CC BY
20
Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2022;21(11):3386. doi:10.15829/1728-8800-2022-3386 ISSN 1728-8800 (Print) ISSN 2619-0125 (Online)
KS
РОПНИЗ
f)V0
'««и»' ^^
РОССИЙСКОЕ
КАРДИОЛОГИЧЕСКОЕ
ОБЩЕСТВО
Использование метода профилирования на основе коротких тандемных повторов для подтверждения подлинности клеточных линий в биобанках
Кособокова Е. Н., Мальченкова А. А., Калинина Н. А., Косоруков В. С.
ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина" Минздрава России. Москва, Россия
Цель. Апробирование набора COrDIS (Гордиз, Россия) для подтверждения подлинности клеточных линий Биоресурсной коллекции ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина" Минздрава России методом профилирования на основе коротких тандемных повторов.
Материал и методы. Выбранный метод зарекомендовал себя в качестве надежного и воспроизводимого варианта. При таком подходе ряд полиморфных коротких тандемных повторов STR (short tandem repea^-локусов амплифицируется с использованием коммерчески доступных наборов праймеров. Продукты поли-меразной цепной реакции (ПЦР) анализируются одновременно со стандартами размера с использованием автоматических методов флуоресцентного обнаружения. Результаты предоставляются в виде простого числового кода, соответствующего длинам продуктов ПЦР, амплифицированных в каждом локусе. Применяя этот метод к клеточным линиям, лаборатория может, как проверить подлинность коммерческих клеточных линий, так и сформировать базу данных своих линий.
В работе использовали набор отечественного производителя COrDIS "ЭКСПЕРТ 26" (Гордиз, Россия), валидированный для молекулярно-генетической идентификации личности на основе мультиплексного ПЦР-анализа 26-ти высоко-полиморфных локу-сов геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты человека. Анализ результатов ПЦР проводили методом капиллярного электрофореза с использованием автоматического генетического анализатора с лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией (Applied Biosystems 3500xL).
Результаты. При апробации метода проведено профилирование 37 клеточных линий, из которых 18 анонсированы в международных базах данных и 19 уникальных, полученных в ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина" Минздрава России, а также сме-
си клеточных линии с целью определения пределов выявления контаминации. Полученные результаты показали соответствие профилей коммерческих клеточных линий с данными в международных базах. В рамках данной работы были получены профили уникальных линий и заложено начало собственной генетической базы биоресурсной коллекции. Исследования на выявление предела обнаружения контаминации другой линией показали, что при содержании в общем пуле даже 4% культуры-контаминанта удается выявить ее отдельные аллели.
Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования метода для идентификации образцов коллекции и обнаружения внутривидовой контаминации. Ключевые слова: клеточные линии, подлинность, внутривидовая контаминация, короткие тандемные повторы, вТЯ-профи-лирование.
Отношения и деятельность: нет.
Поступила 11/08-2022 Рецензия получена 05/10-2022 Принята к публикации 13/10-2022
Для цитирования: Кособокова Е. Н., Мальченкова А. А., Калинина Н. А., Косоруков В. С. Использование метода профилирования на основе коротких тандемных повторов для подтверждения подлинности клеточных линий в биобанках. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2022;21(11):3386. (Ы:10.15829/1728-8800-2022-3386. ЕРЫ МвТРУО
Using short tandem repeat profiling to validate cell lines in biobanks
Kosobokova E. N., Malchenkova A. A., Kalinina N. A., Kosorukov V. S.
N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology. Moscow, Russia
Aim. To approve the COrDIS kit (Gordiz, Russia) for the authenticity of cell lines from the Bioresource Collection of the N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology by the short tandem repeat (STR) profiling. Material and methods. The chosen method proved to be a reliable and reproducible option. With this approach, a number of polymorphic STR loci are amplified using commercially available primer sets. Polymerase chain reaction (PCR) products are analyzed simul-
*Автор, ответственный за переписку (Corresponding author): e-mail: [email protected]
[Кособокова Е. Н.* — к.б.н., в.н.с. лаборатории трансгенных препаратов НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, ORCID: 0000-0002-4660-8519, Мальченкова А. А. — м.н.с. лаборатории трансгенных препаратов НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, ORCID: 0000-0003-2201-0472, Калинина Н. А. — м.н.с. лаборатории трансгенных препаратов НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, ORCID: 0000-0002-3024-8918, Косоруков В. С. — к.б.н., зав. лабораторией трансгенных препаратов, директор НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, ORCID: 0000-0002-8462-2178].
