CC BY
18
Summary
DYNAMICS OF ACTIVITY CHANGES IN NADP-DEPENDENT DEHYDROGENASES IN THE BRAIN OF PUBERTY AGED RATS
Rudenko V.V., Sukhova L.L.
Keywords: ascending ontogenesis, brain, NADP-dependent dehydrogenases.
The work is aimed to study age-specific changes in the activity of NADP-dependent dehydrogenases in the brain of puberal aged rats. It has been established that in the rats aged 1,5- to 12-months, the process of ascending ontogenesis is accompanied by increasing of NADP-dependent dehydrogenase activity in the postmitochondrial fraction of cerebral hemispheres.
УДК 577.3:615.272.4
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ФОСФАТИДИЛХОЛИНОВЫХ ЛИПОСОМ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
Русланов А.Д., Башилов A.B.
Университет Штата Нью-Йорк, Нью-Йорк, США
Национальная академия наук Беларуси, Минск, Республика Беларусь
Изучена динамика накопления карбонильных соединений в ходе перекисного окисления фосфа тидилхолиновых липосом в зависимости от времени окисления и природы системы инициации пе роксидации (H2O2, CuSO4, CuSO4 + H2O2, Cu(CH3COO)2, Cu(CH3COO)2+ H2O2). Ключевые слова: лилосома, лерекисное окисление, антиоксидантная активность. Введение
Развитие целого ряда заболеваний человека сопровождается активацией процессов свобод-норадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1-3]. Фармакологическую коррекцию патологических процессов, протекающих на фоне синдрома липидной пероксидации проводят с использованием природных и синтетических ан-тиоксидантов (АО) [4]. Терапия с включением АО находит все большее применение при лечении ряда заболеваний. Поэтому на первый план выносится проблема количественной оценки суммарной антиоксидантной активности (АОА) комплексных препаратов и их эффективных концентраций. Важной в этом плане представляется оценка АОА с использованием модельных систем ПОЛ in vitro, с помощью которых можно не только выявлять наличие АОА у химических соединений, но и изучать одновременно механизм и особенности действия веществ в различных условиях протекания процессов ПОЛ, с последующим теоретическим прогнозирование АОА на основе методов современной компьютерной алгебры.
Цель работы - биохимический скрининг АОА фармакологически активных веществ различной химической структуры.
Материалы и методы исследования
Определение АОА проводили in vitro с использованием в качестве субстрата ПОЛ монола-меллярных липосом, полученных из яичного фосфатидилхолина методом инжекции эта-нольного раствора липида в водную фазу. Конечная концентрация фосфолипида в суспензии липосом составляла 2,38 мг/мл [5].
Липосомы подвергали авто- и индуцированному окислению при 37 °С. ПОЛ липосом инициировали добавлением сульфата или ацетата меди (II) (конечная концентрация Cu2+ 2,5 мМ в инкубационной среде). Гидрофильные исследуемые АО добавляли до нужной концентрации к водной фазе перед приготовлением липосом. Липофильные исследуемые АО добавляли до нужной концентрации к этанольному раствору фосфолипидов перед приготовлением суспензии липосом. Уровень ПОЛ в суспензии липосом детектировали по концентрации карбонильных соединений, реагирующих с N-(2,4-динитрофенил)гидразином (ДНФГ):
RR'C=O + C6H3(NO2)2NHNH2 ^ CaH3(NO2)2NHNCRR' + H2O
Реакция включает в себя следующие промежуточные стадии:
1нА„ I*
Н-0 -^н-Ц,
К' Я
А
Н-0 ' ' Н N8
К 0,05 мл суспензии липосом добавляли 0,2 мл 2 мМ раствора ДНФГ в 1,9 М хлороводородной кислоте. После 10 минутной экспозиции в реакционную смесь вводили 1 мл 0,75 М гидро-ксида натрия. Через 10 мин спектрофотометри-ровали при длине волны 460 нм против соответствующим образом обработанной контрольной пробы (вода). АОА рассчитывали по уравнению: АОА=[(С0- С1 ) / Сэ] • 100% где С0 - концентрация карбонильных соединений в суспензии липосом, не содержащей исследуемого соединения (контроль), С1 - концентрация карбонильных соединений в суспензии липосом, содержащей исследуемое соединение (опыт).
