CC BY
264
УДК 504.53+625.7/.8
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭКОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ХАРАКТЕРИСТИК РАЗЛИЧНЫХ МИКРОБИОЦЕНОЗОВ
В.А. Юрченко, профессор, Я.С. Дяговец, Е.С. Хроменкова, А.С. Остапова, студенты, ХНАДУ
Аннотация. С помощью микроскопирования определяли характеристики экологической безопасности молочнокислых продуктов, активного ила, а также экологической безопасности биологических очистных сооружений.
Ключевые слова: микроорганизмы, микробиоценозы, микроскопирование, зооглейность.
Введение
Главная функция микроорганизмов в природных экосистемах - деструкция органических остатков. Микроорганизмы очень широко используются в различных биотехнологиях: производстве пищевых продуктов (хлеба, пива, вина, молочнокислых продуктов и т.д.), различных природоохранных технологиях (очистки сточных вод, газообразных выбросов и твердых отходов). От концентрации микроорганизмов в микробиоценозах пищевых продуктов зависит их экологическая безопасность, а в микробиоценозах очистных сооружений - эффективность защиты природной среды от загрязнения.
Биологическая очистка сточных вод с помощью активного ила - наиболее эффективный, экономичный и экологически чистый метод защиты природных вод от загрязнения жидкими бытовыми и промышленными отходами. Активный ил - это сообщество микро- и макроорганизмов, принадлежащих к различным таксонам: бактерии, грибы, простейшие, черви, водоросли и другие.
Анализ публикаций
Человечество употребляет в пищу кисломолочные продукты уже много сотен лет, но только в конце XIX века великий ученый Мечников И.И. впервые доказал, что кефир, простокваша, ряженка, кроме приятного вкуса и питательной ценности, обладают еще
способностью плодотворно влиять на человеческий организм, микрофлору кишечника. Происходит это за счет полезных бактерий, содержащихся в молочнокислых продуктах. Многочисленные исследования свидетельствуют о высокой эффективности продуктов, содержащих пробиотики, при различных желудочно-кишечных заболеваниях, пищевой аллергии, непереносимости лактозы, которые, как правило, сопровождаются дисбакте-риозами кишечника.
В последние годы растет интерес к кисломолочным продуктам, содержащим микроорга-низмы-пробиотики (бифидобактерии, ацидофильные молочнокислые палочки и др.). Пробиотики - это продукция микробного происхождения, содержащая живые или убитые микроорганизмы, или их компоненты и метаболиты. Она включает бактерии, которые апатогенны для человека, обладают антагонистической активностью в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов и обеспечивают восстановление нормальной микрофлоры. Пробиотики разделяются на монокомпонентные (моно-пробиотики), монокомпонентные сорбированные пробиотики, поликомпонентные (полипробиотики), комбинированные пробиотики (синбиотики); на бифидосодержа-щие, включающие бифидобактерии, лактосо-держащие, включающие лактобациллы, ко-лисодержащие, содержащие кишечную палочку, и состоящие из споровых бактерий и
сахаромицет, т.н. самоэлиминирующиеся антагонисты.
Главными технологическими свойствами активного ила, используемыми при биологической очистке сточных вод, являются:
- сорбирование загрязнений;
- окислительная деструкция загрязнений;
- отделение ила от очищенной жидкости при отстаивании.
Одной из самых опасных проблем в работе очистных сооружений является нарушение седиментационных свойств активного ила, называемое «вспуханием активного ила». Оно обусловлено активным развитием в микробиоценозе нитчатых бактерий, вследствие чего ил утрачивает способность к оседанию.
Цель и постановка задачи
Целью данной работы является оценка экологической безопасности молочнокислых продуктов и оценка экологической эффективности активного ила биологических очистных сооружений с помощью методов микроскопирования.
Методы исследования:
- прямое микроскопирование препаратов и определение морфологических характеристик микроорганизмов;
- учет количества бактерий в микробных препаратах с помощью камеры Горяева;
- определение размеров клеток с помощью объект- и окулярмикрометров;
- диагностическая окраска препаратов;
- постановка специальных тестов.
