CC BY
89
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСТОРОННИХ ПРИМЕСЕЙ СУБСТАНЦИИ РУТИНА
Н.Е. Кузьмина, С.В. Моисеев, В.А. Яшкир, В.А. Меркулов
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва vsk46@yandex.ru
Резюме: На примере субстанции рутина показана возможность применения метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса для комплексного решения химико-аналитических задач, связанных с экспертизой качества субстанций при подтверждении подлинности, идентификации и количественного определения примесей и остаточных растворителей.
Ключевые слова: рутин, структурная интерпретация спектров ЯМР 'Ни ЮС, остаточные растворители, примеси.
THE USE OF MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY FOR AUTHENTICATION, IDENTIFICATION AND ASSA Y OF IMPURITES IN ROUTINE SUBSTANCE N.E. Kuzmina, S. V. Moiseev, V.A. Yashkir, V.A. Merkulov Abstract: The present article describes the applicability of nuclear magnetic resonance spectroscopy method for comprehensive solution of chemical-analytical challenges when performing expert evaluation of drug substances quality namely authentication, identification and assay of impurities and residual solvents as exemplified by routine substance.
Key words: routine, structural interpretation of NMR-spectra 'H and BC, residual solvents, impurities.
Основными задачами фармацевтического анализа при проведении экспертизы качества лекарственных субстанций (ЛСб) являются:
■ подтверждение подлинности ЛСб;
■ идентификация и количественное определение примесей;
■ количественное определение остаточных органических растворителей.
Традиционно для решения этих задач используются хроматографические методы (газовая — ГХ, жидкостная — ВЖХ, тонкослойная хроматография — ТСХ), УФ-спектрофотометрия и ИК-спектроскопия [1].
Характерной особенностью традиционных методов является необходимость использования стандартных образцов (СО) при решении всех перечисленных задач. Эти методы не определяют строение молекул веществ — компонентов ЛС. В лучшем случае они свидетельствуют о наличии определенной функциональной группы в молекуле (например, ИК-спектроскопия). Идентификация вещества традиционными методами осуществляется косвенно, путем сопоставления интегрального физического свойства (способности адсорбироваться, поглощать монохроматическое излучение и т.д.) анализируемого вещества и СО. Поэтому использование СО при подтверждении подлинности и идентификации примеси (в том числе и растворителя) в традиционных методах обязательно. Количественные измерения в рамках этих методов также невозможно проводить без использования СО, поскольку площадь пика на хроматограмме (площадь пятна на ТСХ) зависит не только от концен-
трации анализируемого компонента ЛС, но и от ряда других факторов (адсорбционной способности, способности поглощать при данной длине волны и т.д.).
В рамках традиционных методов задачи идентификации и количественного определения компонентов ЛСб решаются последовательно, с использованием различных методик, различных СО, различных проб с варьируемыми концентрациями СО примесей и растворителей, что требует определенных временных и материальных затрат. Альтернативным методом, позволяющим быстро, комплексно и без использования СО всех компонентов ЛСб решать основные химико-аналитические задачи экспертизы качества ЛСб (подтверждение подлинности, идентификация и количественное определение примесей и остаточных растворителей), является метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Метод ЯМР решает задачу идентификации соединения напрямую, путем определения состава, строения и пространственной структуры соединения [2, 3]. Он фиксирует наличие определенных структурных фрагментов и последовательность их соединения друг с другом в молекуле, поэтому не нуждается в использовании СО. В ЯМР-спектре интенсивность сигнала определяется только концентрацией ядра, дающего сигнал. Поэтому для количественного определения любого компонента ЛСб (как основного, так и примесей) не требуется наличие СО этого компонента, достаточно сопоставления приведенной интегральной интенсивности сигнала данного компонента к сумме приведенных интегральных интенсивностей сигна-
лов всех компонентов Л С б* . В рамках метода ЯМР задачи подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения примесей (включая остаточные растворители), решаются параллельно, на основе использования одной пробы образца ЛСб, без приготовления серии калибровочных растворов СО примесей и остаточных растворителей. Экспрес-сность, комплексность и надежность идентификации и количественных определений, независимость от С О анализируемых компонентов, недеструктивность — основные достоинства метода ЯМР.