taneously with size standards using automated fluorescent detection methods. The results are presented as a simple number code corresponding to the lengths of the PCR products amplified at each locus. By applying this method to cell lines, the laboratory can both authenticate commercial cell lines and build a database of their lines. In the work, we used the COrDIS EXPERT 26 kit (Gordiz, Russia), validated for molecular genetic identification of personality based
on multiplex PCR analysis of 26 highly polymorphic loci of human genomic deoxyribonucleic acid. PCR results were analyzed by capillary electrophoresis using an automatic genetic analyzer with laser-induced fluorescence detection (Applied Biosystems 3500xL). Results. When testing the method, profiling of 37 cell lines was carried out, of which 18 were announced in international databases and 19 were unique, obtained at the N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, as well as a cell line mixture in order to determine the limits of contamination detection. The obtained results showed the correspondence of commercial cell lines with the data in international databases. Within the framework of this work, profiles of unique lines were obtained and the foundation of own genetic database was laid. Studies to identify the limit of contamination detection by another line have shown that even 4% of the contaminant culture in the total pool can be used to identify its individual alleles.
Conclusion. The results obtained indicate the possibility of using the method to identify samples of the collection and detect intraspecific contamination.
Keywords: cell lines, authenticity, intraspecific contamination, short tandem repeats, STR profiling.
Relationships and Activities: none.
Kosobokova E. N.* ORCID: 0000-0002-4660-8519, Malchenkova A. A. ORCID: 0000-0003-2201-0472, Kalinina N. A. ORCID: 0000-00023024-8918, Kosorukov V. S. ORCID: 0000-0002-8462-2178.
Corresponding author: [email protected]
Received: 11/08-2022 Revision Received: 05/10-2022 Accepted: 13/10-2022
For citation: Kosobokova E. N., Malchenkova A. A., Kalinina N. A., Kosorukov V. S. Using short tandem repeat profiling to validate cell lines in biobanks. Cardiovascular Therapy and Prevention. 2022;21(11):3386. doi:10.15829/1728-8800-2022-3386. EDN NGTDUQ
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ПО — программное обеспечение, ПЦР — полимеразная цепная реакция, STR — short tandem repeat (короткие тандемные повторы).
Ключевые моменты Что известно о предмете исследования?
Метод профилирования на основе коротких тан-демных повторов является "золотым стандартом" для подтверждения подлинности клеточных линий в биобанках.
Что добавляют результаты исследования? Предложенный метод позволяет эффективно и с высокой точностью обнаруживать внутривидовую контаминацию.
Получены профили уникальных линий и заложено начало собственной генетической базы биоресурсной коллекции.
Key messages What is already known about the subject?
Short tandem repeat profiling is the gold standard for validating cell lines in biobanks.
What might this study add?
The proposed method allows efficient and high-precision detection of intraspecific contamination. The profiles of unique lines were obtained and the foundation of own genetic database was laid.
Введение
Широкий спектр исследований, проводимых на клеточных линиях, включая изучение механизмов действия, эффективности, безопасности новых терапевтических препаратов, механизмов лекарственной резистентности опухолей и многие другие аспекты, сделал этот объект чрезвычайно значимым в современной науке и технологии.
Значительная часть исследований, представленных в международных литературных источниках, подвергается сомнению в связи с отсутствием подтверждения подлинности и чистоты использованной клеточной линии [1-3], в то время как контаминация другой линией, а также вирусная и ми-коплазменная контаминации являются частыми1 и общеизвестными проблемами, широко обсуждаемыми в научном сообществе [4, 5].
1 ICLAC Register of Misidentified Cell Lines. https://iclac.org/databases/ cross-contaminations/.
Контроль подлинности используемой в исследовании клеточной линии до сих пор не стал общепринятым, несмотря на широко известные в научном сообществе проблемы, связанные с работами, проведенными на ошибочно идентифицированных культурах, приведшими к распространению дезинформации в научных источниках и обладающими сомнительной ценностью [6]. Результатом пренебрежения процедурами контроля качества используемых биологических материалов/объектов становится невоспроизводимость результатов биомедицинских исследований [7].