Если значение показателя АОА было положительным, считали, что тестируемое вещество проявляет АОА; если значение показателя АОА было отрицательным, считали, что тестируемое вещество проявляет прооксидантное действие [6].
Статистически обработанные данные представлены в виде М±БО, где М - среднее арифметическое, Эй - стандартное отклонение. Достоверность отличий между средними в различных группах опытов устанавливали с помощью дисперсионного анализа.
Результаты и их обсуждение
Динамика содержания карбонильных соединений в липосомах в зависимости от времени окисления и особенностей инициации процесса ПОЛ. Изучена динамика накопления карбонильных соединений (ДНФГ-позитивных продуктов) в ходе ПОЛ фосфатидилхолиновых липосом в зависимости от длительности периода окисления и природы системы инициации ПОЛ (Н202, СиЭ04, СиЭ04 + Н202, Си(СН3С00)2, Си(СН3С00)2 + Н202, конечная концентрация пероксида водорода в инкубационной среде составляла 0,8 мМ, а Си2+ - 2,5 мМ) (табл. 1).
Таблица 1.
Содержание ДНФГ-позитивных продуктов в суспензии липосом в условиях окисления
Время,ч Инициатор ПОЛ
- Н202 СиЭ04 СиЭ04 + Н202 Си(СНзС00)2 Си(СНзС00)2 + Н202
1 0.114±0.01 0.172±0.01 0.111±0.01 0.172±0.01 0.163±0.01 0.278±0.01
3 0.139±0.01 0.223±0.14 0.169±0.01 0.260±0.01 0.311±0.02 0.543±0.03
6 0.181±0.01 0.326±0.02 0.312±0.02 0.427±0.02 0.460±0.02 0.763±0.04
24 0.903±0.06 0.973±0.05 1.221±0.08 1.273±0.07 1.243±0.06 1.256±0.07
48 1.217±0.08 1.176±0.06 1.393±0.09 1.382±0.07 1.268±0.08 1.288±0.07
72 1.398±0.08 1.426±0.09 1.379±0.09 1.365±0.07 1.117±0.06 1.154±0.06
96 1.283±0.08 1.396±0.08 1.369±0.06 1.465±0.09 1.226±0.08 0.983±0.06
Установлено, что динамика изменения концентрации карбонильных соединений в липосомах в процессе их окисления зависит от того, какое именно вещество (смесь веществ) использовано для инициации ПОЛ. В течении первых 24 - 48 часов окисления скорость накопления ДНФГ-позитивных продуктов носила непостоянный характер и существенно зависила от способа инициации ПОЛ.
При автоокислении значительное возрастание содержания карбонильных соединений происходило только к 24-м часам. При окислении в течении 48 ч и более содержание продуктов пе-роксидации изменялось незначительно. Добав-
ление к инкубационной среде пероксида водорода инициировало ускорение накопления карбонильных соединений в первые часы процесса ПОЛ по сравнению с автоокислением. Однако на отсроченных этапах окисления (24 ч и более) содержание ДНФГ-позитивных продуктов в сус-пенизии липосом, подвергнутых автоокислению и Н202-индуцированному окислению, значимо не отличалось.
Индукция ПОЛ СиЭ04 привела к повышению уровня карбонильных продуктов при средних сроках окисления (6 и 24 ч), но не на начальных или отсроченных этапах ПОЛ. Различия в накоплении продуктов пероксидации при индукции
ПОЛ СиЭ04 или системой СиЭ04 + Н202 были статистически сомнительны на начальных этапах окисления (1 и 3 ч) и недостоверны при большей длительности окисления. При сроках окисления 1-24 ч концентрация карбонильных продуктов ПОЛ в суспензии липосом, подвергнутых СиЭ04 + Н202-индуцированному окислению, было выше, чем в суспензии автоокислен-ных фосфатидилхолиновых липосом.