Цель настоящей работы — на примере ЛСб рутина показать преимущество метода ЯМР перед традиционными методами фармацевтического анализа при решении задач подтверждения подлинности ЛСб, идентификации и количественного определения примесей и остаточных органических растворителей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования мы использовали субстанцию «Рутин» серии C001J100506 производства «Сичуан Ксиели Фармасьютикал Ко., Лтд.», Китай.
Съемку спектров проводили на ЯМР-спектро-метре Agilent DD2 NMR System 600 при температуре 25°С по стандартным методикам 1D и 2D экспериментов [4]. Использовали раствор субстанции рутина в дейтерированном диметилсульфоксиде (ДМСО-d6)
’ Приведенная интегральная интенсивность сигнала - это интегральная интенсивность, деленная на число эквивалентных ядер в молекуле, дающих этот сигнал.
с концентрацией 20 мг/мл. Калибровку шкалы химических сдвигов (5) осуществляли по отношению к сигналу ДМСО (5=2.50 (!Н) и 40,45 (13С) м.д.). Структурную интерпретацию спектров 13С и Н проводили с учетом значений химических сдвигов сигналов, их мультиплетности и данных гомоядерных и гетеро-ядерных 2Б экспериментов (' Н-1 Н-СОБУ, Н-'’’С-ШОС, ‘Н-^С-НМВС).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Нормативным документом, регламентирующим качество субстанции «Рутин» производства «Сичуан Ксиели Фармасьютикал Ко., Лтд.», Китай, является НД 42-11781-07 (И N013343/01-040408). В рамках этого документа подлинность рутина подтверждают комбинированием методов ИК-спектроскопии, УФ-спектрофотометрии и качественных реакций с борной и щавелевой кислотами, с растворами хлорида оксида железа и гидроксида натрия, с цинком в присутствии хлористоводородной кислоты. Фиксирование наличия и количественное определение примесей проводят методом ТСХ, причем идентифицируют только примесь кверцетина. Количественное определение остаточного растворителя (метанола) осуществляют методом ГЖХ. В целом, процедура подтверждения подлинности, идентификации и количественного содержания примесей и остаточных растворителей с помощью методов, рекомендованных П N013343/01-040408, достаточно трудоемка и продолжительна по времени. Например, только стадия пробоподготовки подтверждения подлинности
Таблица 1. Соотнесение спектральных данных Ши 13 С структуре рутина
№ 6, М.Д. № 6, м. д.
атома 'Н 13С атома 'Н 13С
2 157,31 2" 3,22 м 77,36
3 134,21 3” 3,22 м 74,97
4 178,26 4” 3,07 д (J=9,4) 70,91
4а 104,87 5” 3,25 д-д (J=9,4; 9,4) 76,81
5 162,12 6” 3,70 д (J=10,7) 3,29 д-д (J= 10,7; 9,4) 67,88
6 6,19 д (J=2,0) 99,56 1„, 4,38 уш. с 101,62
7 164,95 2”, 3,38 уш.с 71,26
8 6,38 д (J=2,0) 94,45 з„, 3,28 м 71,46
8а 157,48 4’„ 3,08 д (J=9,4) 72,75
1’ 122,46 5”’ 3,27 м 69,12
2’ 7,53 уш. с 117,16 6”’ 0,99 д (J=6,l) 18,61
3’ 145,64 2”-ОН 5,28 д (J=2,9)
4’ 149,30 3”-ОН 5,11 д (J=3,0)
5’ 6,84 д (J=8,3) 116,11 4”-ОН 5,07 д (J=5,9)
6’ 7,54 д-дЦ=8,3; 2,3) 2”’-ОН 4,34 уш.с.
5-ОН 12,60 с 3”’-ОН 4,40 уш.с.
3-ОН, 7-ОН З’-ОН, 4’-ОН 10,80 уш. с; 9,70 уш.с; 9,19 уш. с. 4”’-ОН 4,52 уш.с.