При этом стоит отметить, что ведущие международные издательства American Association for Cancer Research (AACR) Publications, Society for Endocrinology Journals, Endocrine Society Journals и Nature Publishing Group (NPG), а также такие журналы, как BioTechniques, Cell Biochemistry and Biophysics, In Vitro Cellular & Developmental Biology — Animal, International Journal of Cancer,
PLOS ONE, Journal of Molecular Biology и др.2,3, сформулировали требования по предоставлению информации об аутентификации и чистоте используемых в исследовании клеточных линий [8]. Аналогичные требования/рекомендации при рассмотрении заявок на финансирование предъявляются и ведущими мировыми исследовательскими центрами4.
Существует ряд доступных методов, которые предоставляют информацию о качестве клеточных линий: кариотипирование, профилирование коротких тандемных повторов (short tandem repeat, STR) [9-11], профилирование однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) [12, 13], использование ви-доспецифичных праймеров, штрих-кодирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), высокопроизводительное секвенирование [14-16], СО1 бар-кодирование5. Метод STR-профилирования зарекомендовал себя в качестве надежного и воспроизводимого варианта [17-19] и занял ведущие позиции, в связи с чем Американским национальным институтом стандартов (The American National Standards Institute, ANSI) и Американской коллекцией типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC) был разработан стандарт аутентификации клеточных линий человека ASN-0002 (Authentication of Human Cell Lines: Standardization of STR Profiling). Данный документ содержит информацию об актуальности вопроса, значимости аутентификации клеточных линий при проведении биомедицинских исследований, подробный обзор методик, обсуждение их преимуществ и недостатков.
В основе метода лежит анализ коротких тан-демных повторов ряда полиморфных STR-локусов, амплифицируемых с использованием коммерчески доступных наборов праймеров, таких как The GlobalFiler (Life Technologies, США), Investigator 24plex QS (Qiagen, Германия), PowerPlex Fusion 6C (Promega, США) или COrDIS "ЭКСПЕРТ 26" (Гор-диз, Россия). Набор Investigator 24plex QS содержит ПЦР (полимеразная цепная реакция)-контроль, позволяющий получить дополнительную информацию о качестве ДНК пробы и менее восприимчив к ингибиторам [20]. Набор PowerPlex Fusion
2 List of Journals requiring Cell Line Authentication. https:// worldwide.promega.com/resources/guides/cell-biology/cell-line-authentication/.
3 ATCC Cell Line Authentication Publication Requirements. https:// www.atcc.org/the-science/authentication/cell-line-authentication-publication-requirements.
4 Enhancing Reproducibility through Rigor and Transparency. https:// grants.nih.gov/grants/guide/notice-files/NOT-OD-15-103.html.
5 ATCC SDO Species-Level Identification of Animal Cells through Mitochondrial Cytochrome c Oxidase Subunit 1 (CO1) DNA Barcodes. ATCC SDO document ASN-0003. Manassas, VA: ATCC Standards Development Organization, 2015.
6C также демонстрирует толерантность к ПЦР-ингибиторам, а для The GlobalFiler характерно лучшее восстановление аллелей из образцов ДНК с низким содержанием матрицы [20].
Количество идентифицируемых маркеров варьируется от 24 (GlobalFiler) до 27 (PowerPlex Fusion 6C [21]), однако в составе всех наборов представлены 20 основных локусов CODIS (Combined DNA Index System) и DYS391.
Далее при электрофоретическом разделении с лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией продукты ПЦР анализируются одновременно со стандартами размера. Результатом является простой числовой код, соответствующий длинам фрагментов, амплифицированных в каждом локу-се. Описанные наборы для STR-профилирования демонстрируют высокие показатели качества полученных результатов, что позволяет взаимно заменять их в лабораторной практике и сравнивать независимо полученные STR-профили. Применяя этот метод к клеточным линиям, лаборатория может, как проверить подлинность коммерческих клеточных линий, так и сформировать базу данных своих линий.