Индукция ПОЛ Си(СН3С00)2 вызывала усиление ПОЛ по сравнению с СиЭ04 на начальных этапах окисления. При инициации ПОЛ системой Си(СН3С00)2 + Н202 накопление карбонильных соединений в липосомах в первые 6 часов инкубации было интенсивным по сравнению со всеми перечисленными выше случаями.
Поскольку инициация окисления липосом ацетатом меди (II) приводит к более выраженному накоплению ДНФГ-позитивных продуктов, чем инициация ПОЛ сульфатом меди (II) было изучено влияние ацетат-аниона на интенсивность ПОЛ в липосомах. Установлено, что добавление ацетата натрия к инкубационной среде (индукция окисления СиЭ04 или системой СиЭ04 + Н202) приводит к возрастанию содержания карбонильных соединений в суспензии липосом при длительности окисления 1-24 ч концентрацион-но-зависимым образом, что может свидетельствовать о способности ацетат-аниона вызывать накопление карбонильных соединений при Си2+-зависимом окислении фосфатидилхолиновых липосом.
Также было изучено влияние концентрации фосфатидилхолина на накопление ДНФГ-позитивных продуктов в липосомах. Установлено, что концентрация фосфолипида в суспензии липосом существенно зависела от концентрации карбонильных соединений в липосомах в ходе их длительного окисления. Анализ зави-сисмости концентрации карбонильных соединений от концентрации липида в суспензии при различной длительности периода окисления показал наличие прямой зависимости между указанными показателями.
В дальнейших исследованиях установлено, что при окислении суспензии фосфотидилхоли-новых липосом происходило постепенное за-кисление реакционной смеси. Скорость закис-ления при Си2+-индуцированном ПОЛ была относительно медленная, а при автоокислении за-кисление среды существенно ускорялась при длительности окисления больше 24 ч.
Для выяснения вопроса о возможности применения буферных растворов при моделировании Си2+-индуцированного ПОЛ в фосфатидилхолиновых липосомах проведен анализ данных литературы и ряд собственных экспериментов. По данным литературы применение фосфатных буферных растворов невозможно из-за образования плохо растворимых ортофосфатов меди (II),
а широко применяемые в биохимии буферные системы дают устойчивые комплексы с Си + [7].
Изучено влияние буферных растворов на основе солей уксусной, янтарной, лимонной и 2-морфолиноэтансульфоновой кислот на накопление карбонильных соединений в липосомах. Выявлено, что 2-морфолиноэтансульфоновая кислота способна существенно усиливать накопление продуктов ПОЛ в ходе как Си2+-индуцированного, так и спонтанного окисления липосом: прооксидантное действие 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты не наблюдалось лишь при индукции ПОЛ системой Cu(CH3COO)2+ H2O2.
Также обнаружено, что ацетатные буферные растворы стимулируют накопление карбонильных соединений в ходе Си2+-индуцированного ПОЛ липосом, сукцинатные могут проявлять как про- так и антиоксидантное действие в зависимости от вида индукции, а цитратные в большинстве случаев подавляют накопление карбонильных соединений в липосомах. Следовательно, буферные растворы на основе изученных органических кислот способны оказывать существенное влияние на процесс накопления в липосомах ДНФГ-позитивных продуктов как при спонтанном, так и при индуцированном окислении. Поэтому для целей скрининговой оценки антиоксидантных свойств веществ представляется допустимым применение незабуференной суспензии липосом в экспериментах длительностью до 24 ч.
Следующим этапом работы являлось изучение АОА на примере модельной системы перок-сидации липосом 11 химических соединений: унитиола (2,3-димеркаптопропансульфонат натрия, является антидотом), ионола и кверцетина (вещества антиоксидантного действия), пробу-кола (гипохолестеринемическое средство), ацетата ретинола (витамин А), таурина (регулятор метаболических процессов), эргокальциферола (витамин D2), глутатиона (природный АО) и трех комплексообразующих солей карбоновых кислот: янтарной, лимонной и винной (естественные продукты метаболизма, входят в состав пищевых продуктов и лекарственных препаратов).