Идентификацию нитчатых бактерий в активном иле выполняли в соответствии с D. Eikelboom. Микроскопический анализ показал, что в исследуемом активном иле мало свободно плавающих инфузорий, коловраток. Прикрепленные инфузории отсутствуют. Ил представлял собой мелкие хлопки, пронизанные насквозь неподвижными, без ветвления бактериальными нитями. Нити имели прутьевидную, слегка изогнутую форму. Длина нитей составляла 200 мкм, диаметр -1,5-2,5 мкм. Прикрепленный рост бактерий к нитям не был отмечен. Нити состояли из дисков (иногда черного цвета) и содержали включения серы, перегородки между клетками хорошо заметны. По Граму нити окрашивались отрицательно, по Нейссеру (выявле-
ние включений полифосфатов) - отрицательно, тест с Na2S - положительный. По совокупности признаков согласно идентификационным ключам, разработанным D. Eikel-boom, эти нитчатые бактерии относятся к Type 021N. Наиболее вероятными причинами развития нитчатых бактерий этого вида являлось присутствие в поступающих сточных водах сероводорода.
Микроскопирование молочнокислых продуктов
Для оказания профилактического и лечебного действия препараты и продукты питания с пробиотиками должны соответствовать таким требованиям:
- содержать достаточное количество живых и активных пробиотических бактерий, безопасных и полезных для здоровья человека, устойчивых к действию желудочного, кишечного соков и желчи;
- обладать антагонистическими свойствами по отношению к условнопатогенным и патогенным бактериям;
- стимулировать рост полезных микроорганизмов в кишечнике;
- проявлять иммуномодулирующую способность.
Сегодня продукты с приставкой «био» или «пробио» можно встретить на прилавках практически каждого магазина. К категории биопродуктов относятся те, которые содержат в одном грамме не менее чем 107 пробио-тических бактерий. Кисломолочный продукт «Actimel» относится к новому поколению продуктов с пробиотической активностью. «Actimel» содержит две стандартные йогуртовые культуры Lactobacillus bulgaricus (107 КОЕ/мл) и Streptococcus thermophilus (108 КОЕ/мл) и специальный пробиотический штамм Lactobacillus casei DN-114 001 (108КОЕ/мл). Биойогурт, помимо живых йогуртовых культур, содержит пробиотиче-ские организмы - бифидо- или лактобакте-рии - в количестве не менее 106 КОЕ на 1 грамм продукта к моменту окончания срока годности.
Как известно, кефир - это кисломолочный продукт, в котором главную роль играют кефирные грибки, представляющие собой небольшие комочки различной формы серовато-желтого цвета. Ранние исследования подтверждают предположения, полученные в ре-
зультате многочисленных современных исследований. Кефирный грибок действительно представляет собой сложный симбиоз (совместное существование) нескольких микроорганизмов, образовавшихся в процессе длительного развития и сосуществования. Сжившиеся микроорганизмы ведут себя как целостный организм: они вместе растут, размножаются и передают свою структуру и свойства последующим поколениям грибков. Основную микрофлору кефирных грибков составляют три вида микроорганизмов: молочнокислые палочки, стрептококки и дрожжи, которые вызывают спиртовое брожение. И тут есть один большой недостаток -дрожжи продолжают «работать» даже в холодильнике. В конечном итоге продукт через 10 дней теряет товарный вид и потребительские свойства. Однако кроме названных бактерий в состав кефирных грибков входят также уксуснокислые бактерии и ароматоб-разующие микроорганизмы. Именно эти микроорганизмы определяют специфический вкус, аромат кефира и его питательные качества. Позже классический кефир был радикально усовершенствован. По миру прокатилась волна популярности дополнительно обогащенного бактериями кисломолочного продукта - биокефира, который содержит ацидофильную палочку и бифидо-бактерии, но не содержит дрожжи, поэтому хранится значительно дольше.
Результаты микробиологических и физико-химических исследований ряда молочнокислых продуктов, широко используемых жителями г. Харькова, представлены в табл. 1.