1” 5,34 д (J=7,0) 102,08
методом ИК длится более 3-х часов, поскольку предусматривает сушку препарата в вакуум-сушильном шкафу при остаточном давлении до 2,5 кПа в течение этого времени. Все количественные определения проводятся на основе точных навесок препарата и СО, а также точных объемов растворителей, в связи с чем неизбежны погрешности измерения, связанные с пробоподготовкой.
Пробоподготовка в рамках метода ЯМР очень проста и заключается в растворении препарата (точная навеска не требуется) в подходящем дейтериро-ванном растворителе (как правило, используется не более 0,5 мл растворителя). Средняя продолжительность Н эксперимента составляет несколько секунд, а 13С, 'Н-'Н-СОЗУ, 'Н-^С-ШОС, 'Н-^С-НМВС -30 минут. Следует отметить, что проведение двумерных гомоядерных и гетероядерных экспериментов необходимо только при отсутствии какой-либо информации о структурной интерпретации данных одномерных спектров (' Н и 13С). С их помощью точно определяются системы спин-взаимодействующих ядер Н, идентифицируются сигналы перекрывающихся протонных мультиплетов, устанавливаются взаимное соотнесение сигналов 'Ни 13С конкретных углеводородных фрагментов и последовательность соединения различных структурных фрагментов в молекуле. В дальнейшем, для идентификации соединений, для которых уже проведена структурная интерпретация спектральных данных, проведение двумерных экспериментов необязательно.
Подлинность основного компонента ЛСб рутина подтверждается наличием в спектрах ЯМР набора сигналов, характерных для структурных фрагментов молекулы рутина. В таблице 1 приведены значения 5 и мультиплетность сигналов ядер Н и С различных структурных фрагментов молекулы рутина (рис. 1). Спектры Н и 13С образца субстанции рутина серии С001Л00506 представлены на рис. 1 и 2 соответственно.
,|]Ь
р-
‘-г1 V ‘-г1 "г* V «V ьт*х| ІУ У1!"!*
* С В 2 Е 8. 8. £§8. 8 8 88 ^ Я 8
Рис. 1. Спектр !Н образца субстанции рутина серии С0011100506
Рис. 2. Спектр иС- образца субстанции рутина серии С0011100506
Наличие в спектрах 'Н и 13С дополнительных сигналов, не относящихся к молекуле рутина, свидетельствует о присутствии в субстанции рутина примесей. Следует отметить, что в спектре 13С можно наблюдать сигналы примесей, концентрация которых превышает 1 мольный % по отношению к основному веществу. Это связано с низкой чувствительностью метода 13С-ЯМР. Даже при значительном накоплении сигнала (число сканирований более 15000) интенсивность (I) сигналов примесных соединений, концентрация которых не превышает 1 мольный % по отношению к основному веществу, сопоставима с шириной базовой линии, то есть не соблюдается условие 1>2о (где о — интенсивность фона), при котором сигнал может считаться надежно идентифицированным. Поэтому 13С-ЯМР спектроскопия малоэффективна при идентификации и количественном определении микро-примесей. Эти задачи решают с помощью метода Н -Я М Р, который в 100 раз чувствительнее метода
13С-ЯМР. Для повышения надежности идентификации примесного соединения рекомендуется использовать данные двумерных спектров 'Н-'Н-СОЗУ и 'Н-^С-ШОС, которые по своей чувствительности сопоставимы с Н-ЯМР. Эти методы позволяют наблюдать сигналы примесного соединения, которые в протонном спектре налагаются на сигналы основного компонента субстанции. В образце субстанции рутина серии С001Л00506 были обнаружены сигналы следующих примесей и остаточных растворителей:
■ 3,5,7-тригидрокси-2-(4-гидроксифенил)-4#-1-бензопиранона-4 (3-дегидроксифенил-квер-цетина): 5=12,57 м.д. (5-ОН, с), 7,89 м.д. (2СН, д, 1=8,8 гц, 8=0,04), 6,87 м.д. (2СН, д, 1=8,8 гц, 8=0,04), 6,43 м.д. (1СН, д. 1=2,0 гц, 8=0,01);
■ -кверцетина: 5=12,576 м.д. (5-ОН, с), 7,85 м.д. (1СН, д, 1=2,3 гц, 8+=0,02), 7,54 м.д. (из 808У), 6,91 м.д. (1СН, д, 1=8,2 гц, 8=0,02), 6,41 м.д.