Выбор концентраций, в которых исследуемые вещества вносились в модельную систему, осуществлялся исходя из физиологических (для естественных метаболитов) или терапевтически достижимых (для фармакологически активных веществ) концентраций в тканях и биологических жидкостях человека.
АОА липофильных АО. Изучена АОА липо-фильных АО (ионол, пробукол, кверцетин, ацетат ретинола, эргокальциферол) в зависимости от длительности окисления липосом при различных способах инициации в диапазоне концентраций АО: 5 мкМ и 100 мкМ (табл. 2).
Таблица 2.
Содержание ДНФГ-позитивных продуктов в суспензии липосом в присутствии липофильных АО
AO, мкМ Инициатор ПОЛ Длительность ПОЛ, ч
1 3 6 24 48
Ионол , 5 - 11.84± 0.61 9.87± 0.51 8.46± 0.52 86.21±5.63 91.56±6.55
Cu(CH3COO)2 8.63± 0.66 36.25± 1.75 64.63± 3.66 4.56±0.31 -2.14±0.14
Cu(CH3COO)2 + H2O2 2.76± 0.19 9.12± 0.41 11.56± 0.67 5.23±0.31 7.56±0.41
Ионол,100 - 7.36± 0.44 33.42± 1.31 41.23± 2.89 86.63±4.11 83.36±4.85
Cu(CH3COO)2 24.32± 1.32 40.32± 1.85 76.23± 3.44 84.36±4.65 84.23±5.33
Cu(CH3COO)2 + H2O2 21.96± 1.26 45.56± 2.45 63.78± 3.24 82.63±4.23 81.63±4.65
Пробукол, 5 - 27.96± 1.63 12.63± 0.63 49.21± 2.86 79.56±4.56 96.36±5.12
Cu(CH3COO)2 17.32± 0.94 41.36± 2.41 73.54± 3.96 86.64±4.51 86.32±4.01
Cu(CH3COO)2 + H2O2 46.32± 2.65 34.26± 1.84 24.96± 1.44 3.65±0.21 -31.92± 1.87
Пробукол, 100 - 36.56± 1.65 44.36± 2.45 23.63± 1.32 82.36±4.23 86.32±5.02
Cu(CH3COO)2 18.24± 1.14 53.63± 2.96 73.62± 3.11 79.36±5.32 83.36±5.44
Cu(CH3COO)2 + H2O2 45.36± 2.65 56.32± 3.54 63.32± 3.65 82.36±4.65 86.32±4.21
Кверцетин, 5 - 21.36± 1.22 25.36± 1.66 33.26± 2.69 48.32±3.62 64.32±3.54
Cu(CH3COO)2 + H2O2 16.32±0. 68 -6.32± 0.47 -4.32± 0.34 -5.32±0.35 -13.23± 0.94
Кверцетин, 100 - 321.63± 18.82 14.32± 1.18 36.32± 2.24 63.32±3.84 82.45±4.32
Cu(CH3COO)2 + H2O2 17.25±1. 32 34.96±1.6 3 53.95±2.2 5 -0.63±0.05 -10.32±0.68
Ацетат ретинола, 5 - 12.32±1. 02 5.96±0.3 7.96±0.44 -6.78±0.45 14.96±0.82
Cu(CH3COO)2 + H2O2 38.45± 2.14 23.96± 1.24 14.95± 0.84 8.45±0.55 31.27±1.65
Эргокальци-ферол, 5 - 5.96± 0.36 4.69±0.36 71.86± 4.06 301.45± 19.44 386.74± 21.65
Cu(CH3COO)2 + H2O2 24.85± 1.14 14.32± 0.93 7.36±0.54 -14.63±0.85 -63.25±3.65
Установлено, что ионол и пробукол подавляли накопление ДНФГ-позитивных продуктов в ли-посомах в случае автоокисления, причем наибольшая АОА наблюдалась на отдельных этапах ПОЛ (24 и 48 ч). При этом только до 6 ч окисления наблюдалась зависимость АОА от концентрации АО, в эти же сроки пробукол был несколько более эффективен как АО в сравнении с ионолом. На отдельных этапах ПОЛ ионол и пробукол в обоих изученных концентрациях были примерно равноэффективны.