При апробации метода в рамках проекта "Создание и развитие биоресурсной коллекции генетически и фенотипически охарактеризованных клеточных линий и первичных опухолей человека", поддержанного грантом Министерства науки и высшего образования РФ, мы проанализировали 37 клеточных линий из Биоресурсной коллекции (БРК) ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохи-на". Из них 18 линий анонсированы в международных базах данных и 19 уникальных.
Полученные профили позволили подтвердить возможность использования метода для идентификации образцов коллекции и сформировать базу данных на основе полиморфных STR-локусов уникальных клеточных линий. Кроме того, исследованы возможности метода для обнаружения контаминации клетками других линий.
Материал и методы
Клеточные линии
Получены из БРК клеточных линий и первичных опухолей ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина" Минздрава России (таблица 1). Для уникальных клеточных линий, полученных в центре с 01.10.2020г, получено информированное согласие от пациента, составленное по форме, утвержденной Приказом учреждения № 297/П от 01.10.2020г.
Экстракция ДНК
Выделение ДНК из клеток производили с использованием набора Genomic DNA Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Количество ДНК оценивали на флуориметре Qubit 4 с использованием набора Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США).
Таблица 1
Клеточные линии человека, использованные в работе по определению генетического профиля методом 8ТЯ-анализа
№ Наименование Происхождение Доступность в БРК
1 BT-474 Рак молочной железы ATCC, DSMZ, ИНЦ РАН
2 Caki-2 Рак почки ATCC, ECACC, DSMZ
3 Capan-2 Аденокарцинома поджелудочной железы ATCC, DSMZ, ИНЦ РАН
4 Caski Карцинома шейки матки ATCC, ECACC
5 Daudi Лимфома Беркитта ATCC, ECACC, DSMZ
6 EFO-21 Рак яичников DSMZ
7 HCC1954 Лимфобластома ATCC
8 HeLa Аденокарцинома шейки матки ATCC, ECACC, DSMZ, ИБР РАН
9 Jiyoye Лимфома Беркитта ATCC, ECACC, DSMZ
10 MCF 7 Рак молочной железы ATCC, ECACC, DSMZ, ИНЦ РАН, ИБР РАН
11 MIA PaCa-2 Карцинома поджелудочной железы ATCC, ИНЦ РАН
12 OVCAR-3 Рак яичников ATCC, DSMZ
13 PANC-1 Карцинома поджелудочной железы ATCC, DSMZ, ИНЦ РАН
14 Saos-2 Остеосаркома ATCC, ECACC, DSMZ
15 SiHa Карцинома шейки матки ATCC
16 THP-1 Острый моноцитарный лейкоз ATCC, ECACC, DSMZ, ИНЦ РАН
17 T47D Карцинома молочной железы ATCC, ECACC, DSMZ
18 5637 Карцинома мочевого пузыря ATCC, DSMZ
19 А 052 Меланома НМИЦ онкологии Блохина
20 A 875 Меланома НМИЦ онкологии Блохина
21 GB 2 Глиобластома НМИЦ онкологии Блохина
22 mel Bgf Меланома НМИЦ онкологии Блохина
23 mel Ch Меланома НМИЦ онкологии Блохина
24 mel Cher Меланома НМИЦ онкологии Блохина
25 mel Gi Меланома НМИЦ онкологии Блохина
26 mel Gus Меланома НМИЦ онкологии Блохина
27 mel H Меланома НМИЦ онкологии Блохина
28 mel Hn Меланома НМИЦ онкологии Блохина
29 mel Il Меланома НМИЦ онкологии Блохина
30 mel Is Меланома НМИЦ онкологии Блохина
31 mel Kor Меланома НМИЦ онкологии Блохина
32 mel Kas Меланома НМИЦ онкологии Блохина
33 mel May Меланома НМИЦ онкологии Блохина
34 mel Mtp Меланома НМИЦ онкологии Блохина
35 mel Pet Меланома НМИЦ онкологии Блохина
36 mel Si Меланома НМИЦ онкологии Блохина
37 mel Z Меланома НМИЦ онкологии Блохина
Примечание: ATCC — American Type Culture Collection (Американская коллекция типовых культур); DSMZ — Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных линий); ECACC — European Collection of Authenticated Cell Cultures (Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур); ИНЦ РАН — Коллекция культур клеток позвоночных Института Цитологии РАН; ИБР РАН — Коллекция клеточных культур Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН.
