CC BY
89
УДК 615.4:615.2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЭТСХ И ВЭЖХ В РАЗРАБОТКЕ ЭКСТРАКТА ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКОГО
© В.П. Фогт, А.С. Степанов, Т.А. Степанова
Дальневосточный государственный медицинский университет,
ул. Муравьева-Амурского, 31, Хабаровск, 680000 (Россия) E-mail: [email protected]
Представлены результаты исследования химического состава экстракта жидкого противодиабетического. В качестве методов исследования выбраны ВЭТСХ и ВЭЖХ. изучался флавоноидный состав экстрактов, полученных с использованием в качестве экстрагента спирта этилового 40 и 70%, и экстракта, полученного по технологии, предлагаемой к производству. Проведено сравнение химического состава экстракта и настоя. Показано преимущество экстракта перед настоем.
Ключевые слова: экстракт противодиабетический.
Введение
В предварительно проведенных исследованиях по обоснованию возможности разработки готовой лекарственной формы на основе прописи сахароснижающего сбора было показано сходство качественного химического состава сбора, настоя и экстракта жидкого. Сравнительный анализ комплекса биологически активных веществ (БАВ) исследуемых объектов проводился для широкого спектра веществ: флавоноидов, дубильных веществ, органических кислот, полисахаридов, кумаринов, сапонинов, простых фенолов. По результатам количественного определения флавоноидов, экстрактивных и дубильных веществ в настое и экстракте были рассчитаны процентная концентрация и выход. Для экстракта оба показателя оказались достоверно выше, чем для настоя [1].
В связи с тем, что стандартизацию препарата предполагается проводить по содержанию флавоноидов, была поставлена цель - используя современные методы высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), обосновать способ получения экстракта по содержанию флавоноидов. Для достижения поставленной цели необходимо было сравнить комплекс БАВ экстрактов, полученных с применением в качестве экстрагента спирта этилового 40 и 70% , оценить содержание флавоноидов в экстракте, полученном по предлагаемой к производству технологии, а также сравнить его по флавоноидному составу с настоем.
Экспериментальная часть
Для решения первой задачи были приготовлены экстракты на 40 и 70% спирте методом перколяции смеси сырьевых источников. Вторая задача решалась с образцами препарата, полученными методом реперколя-ции 40% этанолом послойно загруженных сырьевых компонентов, ранжированных по содержанию экстрактивных веществ. Экстракт сравнивали с настоем, приготовленным по ГФ XI из сырья одних и тех же серий.
Полученные препараты предварительно фракционировались. Для этого к 50 мл экстракта и 150 мл настоя прибавляли спирт этиловый 95% в соотношении 1 : 4 и нагревали в течение пяти минут на кипящей водяной бане. Через час осадок полисахаридов отфильтровывали через бумажный фильтр. Спирт из фильтрата удалялся на ротационном испарителе иР-1М2. Очистка водного остатка от липофильных веществ осу-
* Автор, с которым следует вести переписку.
76
В.П. Фогт, А.С. Степанов, Т.А. Степанова
ществлялась пятикратной экстракцией хлороформом в соотношении 1 : 1 с водной фазой. Дальнейшее разделение суммы веществ проводилось 3-5-кратной экстракцией этилацетатом до прекращения окрашивания этилацетатного слоя в желтый цвет. Аналогично осуществлялась последовательная экстракция бутанолом. Контроль фракций на наличие флавоноидов проводили хроматографически. Анализ показал целесообразность использования в качестве рабочих этилацетатную и бутанольную фракции. Последние освобождались от растворителей на ИР-1М2. Сухой остаток этилацетатной и бутанольной фракций растворялся в 2 мл спирта этилового 95 и 70% соответственно. Расчет количества флавоноидов проводился в пересчете на 100 мл препарата.
Для расчета выхода флавоноидов в извлечения из 100 г сырья было проведено количественное определение их содержания в исходном сырье. Извлечения были получены путем трехкратной экстракции сырья спиртом этиловым 70% в соотношении 1 : 50 в течение 30 мин на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Фракционирование извлечения проводилось описанным выше способом. Подготовленные фракции экстрактов анализировались методом ВЭТСХ и ВЭЖХ. Для ВЭТСХ использовались пластинки ПТСХ-В «Sorbfil», в качестве элюирующих следующие системы: толуол - этилацетат - муравьиная кислота в соотношении 4 : 4 : 2 (I) и этилацетат - метанол - вода в соотношении 100 : 17 : 13 (II). Проявление хроматограмм осуществлялось с помощью раствора алюминия хлорида. В качестве веществ сравнения использовались ГСО рутина и кверцетина, РСО гиперозида, кемпферола, кофейной, галловой и хлорогеновой кислот.
По методу ВЭЖХ пробы вводились в хроматограф марки «Agilent Technologies 1100 Series», снабженный градиентным насосом Agilent 1100, термостатом A 1100, устройством A 1100 для введения образцов и УФ-детектором с изменяемой длиной волны A 1100. Детектирование осуществлялось при длине волны 365 нм на колонке Eclipse SDB C-18 4,6x250 мм в режиме изократического элюирования при температуре 25 °С в течение 10 мин. В качестве подвижной фазы использовалась система растворителей вода - ацетонитрил -ледяная уксусная кислота в соотношении 164 : 36 : 2. Скорость потока элюента - 1 мл/мин. Качественный анализ индивидуальных соединений проводился путем сопоставления времен удерживания пиков, полученных на хроматограммах анализируемых проб с временами удерживания пиков, полученных при элюировании стандартных растворов анализируемых веществ.