При индукции окисления липосом ацетатом меди (II) заметное антиоксидантное действие на всех этапах ПОЛ обнаружено у пробукола (в обеих концентрациях) и ионола (в концентрации 100 мкМ), причем АОА возрастала при пролон-
гации периода окисления. В концентрации 5 мкМ ионол оказался неэффективен на отдельных этапах ПОЛ.
При индукции ПОЛ Cu(CH3COO)2 + H2O2 высокая АОА наблюдалась у пробукола и ионола только в концентрации 100 мкМ. При содержании 100 мкМ АОА ионола и пробукола при длительном протекании ПОЛ инвертировалась в прооксидантное действие, причем пробукол, более эффективный как АО на начальных этапах ПОЛ, оказался на отдельных этапах ПОЛ более сильным прооксидантом.
АОА кверцетина при автоокислении оказалась выше, чем у ионола, на начальных этапах ПОЛ и ниже - при пролонгации. При индукции ПОЛ системой CU(CH3C00)2 + H2O2 кверцетин в кон-
центрации 5 мкМ был неэффективен, а в концентрации 5 мкМ сохранял заметную АОА только на начальных этапах окисления (подобно низким концентрациям ионола и пробукола).
Поскольку липофильные АО эффективно перехватывают карбо- и пероксирадикалы, обрывая цепные свободнорадикальные реакции в липидной фазе [8], АОА таких соединений будет наиболее выраженной при интенсивном ПОЛ, то есть на отсроченных этапах пероксидации. В ситуации же, когда эффективная концентрация АО мала относительно концентрации зарождающихся свободных радикалов (исходно низкая концентрация АО или низкая остаточная концентрация АО на отдаленных этапах ПОЛ при высокой скорости зарождения радикалов), большая часть молекул АО быстро превращается в феноксильные радикалы, которые способны с относительно высокой скоростью включатся в продолжение цепей реакций ПОЛ. В этом случае АО будет выступать не как игиби-тор, а как субстрат реакций свободнорадикаль-ного окисления, что мы и наблюдаем при длительном Си(СН3СОО)2 + Н202 -индуцированном ПОЛ липосом.
Зависимость АОА ацетата ретинола и эрго-кальциферола от длительности периода окисления липосом существенно отличаются от таковой для вышерассмотренных липофильных АО. Ацетат ретинола не оказывал достоверного влияния на образование карбонильных соединений при автоокислении липосом, проявляя, однако, тенденцию к незначительной стимуляции ПОЛ. Эргокальциферол, не изменял уровень ПОЛ в течение первых 3 часов автоокисления, на более поздних временных этапах демонстрировал значительную прооксидантную
Содержание ДНФГ-позитивных продуктов в с
активность. Выраженность прооксидантного эффекта эргокальциферола усиливалась с увеличением длительности периода окисления. В случае индукции ПОЛ системой Си(СН3С00)2 + Н202 ацетат ретинола и эргокальциферол заметно снижали содержание карбонильных соединений в липосомах в течении первых 3 - 6 часов окисления, но при большей длительности ПОЛ оба соединения проявляли прооксидант-ное действие, более выраженное у эргокальциферола. Интересно также отметить, что проок-сидантный эффект эргокальциферола при индуцированном ПОЛ липосом существенно ниже, чем при автоокислении.
