CC BY
163
УДК 502.55: 631.461
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ РЕКУЛЬТИВАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ
© А. С. Григориади1* Н. А. Киреева1, А. Р. Гареева1, Т. Н. Щемелинина2,
О. С. Атепаева1
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел/факс: +7 (347) 273 6712.
E-mail: [email protected] 2Институт биологии Коми научного центра УрО РАН Россия, Республика Коми, 167982 г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28.
E-mail: [email protected]
Были проведены исследования по оценке влияния нефтяного загрязнения на различные типы почв и их рекультивации с использованием специализированного углеводородокисляюще-го биопрепарата. Исследования биологической активности почвы показали положительную динамику развития групп микроорганизмов, участвующих в деградации нефтяных углеводородов. Ферментативная активность рекультивируемого чернозема обыкновенного была выше, чем в серой лесной почве.
Ключевые слова: нефтяное загрязнение, серая лесная почва, чернозем обыкновенный, биоремедиация, Универсал, биологическая активность.
В связи с увеличением площадей земель, загрязненных нефтью и ее компонентами, проблема охраны почв приобретает все большее значение. Вопросам реабилитации природных объектов уделяется особое внимание, в частности, разрабатываются различные методы очистки и восстановления биологической активности почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Наиболее перспективным направлением ремедиации нефтезагрязненных объектов является применение биологического метода, основанного на потенциале почвенных микроорганизмов трансформировать поллютанты различного состава и происхождения [1-3].
Целью данной работы была оценка состояния почв различного типа, загрязненных нефтью, и рекультивируемых биопреператом, по показателям биологической активности.
Материалы и методы
В качестве объекта изучения использовали почву двух типов: чернозем обыкновенный, отобранный на территории Краснодарского края, и серая лесная почва, отобранная на территории республики Башкортостан. Почва загрязнялась товарной нефтью Туймазинского месторождения в концентрациях 1, 4 и 8% по массе. Сосуды инкубировались при температуре 24 °С; влажность почвы поддерживалась на уровне 60%. Образцы почвы для анализов отбирались через 3, 30 и 90 сут с начала эксперимента.
В качестве рекультивирующего фактора применялся бактериальный препарат Универсал, используемый ранее для восстановления нефтезаг-рязненных почв в условиях Крайнего Севера [4]. Препарат основан на углеводородокисляющем штамме Rhodococcus sp., выделенном из нефтезаг-рязненных почв Усинского и Возейского месторождений Республики Коми. Биопрепарат не токсичен, про проявляет патогенных свойств, не облада-
ет кумулятивным действием и не способен к образованию токсичных соединений.
Содержание нефтяных углеводородов в почве определялось весовым методом после экстракции углеводородов из навески почвы четыреххлористым углеродом [5]. Определение окислительновосстановительного потенциала почвы определяли с использованием платинового индикаторного электрода [6]. При изучении окислительновосстановительного режима исследуемых почв была использована шкала интенсивности окислительно-восстановительных условий для серой лесной почвы, предложенная Е. И. Горшковой и В. Г. Саа-кян [7]. Состояние почвы оценивалось по изменению численности некоторых физиологических групп микроорганизмов и активности ферментов. Численность микроорганизмов определяли по общепринятому методу посева на жидкие и агаризи-рованные среды [8]. Каталазная активность определялась газометрическим, а дегидрогеназная активность - спекрофотометрическим методом [9].
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ 8Шй8йса 6.0.
Результаты и обсуждение
Известно, что ферментативная активность отражает интенсивность процессов очищения почвы от нефти и нефтепродуктов. Одними из важнейших индикаторных ферментов, в том числе и для оценки интенсивности процессов очистки почвы от нефтепродуктов, являются каталаза и дегидрогеназа.
Уровень каталазной активности в черноземе обыкновенном был выше, чем в серой лесной почве, как в фоновых образцах, так и в загрязненных и рекультивируемых (табл. 1). Загрязнение почв нефтью ингибировало активность каталазы. Следует заметить, что процессы самовосстановления уровня ферментативной активности после нефтяного загрязнения быстрее начинались в серой лесной
* автор, ответственный за переписку
почве, чем в черноземе, что может свидетельствовать о меньшей устойчивости последнего к загряз -нению нефтяными углеводородами.
