTTTTTACATAAGAAACCATACCTGGTGAACAA AAAGGGAACTCAAATGTTAAA ТАATTGТАGGTСAGGA-AATGGAАСАAGTTTCAAGATTTTTTACАТАAGAAACCATACCTGGTGAACAA
_ __TAGTAGCATGGA-CAAGTTTCAAGATTTTTTACATAAGAAACCATACCTGGTGAACAA
AAAGGGAACTCAAAT GT ТА АА ТАATTGТАGGTСAGGA-AATGGAАСАAGTTTCAAGATTTTTTACАТАAGAAACCATACCTGGTGAACAA
TAGTAGCATGGA-CA-GTTTC-AGATTTTTTACATAAGAAACCATACCTGGTGAACAA
_ __TAGTAGCATGGA-CA-GTTTCAAGATTTTTTACАТАAGAAACCATACCTGGTGAACAA
AAAGGGAACTCAAAT GTTAAA TAATTGTAGGTCAGGA-AATGGAАСАAGTTTCAAGATTTTTTACATAAGAAACCATACCTGGTGAACAA
AGT ТСT CT AGTG TGG CAAGC T TGCCCA TAGCAA TC GCCAT TTG ACCCATG TAATC AGCAACAACTCCAGTAT TAGATGGACTGAGACAG" AGT ТСT CT AGTG TGG CAAGC T TGCCCA TAGCAATC GCCAT TTG ACCCATG TAATC AGCAACAACTCCAGTAT TAGATGGACTGAGACAG" AG T TC T CT AGTG TGG CAAGC T TGCCCА ТА GCAA TC GCCA T T T G ACCCA TG TAA TC AG CAACAACTCCAGTAT TAGA T GGACTGAGACAG" AG T TC T CT AGTG TGG CAAGC T TGCCCА ТА GCAA TC GCCA T T T G ACCCA TG TAA TC AG CAACAACTCCAGTAT TAGA T GGACTGAGACAG" AG T TC T CT AGTG TGG CAAGC T TGCCCА ТА GCAA TC GCCA T T T G ACCCA TG TAA TC AG CAACAACTCCAGTAT TAGA T GGACTGAGACAG" AG T TC T CT AGTG TGG CAAGC T TGCCCА ТА GCAA TC GCCA T T T G ACCCA TG TAA TC AG CAACAACTCCAGTAT TAGA T GGACTGAGACAG" AGT TBTCTAGBGHGGHA AGC TTGBdATAGIA A TIGHATTTGACCaATG ТА АТС AGHA AC AACTMAGT A T TAG AT GGACTGAGACAG"
I I
I
Г G СAGA A AG TG1 rGCAGAAAGTGl Г G СAGA A AG TG1 rGCAGAAAGTGl rGCAGAAAGTGl rGCAGAAAGTGl fGHAGAAAGTGl
ATlAAIAAGGGATTGHGIAGa АТСAAC AAGGG ATT GTT GCAGC AT СAAC AAGGG AT T GT T GlAGl AT С A AC AAGGG ATT GHGIAGC AT С A AC AAGGG ATT GHGIAGC ATСAACAAGGGATTGTTGHAGC АТИААИAAGGGATTGTBGBAGB
GCTTCCATTCCTTGI GCTTCCA TTCC T TG" GCTTCCATTCCTTG" GCTTCCATTCCTTG" GCTTCCATTCCTTG" GCTTCCATTCCTTG" GCTTCCATTCCTTG"
GATAAAGC GATAAAGI GAT AAAGl GATAAAGI GATAAAGI GATAAAGI GATAAAGI
IATHBTBGGBTTG" ATCCTCCGCTTG" ATCCTCCGCTTG" ATCCTCCGCTTG" IATHTHGITTG" ATCCTCCGCTTG" IATHTHGITTG'
" GAGAGGA T TGC T GCAAA T "GAGAGGATTGCTGCAAAT " GAGAGGA T TGC T GCAAA T "GAGAGGATTGCTGCAAAT "GAGAGGATTGCTGCAAAT "GAGAGGATTGCTGCAAAT Г GAGAGGAT TGCTGCAAA T
I
Г GC А ТА T T —A TC AA T T G CT GC T CT G TC AG AG G T T С rGCА ТА T TCCCA TCAA T T GCTGC TCTGTCAGAGGTTC rGCATATTCCCATCAATTGCTGC TCTGTCAGAGGTT( rGCATATTCCCATCAATTGCTGC TCTGTCAGAGGTTC rGBAТА TTCCCA TCAATTGCTGCTCTGTCAGAGGTTC rGBAТА TTCCCA TCAATTGCTGCTCTGTCAGAGGTTC fGBA ТА TTCKA TC AA T T GCTGC T CTG TCIAG AGG T T С
IAAGGT GGT ТШАШТ AGT A "I AAGGTGGTTCACTAGTAl AAGGTGGTTCACTAGTA1 AAGGTGGTTCACTAGTAl AAGGTGGTTCACTAGTAl AAGGTGGTTCACTAGTAl AAGGTGGTTCACTAGTAl
ITGATATTMAAMAAI JTGATATTCCAACAAC
;tgatattccaacaac
3TGATATTCCAACAAC 3TGATATTCCAACAAC iTGATATTCCAACAAC JTGATATTCCAACAAC
1A A A A A AC A T AATTTTTAAA AAAAAACATAATTTT ТАAA AAAAAACA T AATTTTTAAA AAAAAACATAATTTT ТАAA AAAAAACATAATTTT ТАAA AAAAAACATAATTTT ТАAA |AAAAAAHA|AA^^^BAAA
AAAAATTAAAAGHGH AAAAATTAAAAGHGHT AAAAATTAAAAGCGCT AAAAATTAAAAGHGHT AAAAATTAAAAGHGHT AAAAATTAAAAGCGCT AAAAATTAAAAG|GH
TCAATTCAGTCCT GAAG TA GAGGT GT T T GGGCAAGAAAAAAGAGACAAGAT T GTGT С T GGGTGCTT AAAAGTAG TCAATTCAGTCCT GAAG TA GAGG T GT T T GGGCAAGAAAA AAGAGACAAGAT T GT GT С T GGGTGCT T AAAAGTAG TCAATTСAGTCCTGAAGTAGAGGTGTTTGGGCAAGAAAAAAGAGACAAGATTGTGTСTGGGTGCTTAAAAGTAG TCAATTСAGTCCTGAAGTAGAGGTGTTTGGGCAAGAAAAAAGAGACAAGATTGTGTСTGGGTGCTTAAAAGTAG TCAATTСAGTCCTAAAGТАGAGGTGTTTGGGCAAGAAAAAAGAGACAAGATTGTGTСTGGGTGCTTAAAAGTAG T С A AT T С AGT CCT AAAG ТА GAGG T GT T T GGGCAAGAAAA AAGAGACAAGAT T GT GT С T GGGTGCT T AAAAGTAG TIAATTIAGTHTAAAG ТА GAGGI" GT T T GGGHAAGA A AA A AG AGAHA AGAT T GTGT С T GGGHGHTT AAAAGTAG