_(1СН1дЛ^2,3 гц, 8=0,01);
т Э - величина интегральной интенсивности сигнала
■ метанола: 'Н: 5=3,83 м.д. (СН3, с, 8=0,06); 13С: 56,6 м.д.
Сигналы родственных примесей и метанола в спектре Н образца субстанции рутина серии С001Л00506 представлены на рис. 3 и 4 соответственно.
Рис. 3. Сигналы родственных примесей в спектре Шобразца субстанции рутина серии С00П100506
тов. Это так называемое относительное содержание, оно рассчитывается по формуле Х1=М1.81,/2М]8^ 0= 1 -гП), где 5"! — среднее приведенное значение интегральной интенсивности сигнала анализируемого компонента; М1 — его молекулярная масса; п — число компонентов испытуемого образца.
Следует подчеркнуть, что формула расчета относительного содержания не содержит величин масс навесок образца и объема растворителя, то есть ошибки пробоподготовки при количественном определении относительного содержания определенного компонента в смеси компонентов методом ЯМР исключены. В табл. 2 представлены результаты количественного определения примесей и остаточных органических растворителей в образце субстанции рутина серии С001Л00506, на основании которых он соответствует требованиям НД ПЫО13343/01 по этим показателям.
Таблица 2. Результаты подтверждения подлинности, количественного определения примесей и остаточных растворителей в образце субстанции рутина серии С001Л00506
Показатели качества Требования nN013343/01 Результаты анализа серииC001J100506
Подлинность Подтверждена методом ЯМР
Посторонние примеси сумма примесей допускается не более 2 примесей, одна из которых - кверцетин не более 2% Кверцетин 0,89% З-дешдроксифенилк-верцетин 0,84% 1,73
Остаточные органич. растворители метанол не более 3000 ppm 900 ppm
Рис. 5. Сигнал примеси метанола в спектре гН образца субстанции рутина серии С00П100506
Как отмечалось ранее, НД N013343/01-040408 допускается наличие в субстанции рутина двух примесей, одна из которых — кверцетин. Метод ЯМР позволил установить строение другой, ранее не идентифицированной примеси — это производное кверце-тина с одной гидрокси-группой в фенильном кольце. Эту информацию можно использовать для идентификации и количественного определения примесей в субстанции рутина.
Количественное содержание родственных рутину примесей и остаточного растворителя в испытуемом образце субстанции рутина определяли как весовую долю компонента в смеси установленных компонен-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Спектроскопия ЯМР имеет на сегодняшний день наиболее богатый и успешный опыт установления как химической структуры индивидуальных органических соединений, так и деталей их электронного и пространственного строения. Особенности агрегатного состояния, дисперсность, элементный состав, молекулярно-массовое распределение и другие характеристики системы не препятствуют получению спектров ЯМР. Процедура регистрации спектров ЯМР, сбора и обработки информации по различным ядрам больших серий объектов легко может быть осуществлена в автоматическом режиме. Выполнение количественных измерений на основе данных ЯМР не требует при регистрации спектров использования эталонов и внутренних стандартов, так как основано
на стехиометрических отношениях. Все перечисленное делает метод ЯМР универсальным средством для комплексного решения химико-аналитических задач фармацевтического анализа природных и синтетических ЛСб, что и продемонстрировано в данной статье на примере субстанции рутина. Включение
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственная фармакопея Российской федерации. XII изд. часть I, перераб. и доп. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. 704 с.
2. ГюнтерХ. Введение в курс спектроскопии ЯМР. М.: Мир, 1984. 478с.