Результаты и обсуждение
В решении первой задачи применение метода ВЭТСХ позволило подтвердить присутствие в 40 и 70% экстрактах не менее 18 веществ, из них 13 флавоноидной природы. Химический состав анализируемых извлечений качественных различий практически не имеет. Различие существует в количественном содержании веществ, что визуально наблюдается по интенсивности свечения пятен в УФ свете: большей интенсивностью свечения обладают зоны адсорбции, соответствующие 70% экстракту. Часть веществ удалось определить. В системе II в этилацетатных фракциях экстрактов идентифицированы рутин, гиперозид, кверцетин. В системе I подтверждено наличие кемпферола. В обеих системах для 40 и 70% экстрактов установлено присутствие хлорогеновой кислоты. В системе I в видимой области идентифицирована галловая кислота. В результате анализа хроматограмм возникло предположение о присутствии в препаратах кофейной кислоты. Данные ВЭЖХ подтвердили результаты исследования ВЭТСХ по наличию в обоих экстрактах кофейной кислоты (Rt = 4,3 мин), рутина (Rt = 4,5 мин) и гиперозида (Rt = 5,0 мин).
По результатам ВЭЖХ рассчитано количественное содержание рутина и гиперозида в исследуемых экстрактах и проведено сравнение по названному критерию с 40% экстрактом, полученным методом реперко-ляции с послойной загрузкой сырья в перколяторы. Результаты представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы, существенное различие между 40 и 70% экстрактами наблюдается только по содержанию гиперозида. Метод реперколяции позволяет увеличить выход гиперозида, используя в качестве экстрагента спирта этилового 40%, до уровня его содержания в 70% экстракте. Рутин в хроматографических профилях экстрактов представлен минорным веществом многокомпонентной смеси.
Решение второй задачи заключалось в сопоставлении хроматографических профилей настоя и экстракта, что представляется наиболее эффективным в реализации аналогичных задач [2]. Для сравнения компонентного состава биологически активного комплекса настоя и экстракта, полученных из сырья одних и тех же серий, сопоставлялись интегральные хроматографические профили водного и спирто-водного извлечений. Существенных различий в хроматографической картине настоя и экстракта не наблюдалось.
Рассчитанное процентное содержание флавоноидов в сырье и препаратах и их выход приведены в таблице 2.
Таблица 1. Содержание флавоноидов в экстрактах, полученных по разным технологическим схемам, мг/мл
Перколяция смеси растительных компонентов Реперколяция послойно загруженного сырья
Экстрагент 40% этанол 70% этанол 40% этанол
Рутин 0,014 0,013 0,013
Гиперозид 0,21 0,33 0,34
Таблица 2. Содержание рутина и гиперозида в сборе, настое и экстракте
Лекарственная форма БАВ Содержание в сырье, мг/г Содержание в препарате, мг/мл Выход, %
Настой рутин 0,053 0,00051 15,40
гиперозид 0,92 0,0075 13,04
Экстракт рутин 0,053 0,015 28,30
гиперозид 0,92 0,26 28,26
Относительный выход флавоноидов в препараты в процентах рассчитывался по формуле:
Выход, % = ~1М%,
С
где Спр. - содержание флавоноидов в препарате, мг/мл; Ссырье - содержание флавоноидов в абсолютно сухом сырье, мг/г; Кразв. - коэффициент, показывающий объем препарата, полученный из 1 г сырья, мл. Для настоя Кразв. равен 16 мл, для экстракта - 1 мл.
Сравнивая выход флавоноидов в настой и экстракт, следует отметить преимущество выбранного метода получения экстракта перед используемым способом получения настоя по эффективности экстрагирования сырья почти в 2 раза, что подтверждает данные спектрофотометрического определения [1].
Выводы
1. Методами ВЭТСХ и ВЭЖХ был проведен качественный и количественный сравнительный анализ комплекса флавоноидов извлечений на 40 и 70% спирте этиловом.
2. Показана рациональность применения метода реперколяции в производстве экстракта противодиабе-тического по содержанию гиперозида.
3. Показано преимущество экстракта перед настоем по содержанию рутина и гиперозида в препарате.
Список литературы
1. Фогт В.П., Цимбалист Н.А., Степанов А.С., Степанова Т.А. Обоснование возможности разработки готовой лекарственной формы на основе прописи сахароснижающего сбора // Дальневосточный медицинский журнал. 2006. №1. С. 88-90.
2. Макаров В.Г., Пименов А.И., Зенкевич И.Г., Шиков А.Н. Сравнение хроматографических профилей водноспиртовых и масляных экстрактов растений для характеристики различий их состава // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: мат. IV межд. съезда. Великий Новгород; СПб., 2000. С. 294-301.
Поступило в редакцию 26 сентября 2007 г.
После переработки 5 августа 2008 г.