Обнаруженная динамика АОА ацетата ретинола, возможно, связана с тем, что ацетат ретинола способен эффективно перехватывать радикальные инициаторы реакции ПОЛ [9] лишь до тех пор, пока содержание ацетата ретинола достаточно для перехвата основного количества образующихся в ходе свободно-радикального окисления радикалов [10]. После истощения пула АО с ненасыщенными связями скорость сво-боднорадикального окисления существенно возрастает, тем более, что продукты окисления ацетата ретинола могут вовлекаться в дальнейшее развитие реакции свободно-радикального окисления [11]. Повидимому аналогичным образом можно объяснить и ан-ти/прооксидантные эффекты эргокальциферола.
АОА гидрофильных АО. Обнаружено, что тио-ловые АО глутатион (восстановленная форма) и унитиол (1 о0 мкМ) проявляют заметную АОА только на начальном этапе ПОЛ (1 ч окисления) (табл. 3).
Таблица 3.
шзии липосом в присутствии гидрофильных АО
АО, мкМ Инициатор ПОЛ Длительность ПОЛ, ч
1 3 6 24 48
Глутатион, 100 - 17.32± 0.94 -72.32± 3.74 -32.48± 1.18 -46.32± 2.18 -74.36± 4.12
Си(СН3С00)2 + Н202 24.36± 1.44 -4.32± 0.24 1.22±0.08 4.52±0.32 -41.63±2.58
Унитиол, 100 - 32.25± 1.88 -2.36± 0.14 14.32± 0.63 17.32± 0.91 7.45±0.45
Си(СН3С00)2 + Н202 21.63± 0.96 8.49±0.55 8.63± 0.55 7.32±0.49 5.96±0.32
Таурин, 100 - 14.32±0.85 11.96±0.64 6.86±0.51 -6.75±0.38 5.21±0.34
Си(СН3С00)2 + Н202 26.96±1.88 3.45±0.24 7.45±0.45 17.25±0.96 10.48±0.64
При более длительных сроках окисления АОА унитиола снижается до незначительной, а глутатион полностью подавляет накопление карбонильных соединений в липосомах и становится способным проявлять прооксидантное действие. Подобная динамика АОА, вероятно, определяется механизмом АОА тиолов, связанной как с
окислением БН-групп под действием кислородных радикалов, так и с хелатированием катионов металлов переходной валентности [7]. При взаимодействии с радикалами тиол превращается в соответствующий тиильный радикал, степенью реакционноспособности которого определяется его способность вовлекаться в даль-
нейшее развитие ПОЛ. Образующиеся при окислении глутатиона тиильные радикалы обладают высокой реакционноспособностью, что, возможно, приводит к инверсии антиоксидантно-го действия глутатиона в прооксидантное.
У природной аминосульфокислоты таурина обнаружена слабая АОА, исчезающая на отда-
ленных этапах ПОЛ (табл. 3).
АОА солей комплексообразующих карбоновых кислот. Изучено влияние сукцината натрия, тар-трата калия-натрия, цитрата натрия (2 и 10 мМ) на накопление карбонильных соединений в ли-посомах при индукции ПОЛ сульфатом или ацетатом меди в присутствии Н202 (табл. 4).
Таблица 4.