Таблица 1 Данные микробиологических и физиологических исследований кисломолочных продуктов
Кисломолочный продукт
Биойогурт «Биобаланс»
2,9-108
Наличие дрожжей
нет
рН
4,00
Биокефир «Веселый молочник» 4,8-108 нет 3,96
Кефир «Хуторок» 2,6-106 почкующиеся дрожжи 4,17
«Актимель» 3,6107 нет 3,76
Как свидетельствуют данные табл. 1, исследованные биопродукты (биойогурт «Биобаланс», биокефир «Веселый молочник») соответствуют требованиям по показателю концентрация кисломолочных бактерий (107кл/мл). Обозначенное на упаковке биойогурта требование по качеству - наличие бифидобактерий - не соответствовало данным, полученным путем микробиологических исследований, - бифидобактерии не были обнаружены. В продукте Актимель концентрация молочнокислых бактерий была ниже требуемой. В кефире были обнаружены: дрожжевые клетки и споровые микроорганизмы, что свидетельствовало об истека-нии срока годности продукта.
Микроскопирование активного ила
В лабораторных экспериментах было получено существенное подавление развития нитчатых бактерий и снижение илового индекса.
Жизнедеятельность активного ила в биологических очистных сооружениях обеспечивает сорбцию загрязнений из сточных вод, деструкцию загрязнений и эффективное отделение очищенной жидкости от биомассы. Активность этих процессов зависит от многих факторов, в том числе - видового состава микрофлоры и микрофауны, кислородного режима, физико-технических параметров и др. [4-8].
Рис. 1. Объем ила после 30-минутного отстаивания: 1, 2, 3 - различные варианты подавления «вспухания» ила; 4 -контрольный вариант
Микрофлора активного ила представлена одноклеточными бактериями, нитчатыми бактериями, актиномицетами, грибами, водорослями. Бактерии активного ила относятся, главным образом, к а и |3 - мезосапробным группам, видовой состав которых зависит от состава сточных вод (концентрации биогенных элементов, содержащих их соединений, количественных соотношений между ними и др.). Именно бактериям принадлежит основная роль в минерализации растворенных органических и неорганических загрязнений. Микрофауна активного ила представлена в основном одноклеточными животными -простейшими. В иле присутствуют также более сложно организованные животные - коловратки, круглые черви, клещи, а также личинки и куколки насекомых. В биоценозах активных илов встречаются следующие представители простейших: саркодовые ^аг-codina), жгутиковые (Mistigophoгa), реснитчатые инфузории (СШа1а), сосущие инфузории ^иСюйа). Простейшие способствуют осветлению воды, рыхлят биопленку, обуславливают омоложение микробиоценоза, увеличивают коэффициент зооглейности. В активных илах высокого качества на 106 бактериальных клеток должно быть 10-16 простейших микроорганизмов. Простейшие являются хорошим индикатором эффективности биологической очистки воды [8-12].
Для трофической цепи в экосистеме активного ила характерно три уровня: первый представлен бактериями, второй - инфузориями и коловратками, третий - хищными инфузориями. При нормальной работе аэротенков устанавливается равновесие между всеми представителями микрофлоры и микрофауны. Нарушение этого равновесия является предупреждением об ухудшении работы очистного сооружения, т. к. изменение численного состава микробного населения в активном иле предшествует заметному изменению физико-химических свойств очищаемой сточной воды [8, 12, 16].
Способность активного ила образовывать прочные, быстро оседающие хлопья является одним из основных его свойств, используемых для организации процесса биологической очистки сточных вод в системе аэро-тенк - вторичный отстойник. Потенциальная способность активного ила к осаждению оценивается иловым индексом - объемом (мл),
который занимает один грамм по сухому веществу активного ила через полчаса отстаивания [10]. Обычно иловый индекс активного ила составляет 80 - 150 мл/г. В том случае, если иловый индекс ниже 80 мл/г, может наблюдаться повышенная мутность надосадочной жидкости. При иловом индексе выше 150 мл/г при гидравлических нагрузках на вторичные отстойники выше 1,5 м3/(м2Хч) и недостаточной их глубине наблюдается вынос ила из вторичных отстойников [12].