I
T A AT GA CC TT С A GC - A A T T С TG AGG A TC GA A AT С С
T AAT GA CC TT СA GC-AA T TCTGAGGAA
T A AT GA CC TT С AC С AA A T T С TG A
TAATGACCTTCAGC-AATTCTGAGGAA
T A AT GA CC TT С A GC - A A T T С TG A A
T A AT GA CC TT С A GC CA A T T С TG A A
TAATGA CC TT CAGC-AAT T С TGAGGAAGGAAGGA
I
ITAGCCACATGAAACA
■A GC С G GA G^^HA|A|GHAG АСА AHA A G
Рис. 2. Результат выравнивания нуклеотидных последовательностей образцов № 1, 2, 3, 4, 9, 10
BMC Plant Biology. - 2020. - No. 20. - 483. - P. 3-16. doi. 10.1186/s12870-020-02706-8.
3. Weiland, J. A Cleaved Amplified Polimorphic Sequence (CAPS) Marker Associated with Root-Knot Nematode Resistance in Sugar beet / J. Weiland, M. Yu // Crop Sci. - 2003. - № 43. P. 1814-1818.
4. Klein, M. Evaluation ofnematode-resistance sugar beet (Beta vulgaris L.) lines by molecular analysis / M. Klein, H. Voss, D. Cai, C. Jung // Theor. Appl. Genet. - 1998. -№ 97. - P. 896-904.
5. Yu, M.H. The Sea Beet Source of Resistance to Multiple Species of Root-Knot Nematode / M.H. Yu, W. Heijbroek, L.M. Pakish / Euphytica. - 1999. - 108. -P. 151-155.
6. Bakooie, M. Development of an SNP Marker for Sugar Beet Resistance/Susceptible Genotyping to Root-Knot Nematode / M. Bakooie, E. Pourjam, S. Mahmoudi, Safaie, Naderpour M. // J. Agr. Sci. Tech. - 2015. - 17. - P. 443-454.
7. Mahuku, G.S. A simple extraction method suitable for PCR-based analysis of plant, fungal, and bacterial DNA / G.S. Mahuku // Plant Mol. Biol. Rep. - 2004. - № 22. -P. 71-81. doi.org/10.1007/BF02773351.
8. Luterbacher, M.C. Sources of resistance to diseases of sugar beet in related Beta germplasm / M.C. Luterbacher
[et al.] // Euphytica. - 2005. - № 141. - P. 49-63. DOI: 10.1007/s10681-005-5231-y.
9. Monteiro, F. Genetic and Genomic Tools to Assist Sugar Beet Improvement: The Value of the Crop Wild Relatives / F. Monteiro [et al.] // Front Plant Sci. -2018. - № 9. - P. 74. doi.org/10.3389/fpls.2018.00074.
Аннотация. Молекулярно-генетическими методами исследован ген R6m-1, локализованный на 1 хромосоме сахарной свёклы и контролирующий устойчивость растений к нематодам. Для проведения ПЦР-анализа использована специфическая пара праймеров: ModNemF/R. У образцов, толерантных к воздействию галловых нематод, в гене обнаружены нуклеотидные замены, которые предположительно и формируют устойчивость растений, кодируя «другую» аминокислоту в полипептидной цепи. Ключевые слова: сахарная свёкла, нематоды, ген устойчивости, ПЦР-анализ, молекулярно-генетические маркеры.
Summary. The R6m-1 gene, localized on chromosome 1 of sugar beet and controlling plant resistance to nematodes by molecular genetics methods was studied. A specific primer ModNemF/R for PCR analysis was used. In accessions tolerant to root-knot nematodes, single nucleotide polymorphism were found in the gene, which, presumably, form plant resistance, coding for a «different» amino acid in the polypeptide chain. Keywords: sugar beet, nematoda, resistance gene, PCR, molecular-genetics marker.