Исследования показали, что использование Универсала для рекультивации серой лесной почвы, загрязненной нефтью, не привело к однозначным результатам. Положительное влияние отмечалось через 30 сут с начала эксперимента. Но уже через 90 сут показатели активности каталазы в образцах загрязненной почвы были выше, чем в рекультивируемой, однако все значения превышали фоновый уровень активности фермента.
Внесение биопрепарата в чернозем обыкновенный, загрязненный нефтяными углеводородами, положительно повлияло на динамику изменения активности каталазы как в начале эксперимента, так и спустя 30 и 90 сут. В рекультивируемом черноземе значения каталазной активности значительно превышали значения показателей контроля при концентрации поллютанта > 4%. Максимальный уровень был зарегистрирован в образцах, загрязненных нефтью в концентрации 8%.
Внесение нефти оказало ингибирующее влияние на активность дегидрогеназы в начале эксперимента. Минимальные значения показателя отмечались через
30 сут во всех образцах нефтезагрязненной почвы. В дальнейшем активность фермента начинала возрастать, видимо, в результате адаптации микроорганизмов - продуцентов ферментов к экстремальным условиям, созданным внесением поллютантов и началом процессов самоочищения почвы.
Применение Универсала не оказало явного стимулирующего влияния на дегидрогеназную активность в образцах серой лесной почвы, загрязненной нефтью. Значения показателей в необработанной почве превышали соответствующие значения в вариантах с биопрепаратом в 2 раза, и были выше, чем в контрольных образцах.
Нашими исследованиями показано, что обработка биопрепаратом чернозема обыкновенного, загрязненного нефтью, привела к значительному стимулированию активности дегидрогеназы (рис. 1).
Изменения микробиологических параметров почвы являются одними из первых, которые могут рассматриваться как значимые экологические нарушения. Поэтому при изучении влияния нефти на почвенную экосистему, обычно используют показатели численности различных групп почвенных микроорганизмов.
Таблица 1
Динамика активности каталазы в серой лесной почве и черноземе обыкновенном, при загрязнении нефтью и рекультивации
биопрепаратом, мл О2/г почвы
Вариант опыта Загрязнение/рекультивация
3 суток 30 суток 90 суток
Серая лесная почва (Башкирия)
Контроль Нефть 1% Нефть 4% Нефть 8%
1.81 ±0.17 2.19±0.19
2.5З±0.17
2.82±0.16
1.47+0.04
1.6З±0.09
1.47±0.08
1.7З±0.06
2.З5±0.008
2.З2±0.010
2.24±0.089
2.1З±0.090
2.З6±0.040
2.47±0.050
2.З5±0.04З
2.48±0.010
1.77±0.27
2.21±0.З9
2.76±0.29
2.18±0.20
2.9З±0.6З
2.З5±0.З0
З.8З±0.54
2.ЗЗ±0.З9
Чернозем обыкновенный (Краснодарский край)
Контроль Нефть 1% Нефть 4% Нефть 8%
5.00±0.8З
З.9З±0.47
З.5З±0.49
4.62±0.49
4.04±0.З9
4.56±0.58
З.47±0.6З
4.З0±0.52
4.95±0.З5
З.45±0.41
4.52±0.З1
5.00±0.71
5.08±0.46
6.0З±0.41
5.78±0.48
7.24±0.З6
4.7З±0.47
З.74±0.З7
З.67±0.18
4.84±0.З8
З.69±0.20
6.8З±0.51
4.86±0.19
6.67±0.З9
без обработки обработка Универсалом
Рис. 1. Активность дегидрогеназы в загрязненной и рекультивируемой почве (90 сут).