Морфологические исследования показали, что в активном иле с идеальной способностью к осаждению (иловый индекс 80 -120 мл/г) всегда присутствует некоторое количество нитчатых микроорганизмов. При этом нитчатые формы играют существенную роль в создании прочных и больших (100 -2000 мкм) хлопьев активного ила [12].
При чрезмерном развитии нитчатых форм в активном иле принято употреблять термин «нитчатое вспухание». Обычно это явление наступает, когда общая длина нитчатых форм достигает 107 мкм/мл или 104 м/г. Развитие такого активного ила приводит к уменьшению объема надосадочной жидкости, выносу иловых частиц вместе с очищенной водой и снижению концентрации активного ила в рециркуляционном потоке.
Микробные клетки в смешанных культурах, таких как активный ил, могут быть представлены двумя формами: свободноплавающими отдельными клетками и агрегатами отдельных клеток (хлопки, биопленка). Отдельные клетки находятся в прямом контакте со средой культивирования, так что диффузионное сопротивление среды для них весьма незначительно или даже отсутствует. В системах идеального вытеснения, подобных реально существующим сооружениям, маленькие и легкие индивидуальные клетки не могут удерживаться и легко вымываются. Хлопки и биопленка дают возможность клеткам удерживаться в круговороте системы в месте, в котором субстраты доступны в течение продолжительного периода времени. Однако это преимущество сопровождается затруднением процессов диффузии питательных субстратов вовнутрь этих образований.
Рост в форме нитей представляется идеальной комбинацией двух этих форм роста. Фак-
тически нити (трихомы) являются цепочками индивидуальных клеток, для которых характерен массообмен почти такой же, как для индивидуальных клеток, а способность удерживаться в сооружениях приближается к хлопьям или прикрепленной биомассе.
Зеленые и сине-зеленые водоросли также растут в различных формах. В сообществе планктона в стоячей воде (в озерах, прудах) отдельно растущие или колониеобразующие водоросли являются преобладающим типом, в то время как нитчатые типы (например, Sti-geoclonium, С^ор^га, Oscillatoгia, Р^г-midium) обычно располагаются в бентосе. Вероятно, что росту нитчатых форм благоприятствуют:
- низкие концентрации субстратов;
- несколько повышенная турбулентность и течение культуральной среды.
В аэротенке микробные популяции активного ила жестко конкурируют за питательные субстраты. Виды, которые способны потреблять больше питательных элементов, могут стать доминирующей популяцией. Если доминировать будут нитчатые организмы, возникнет вспухание активного ила. Кроме того, присутствие некоторых компонентов в поступающих на очистку сточных водах, особенно восстановленных соединений серы (включая Н^), может стимулировать рост некоторых нитчатых бактерий.
Известно более 30 разных видов, преимущественно бактерий, в той или иной степени вызывающих вспухание активного ила. Большинство бактерий не имеют названий, а обладают номером, так как их характеристики еще не полностью известны. Из этих 30 видов бактерий около 10 видов часто вызывают эксплуатационные проблемы, в то время как другие 20 видов редко наблюдаются в активном иле.
Пока количество нитчатых микроорганизмов ограничено, их присутствие не оказывает никакого измеримого эффекта на работу очистных сооружений. Однако увеличение в популяции обычно приводит к уменьшению скорости осаждения хлопьев, что вызывает ухудшение илового индекса активного ила. Это явление известно как «вспухание активного ила». Как только иловый индекс дости-
гает значения 150 мл/г, происходит вспухание активного ила.
Известно также зооглейное вспухание активного ила - разновидность вспухания активного ила, в котором нитчатые микроорганизмы не принимают участия.
Вспухание активного ила может быть причиной серьезных эксплуатационных проблем и увеличить затраты на очистку сточных вод. Проблемы составляют, главным образом, высокий риск потери активного ила с выходящим очищенным потоком и ухудшение плотности и водоотдачи ила.