3. Калабин Г.А., Каницкая Л.В., Кушнарев Д.Ф. Количественная спек-
метода ЯМР в фармакопейные статьи в качестве альтернативного метода подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения примесей и остаточных органическихрастворителей — важнейшая задача ближайшего будущего.
троскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки. М.: Химия, 2000. 408 с.
4. Дероум Э. Современные методы ЯМР для химических исследований. М.: Мир, 1992.403с.
М
Н
О
ч
Ы
Пн
и
3 я я
Ы
М
Н
О
Пн
<
м
Ы
4 < со Я н
Пн
Ы
с
и
м о
К ВОПРОСУ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ СООТВЕТСТВИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ТРЕБОВАНИЯМ НОРМАТИВНОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ
Ю.М. Якимов, А.Н. Миронов, И.В. Борисевич, В.А. Меркулов, A.JI. Фокина, А.Р. Волгин
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва Yakimov @regmed. ru
Резюме: Иммунобиологические лекарственные препараты, выпускаемые в обращение на территории Российской Федерации, подлежат обязательному подтверждению соответствия требованиям нормативной документации. Центр сертификации МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России организует и осуществляет выполнение работ по подтверждения соответствия иммунобиологических лекарственных препаратов, подлежащих обязательной сертификации и в форме принятия декларации о соответствии. Приведены задачи, решаемые Центром, его структура, методологические принципы деятельности по подтверждению соответствия, основные результаты работы.
Ключевые слова: иммунобиологические лекарственные препараты, центр сертификация, подтверждение соответствия, обязательная сертификация, декларирование соответствия.
ON THE QUESTION OF CONFORMITYASSESSMENT OFIMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS TO THE
REQUIREMENTS OF THE NORMATIVE DOCUMENTS Y.M. Yakimov, A.N. Mironov, I. V. Borisevich,
V.A. Merkulov, A.I. Fokina, A.R. Volgin Abstract: Immunobiological preparations circulating in the market of the Russian Federation are the subject of сотриIsoiy assessment of conformity to the requirements of the normative documents. Centre for Certification of Medical Immunobiological Preparations of the Federal State Budgetaiy Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministiy of Health of the Russian Federation organizes and performs activities involving conformity assessment for medical immunobiological preparations that are the subject of compulsoiy certification and by means of adoption of declaration of conformity. The present article describes the responsibilities of the Centre, it’s structure, methodological principles of the activities involving conformity assessment, basic results of the work.
Key words: immunobiological preparations, Centre for Certification, conformity assessment, compulsoiy certification, declaration of conformity.
Контрольно-разрешительная система оборота иммунобиологических препаратов была создана в 1918 г. и играла важную роль в обеспечении безопасности страны и защиты населения от инфекционных заболеваний. Постановление Народного Комиссариата здравоохранения от 15 ноября 1918 г. № 985 определило основные задачи российского здравоохранения, в ряду которых упоминалось об «организации выработки предохранительных и лечебных вакцин и сывороток и установлении контроля над выпускаемыми на рынок вакцинами и сыворотками». Выполнение этой задачи было возложено на Государственный научный Институт контроля сывороток и вакцин, впоследствии ГИСК им. Л.А.Тарасевича, находящего в подчинении Главка Санитарно-эпидемиологического М3 СССР, а позже Госкомсанэпиднадзора (Роспотребнадзора) Российской Федерации, выполняющего со дня создания функции контрольно-разрешительной системы МИБП.
В 1992 г. обязательная регистрация и сертификация иммунобиологических препаратов была
возложена на Государственный научно-исследо-вательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича.
В рамках реорганизации экспертных органов контрольно-разрешительной системы в области обращения иммунобиологических лекарственных препаратов в соответствии с Распоряжением Правительства Российской Федерации от 17 ноября 2010 г. № 2058-р и Приказом Минздравсоцразвития России от 13 декабря 2010 г. № 1102 с 1 апреля 2011 г. федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (далее — ГИСК) присоединен к федеральному государственному бюджетному учреждению «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (далее — Научный центр).