Нефть ингибировала развитие микроорганизмов, использующих органические формы азота, в начале эксперимента (3 сут) в образцах серой лесной почвы. Через 30 сут значения этого показателя возрастали в вариантах опытов с 1% и 4% нефти, что, возможно, связано с периодом адаптации микроорганизмов к новым сложившимся условиям окружающей среды. Кроме того, легкие фракции нефти обладают повышенной токсичностью для живых организмов, в то же время их высокая испаряемость способствует быстрому самоочищению компонентов природной среды и, соответственно, восстановлению биологических показателей. В дальнейшем, численность начинала постепенно снижаться. Внесение биопрепарата существенно не повлияло на динамику численности данной группы микроорганизмов. Заметная положительная динамика отмечалась только через 90 сут в образцах, загрязненных нефтью в концентрациях 4 и 8% (табл. 2). Аналогичные результаты были получена при анализе образцов чернозема обыкновенного. Однако значения показателей микробиологической активности чернозема были значительно выше и действие препарата проявилось активнее. Например, через 90 сут в нефтезагрязненных образцах Универсал способствовал росту численности гетеротрофов в 4 и 7 раз при содержании в почве поллютанта 4 и 8% соответственно (табл. 2).
Поступление нефтяных углеводородов в серую лесную почву стимулировало развитие микроорганизмов, использующих минеральные формы азота. С течением времени стимулирующий эффект усиливался. Внесение препарата не оказало влияния на данный показатель в пробах, с содержанием поллютанта 4% (табл. 2). В образцах, загрязненных
нефтью в концентрации 1% и 8% препарат оказал некоторый стимулирующий эффект: значения этого показателя, характеризующего образцы почв, обработанных Универсалом, в 2 раза превышали аналогичные значения необработанной почвы.
При исследовании влияния загрязнения и рекультивации на микроорганизмы, учитываемые на КАА, чернозема обыкновенного, было выявлено, что на них нефть оказала более выраженное влияние, чем на ту же группу микроорганизмов серой лесной почвы. Загрязнение нефтью приводило к резкому возрастанию численности микроорганизмов, использующих минеральные формы азота (исключение составил вариант с 1% нефти). Внесение биопрепарата привело к усилению развития этих микроорганизмов, причем эффект сохранялся на протяжении всего эксперимента.
Внесение нефтяных углеводородов в почву также приводило к росту специфической группы микроорганизмов, отвечающей за деструкцию пол-лютанта. Соответственно, с увеличением концентрации поллютанта в почве, увеличивалась и численность рассматриваемой группы микроорганизмов. Эта динамика отмечалась и при загрязнении нефтью (рис. 2).
При внесении биопрепарата Универсал численность УОМ возрастала уже через 30 сут с начала эксперимента. При высокой концентрации нефти (4 и 8% масс.) отмечалось первоначальное токсическое действе на УОМ. Однако через 90 сут значения показателя значительно превышали соответствующие значения в необработанных почвах. Аналогичная динамика наблюдалась при рекультивации чернозема обыкновенного.
Таблица 2
Численности различных групп микроорганизмов в нефтезагрязненной серой лесной почве и черноземе обыкновенном при
рекультивации Универсалом (90 сут)
Варианты опыта Г етеротрофные микроорганизмы, 105 КОЕ/г почвы Микроорганизмы, использующие минеральные формы азота, 105 КОЕ/г почвы
Чернозем обыкновенный Серая лесная почва Чернозем обыкновенный Серая лесная почва
Контроль 128.3±8.8 70.0+1.5 158.3±12.0 23.0+1.1
Нефть 1% 160.0±4.3 56.7+1.3 32.2±2.7 91.0+2.1
Нефть 1%+ Универсал 176.1±6.3 63.3±2.8 86.1 ±2.5 102.0+3.2
Нефть 4% 110.3±9.6 60.0±3.5 120.7±6.4 56.0+3.3
Нефть 4%+ Универсал 461.5±7.2 73.3+1.9* 150.7±7.2* 53.6+1.8
Нефть 8% 81.7±7.1 66.7+2.5 87.8±3.6 45.0+1.5
Нефть 8%+ Универсал 581.8±17.1 80.0+2.1 207.0±6.8 54.3+2.2
Примечание: звездочкой (*) отмечены значения, не отличающиеся от контроля по критерию Стьюдента с достоверностью
0.95.