Содержание ДНФГ-позитивных продуктов в суспензии липосом в присутствии солей карбоновых кислот
АО, мкМ Инициатор ПОЛ 1 3 6 24
Сукцинат натрия, 2 CUSO4+ H2O2 -11.23±0.64 -52.32± 2.74 12.36±0.71 14.32±0.69
Cu(CHaCOO)2+ H2O2 11.32±0.65 63.45±3.28 68.56±3.94 -4.15±0.31
Сукцинат натрия, 10 CUSO4+ H2O2 -11.23±0.44 -25.32± 1.34 4.25±0.24 25.36±1.39
Cu(CHaCOO)2+ H2O2 4.21±0.36 51.23±2.34 62.15±3.11 14.23±0.81
Тартрат калия-натрия, 2 CUSO4+ H2O2 -13.65±0.54 -42.96± 2.26 2.65±0.21 -7.25±0.41
Cu(CHaCOO)2+ H2O2 14.23±0.93 44.25±2.38 32.96±1.75 -8.65±0.56
Тартрат калия-натрия, 10 CUSO4+ H2O2 -0.65±0.06 -38.25± 2.11 -15.3±0.81 11.25±0.61
Cu(CHaCOO)2+ H2O2 14.23±0.84 34.21±0.96 41.56±2.11 -14.32± 0.64
Цитрат натрия , 2 CUSO4+ H2O2 -8.23±0.55 -16.32± 0.83 21.36±1.16 14.25±0.82
Cu(CHaCOO) 2+ H2O2 25.63±1.36 65.32±3.85 74.32±3.18 11.96±0.63
Цитрат натрия, 10 CUSO4+ H2O2 31.25±1.36 15.96±0.96 36.58±1.46 87.25±4.68
Cu(CHaCOO)2+ H2O2 4.25±0.44 63.86±3.23 81.36±4.55 91.46±4.44
Обнаружено, что при индукции ПОЛ системой СиЭ04 + Н202 сукцинат и тартрат проявляют в основном прооксидантные свойства, а при индукции ПОЛ Си(СН3С00)2 + Н202 они продемонстрировали выраженную АОА (при длительности окисления до 6 ч). Цитрат, образующий более прочные комплексы с металлами, чем сукцинат и тартрат, оказался наиболее эффективным АО среди изученных комплексообразова-телей. При этом у цитрата ни в одном случае не было обнаружено значимого прооксидантного действия. По всей видимости, связывание в комплекс с анионами карбоновых кислот лишь частично препятствует вовлечению Си2+ в реакцию Фентона с продукцией гидроксил-радикала, инициирующего реакции ПОЛ в мембране фос-фатидилхолиновых липосом.
В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование модельной биохимической системы ПОЛ в суспензии фос-фатидилхолиновых липосом позволяет выявить у АО различной химической структуры особенности их АОА в зависимости от интенсивности и длительности протекания реакций ПОЛ. Установлено, что веществам с определенным меха-
низмом действия свойственна и определенная зависимость АОА от длительности и интенсивности окисления липосом.
Обнаружено явление трансформации антиок-сидантного действия в прооксидантное в зависимости от длительности периода протекания процесса ПОЛ. Важно отметить, что инверсия антиоксидантных свойств в прооксидантные оказалась свойственной АО различной химической природы и различного механизма действия. Такая инверсия была выявлена нами у ли-пофильных соединений, веществ с насыщенными С=С-связями , тиолов и карбоновых кислот, способных образовывать комплексы с катионами металлов переходной валентности.
Выводы
1. Проведен биохимический скрининг веществ различной химической природы с целью выявления АОА и уточнения особенностей АОА с использоаванием модельной системы на основе суспензии фосфатидилхолиновых липосом при различной длительности окисления липосом in vitro. Продолжительное окисление липосом (24 ч и более) позволило
обнаружить особенности АОА веществ, не выявляющиеся при малой длительности процессов ПОЛ.
2. Эффективность действия изученных фармакологически активных веществ с АОА существенно изменялась в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах и за-висила от химической природы АО, его концентрации и интенсивности ПОЛ, детерминируемой способом инициации окисления фосфатидилхолиновых липосом.
3. Липофильные АО более эффективно подавляли накопление карбонильных продуктов ПОЛ при автоокислении липосом, чем при Сы2+-индуцированном окислении. АОА липофильных АО достигала максимума на поздних (24 ч) этапах окисления.
4. Липофильные вещества, содержащие ненасыщенные связи, проявляли максимальную эффективность на раннем этапе ПОЛ (1 ч окисления), и их АОА при Cu2+ -индуцированном окислении более выражен-на, чем при автоокислении.
5. Серосодержащие гидрофильные АО наиболее эффективно подавляли ПОЛ на раннем этапе процесса (1 ч окисления). На более поздних этапах АОА таких веществ исчезала.