По данным [9], в 50 - 60 годы прошлого столетия вспухание ила со значением илового индекса 400 - 600 мл/г, а иногда и выше, происходило очень часто (на 50 - 60 % всех очистных сооружений). Однако за последние тридцать лет информация о методах, предотвращающих вспухание ила, значительно увеличилась. Процессы стабилизации ситуации с вспуханием ила значительно улучшились, особенно на бытовых очистных сооружениях. Так, на голландских бытовых очистных сооружениях вспухание активного ила наблюдается изредка, в основном зимой, но иловый индекс обычно остается на уровне 250 - 300 мл/г. Наоборот вспухание ила на многих промышленных очистных сооружениях до сих пор является причиной серьезных эксплуатационных проблем, особенно на сооружениях с высокими концентрациями в сточной воде легко биоразлагаемых соединений (сельское хозяйство).
Если микроскопическое исследование активного ила не включено в программу мониторинга (наблюдения) на очистных соору-же-ниях, увеличение количества нитчатых микроорганизмов может быть обнаружено только при значительном ухудшении скорости осаждения активного ила. Первоначально осаждаемый объем увеличивается постепенно, а затем повышается по экспоненте. Это является причиной того, что вспухание ила часто застает врасплох операторов, контролирующих процесс очистки. С помощью обычных микроскопических исследований рост нитчатых (= увеличение индекса нитча-тости) может быть быстро замечен, и меры по его подавлению будут вовремя приняты.
Выводы
1. Для оценки экологической безопасности и пищевой ценности различных молочнокислых продуктов (биойогурт «Биобаланс», биокефир «Веселый молочник», Актимель, кефир «Хуторок») использовали метод прямого микроскопирования препаратов.
2. При микроскопировании контролировали общую численность палочковидных бактерий и Г-подобных бифидобактерий методом прямого счета в камере Горяева.
3. Из всех исследованных продуктов по данным микроскопирования требованиям экологической безопасности наиболее соответствуют биокефир «Веселый молочник», биойогурт «Биобаланс».
Литература
1. Биопродукты - продукты будущего / Стен-
фельдт Э., Шаманова Г. // Мол. пром-сть. - 2000. - №11. - С.20 - 21.
2. Кисломолочные продукты нового поколе-
ния / Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Сундукова М.Б. // Мол. пром-сть. -1999. - №7. - С.29 - 30.
3. Пробиотический кисломолочный продукт
для школьников / Эрвольдер Н.Ю. // Мол. пром-сть. - 1999. - №11. - С.17 -19.
4. Пробиотический кисломолочный продукт
для школьников / Эрвольдер Н.Ю. // Мол. пром-сть. - 1999. - №11. - С.17 -19.
5. Фiзико-хiмiчнi основи очищення сичних
вод / Щд ред. А.К. Запольського. - К.: Лiбра, 2001. - 302 с.
6. Роговская Ц.И. Биохимический метод
очистки производственных сточных вод.
- М.: Изд-во литературы по строит., 1967. - 138 с.
7. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставс
кая С.С. Микробиологическая деструкция синтетических органических веществ. - К.: Наукова думка, 1975. - 222 с.
8. Карюхина Т.А., Чурбанова И.Н. Химия
воды и микробиология. - М.: Стройиз-дат, 1995. - 208 с.
9. Eikelboom D.H., Process Control of Activ-
ated Sludge Plants by Microscopic Investigation. London: IWA Publishing, 2000. -156 p.
10. Липеровская Е.С. Гидробиологические индикаторы состояния активного ила и их роль в биологической очистке сточных вод // Итоги науки и техники. Общая экология. Биоценология. Гидробиология. - Т. 4. - ВИНИТИ АН СССР. -М., 1977. - С.169 - 217.
11. Методика проведения технологического
контроля работы очистных сооружений городских канализаций / Под ред. О.Т. Болотина. - М.: Стройиздат, 1971. -231 с.
12. Вербина Н.М. Гидромикробиология с основами общей микробиологии. - М.: Пищевая промышленность, 1980. - 288 с.
13. Wanner, J. Activated Sludge Bulking and
Foaming Control. - Technomic Publishing Co., Inc., USA, 1994. - 327 p. ISBN 156676-121.
Рецензент: А.В. Гриценко, профессор, д.геогр.н., ХНАДУ.
Статья поступила в редакцию 17 сентября 2008 г.