А
3 сут
180 -г
160-
Л 140-
(? О с 120 -
Гт1
о кю-
о 80-
с
Я 60-
с)
40-
20-
0-
Б
UL
к
&
А >.4' А ^ А в?
30 сут
90 сут
Рис. 2. Динамика численности углеводородокисляющих микроорганизмов в серой лесной почве (А) и черноземе обыкновенном (Б), загрязненных нефтью и рекультивируемых Универсалом
В формировании химических свойств почв, их генетических профилей и плодородия одно из ведущих мест занимают окислительно-восстановительные (ОВ) процессы. В ходе проведенных лабораторных опытов было установлено, что спустя 14 сут после начала опыта ОВ-режим образцов, загрязненных нефтью в концентрации 4% и обработанной Универсалом, изменился с интенсивно восстановленного на сильно восстановленный. Через 30 суток инкубирования ОВ-потенциал в пробах нефтезаг-рязненной и рекультивируемой (1% масс.) стал слабо окислительным. В остальных вариантах загрязнения потенциал варьировал от слабо восстановительного до интенсивно восстановительного (табл. 3).
Таблица 3
Влияние различных концентраций нефти и биорекультивации на окислительно-восстановительный потенциал почв (мВ)
Варианты опыта Сроки отбора проб, суток
3 сут 14 сут 30 сут
Контроль 606 492 586
Контроль + Универсал 566 407 477
Нефть 1% 456 468 518
Нефть 4 % 346 345 361
Нефть 8% 342 307 288
Нефть 1% + Универсал 412 422 537
Нефть 4% + Универсал 337 398 371
Нефть 8% + Универсал 372 373 349
Из полученных данных можно сделать вывод, что при загрязнении нефтью происходит общее снижение окислительно-восстановительного потенциала в сторону восстановительных процессов. Это обусловлено снижением аэрации почв, закупоркой пор, склеиванием структурных отдельностей, увеличением органического вещества. Биопрепарат «Универсал» во всех вариантах опыта способствовало увеличению ОВП в сторону окислительных процессов на 25-100 мВ, что говорит о положительном влиянии добавления последнего.
Таким образом, внесение углеводородокис-ляющего препарата Универсал способствовало положительной динамике развития тех групп микроорганизмов, которые участвуют в деградации нефтяных углеводородов. Следует отметить, что внесение препарата Универсал оказало больший стимулирующий эффект на ферментативную активность чернозема в сравнении с серой лесной почвой. Этот факт, возможно, объясняется тем, что при соответствующих мероприятиях по рекультивации черноземы обладают большим потенциалом биоло-
гической активности, чем серая лесная почва умеренной полосы. Однако способность к самовосстановлению у серой лесной почвы выше.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вельков В. В. // Биотехнология. 1995. № 3-4. С. 20-27.
2. Карасева Э. В., Гирич И. Е., Худокормов А. А., Алешина Н. Ю., Карасев С. Г. // Биотехнология. 2005. №2. С. 67-72.
3. Логинов О. Н., Силищев Н. Н., Бойко Т. Ф., Галимзянова Н. Ф. Биорекультивация: микробиологические технологии очистки нефтезагрязненных почв и техногенных отходов. М.: Наука, 2009. 112с.
4. Щемелинина Т.С. Биологическая активность нефтезагряз-ненных почв Крайнего Севера на разных стадиях их восстановления и при рекультивации (на примере Усинского района республики Коми). Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Воронеж, 2008. 24 с.
5. Mc Gill W. W., Rowell M. J. // Sci. Tot. Environ. 1980. V. 14, №3. P. 245-253.
6. Агрохимические методы исследования почв. / Под ред. А. В. Соколова. М.: Наука, 1975. 656 с.
7. Горшкова Е.И., Саакян В. Г. // Вестник МГУ. Сер. 17. Почвоведение.1985. №4. С. 42-48.
8. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304с.
9. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 2005. 252 с.
Поступила в редакцию 27.08.2011 г.