6. Карбоновые кислоты, способные образовывать комплексы с катионами металлов, в зависимости от их концентрации и от условий протекания процесса ПОЛ проявляли как анти-, так и прооксидантное действия. Наибольшая эффективность АОА комплексооб-разующих карбоновых кислот регистрировалась при средней длительности окисления (3 и 6 ч).
7. Инверсия антиоксидантного действия химических соединений в прооксидантное действие наблюдалась на отсроченных этапах
Реферат
ВИКОРИСТАННЯ МОДЕЛЫ-Ю1 СИСТЕМИ НА OCHOBI ФОСФАТИДИЛХОЛ1НОВИХ Л1ПОСОМ ДЛЯ ОЦ1НКИ АН-ТИ0КСИДАНТН01 АКТИВНОСТ1 Русланов А.Д., Башилов А.В.
Ключов1 слова: лтосома, перекисне окиснення, антиоксидантна активнють.
Вивчена динамка накопичення карбонтьних сполук у xofli перекисного окиснення фосфатидилхолн нових лтосом у залежност1 вщ часу окиснення та природи системи ¡нщ1ацп пероксидаци (H2O2, CUSO4, CUSO4+ H2O2, Си(СНзСОО)2, Си(СНзСОО)2+ H2O2).
Summary
APPLIOATION OF MODEL SYSTEM BASED ON PHOSPHATIDYI^HOLINE LIPOSOMES IN ESTIMATION OF ANTIOXIDANT ACTIVITY Ruslanov A.D., Bashylov A.V.
Key words: liposomes, peroxidation, antioxidant activity.
The research studies the dynamics of carbonyl compounds' accumulation in the course of phosphatidylcholine liposome peroxidation depending on the oxidation period and the nature of peroxidation initiation system (H2O2, ^SO4, ^SO4 + H2O2, ^^H^OO^, ^^H^OO^ + H2O2).
ПОЛ (длительность окисления 3 часа и более с момента инициации окисления). Проявление инверсии зависело от химической природы и концентрации АО, итенсивности протекания реакций ПОЛ и способа инициации окисления липосом.
Литература
1. Benzie I.F. // Int. J. Food Sci. Nutr. - 1996. - Vol. 47, №3. - P. 233-261
2. Berliner J.A., Heinecke J.W. // Free Radic. Biol. Med.
- 1996. - Vol. 20, № 5. - P.707-727
3. Winterbourn С.С. din. // Exp. Pharmacol. Physiol. -1995. - Vol. 22, № 11. - P. 877 - 880
4. Rice-Evans С.А, Diplock A.T. // Free Radic. Biol. Med. - 1993. - Vol. 15. - P. 77 - 96.
5. Batzri S., Korn E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication // Biochim.Biophys. Acta. -1973. - Vol. 298. - P. 1015 - 1019.
6. Zaitsev V.G., Zakrevski V.M. Modelling of peroxide oxidation of lipids in vitro. Application dinitrophenylhy-drazine for an intensity estimation peroxide oxidation phosphatidylcholinic liposomes // Proceedings of the Volgograd medical academy. - 2000. - № 6. - Vol. 56.
- P. 130-133.
7. Halliwell B., Gutteridge J.M.d Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: An overview // Methods Enzymol. - 1990. - Vol. 186. - P.1-85.
8. Bonnefont-Rousselot D., Segaud С., Jore D., Delattre J., Gardes-Albert M. Antioxidant effect of probucol on RO2'/O2'-induced peroxidation of human low-density lipoproteins // Radiat. Res. - 1999. - Vol. 151, № 3. -P. 343-353.
9. Liebler D.d, Mcdure T.D. Antioxidant reactions of carotene: Identification of carotenoid-radical adducts // diem. Res. Toxicol. - 1996. - Vol. 9, № 1. - P. 8-11.
10. Rice-Evans СА, Diplock A.T. ^r^nt status of antioxidant therapy // Free Radical Biol. Med. - 1993. -Vol.15. - P.77-96.
11. Olson J.A. Benefits and liabilities of vitamin A and ca-rotenoids // J. Nutr. - 1996. - Vol.126, № 4 - P.1208-1212.