Приготовление смесей клеточных линий и ДНК
С целью определения порога внутривидовой контаминации готовили смеси из предварительно выделенной ДНК клеточных культур mel Pet и mel Kas в 9 вариантах процентного соотношения mel Pet/mel Kas: 96/4; 90/10; 80/20; 70/30; 50/50; 30/70; 20/80; 10/90; 4/96.
После отработки методики на ДНК, была проведена серия экспериментов на смеси культур в тех же соотношениях по количеству клеток для воспроизведения реальных условий клеточной контаминации. Для этого
культуры mel Pet и mel Kas смешивали таким образом, чтобы общее количество клеток для выделения ДНК составляло 1 млн.
Получение STR — профиля образца
Для проведения профилирования на основе коротких тандемных повторов использовали набор COrDIS "ЭКСПЕРТ 26" (Гордиз, Россия) для молекулярно-гене-тической идентификации личности на основе мультиплексного ПЦР-анализа 26 высоко полиморфных локу-сов геномной ДНК человека (таблица 2) [22]. Среди них
Таблица 2
Сводная информация о локусах ДНК, присутствующих в составе набора COrDIS "ЭКСПЕРТ 26": для STR-локусов структура единицы повтора приводится в соответствии с рекомендациями Международного Общества Судебных Генетиков (International Society for Forensic Genetics) [22]
Маркер Референсный номер Референсный аллель Хромосомная локализация Структура единицы повтора референсного aллеля
1 D1S1656 NC 000001.9 17 1q42 [TAGA] 16[TGA][TAGA][TAGG]1[TG]5
2 D2S441 AL079112 12 2p14 [TCTA]12
3 D3S1358 NT 005997 18 3p21.31 TCTA[TCTG]2 [TCTA]15
4 D5S818 AC008512 11 5q23.2 [AGAT]n
5 D7S820 AC004848 13 7q21.11 [GATA]13
6 D8S1179 AF216671 13 8q24.13 [TCTA]3
7 D10S1248 AL391869 13 10q26.3 [GGAA]13
8 D12S391 G08921 19.3 12p 13.2 [AGAT]5 GAT[AGAT]7[AGAC]6AGAT
9 D13S317 AL353628 11 13q31.1 [TATC]11
10 D16S539 AC024591 11 16q24.1 [GATA]n
11 D18S51 AP001534 18 18q21.33 [AGAA]18
12 D21S11 AP000433 29 21q21.1 [TCTA]4[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]u
13 D22S1045 AL022314 17 22q12.3 [ATT]14ACT[ATT]2
14 CSF1PO X14720 12 5q33.1 [AGAT] 12
15 FGA M64982 21 4q31.3 [TTTC]3TTTTTTCT[CTTT]13CTCC[TTCC]2
16 SE33 V00481 26.2 6q14 [AAAG]8 AA[AAAG]17
17 TH01 D00269 9 11p15.5 [TCAT]9
18 TPOX M68651 11 2p25.3 [AATG]11
19 VWA M25858 18 12p13.31 TCTA[TCTG]4[TCTA]13
20 D6S1043 NT 007299 12 6q15 [AGAT]9-25
21 D19S433 AC008507.6 14 19q12 [AAGG][AAAG][AAGG][TAGG][AAGG]n
22 D2S1338 AC010136 23 2q35 [TGCC]n[TTCC]n
23 DYS391 AC011302 11 Y [TCTA]n
24 Amel X M55418 X XP22.1-22.3
Amel Y M55419 Y Yp11.2
25 SRY MH972533 SRY Yp11.2
26 Yindel M175 2 Yp11.221
представлены как маркеры стандартных международных панелей локусов: CODIS, EXPANDED CODIS (Expanded Combined DNA Index System), Европейских баз данных на основе ESS (European standard set), включая страны, использующие SE33 как обязательный маркер, так и собственные уникальные маркеры Гордиз.
Постановку ПЦР проводили в соответствии с рекомендациями производителя, общий объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Набор COrDIS "ЭКСПЕРТ 26" позволяет амплифицировать генетический материал в широком диапазоне концентраций ДНК благодаря уникальной технологии нормирования сигнала целевого продукта. В реакционную смесь добавляли 1 мкл геномной ДНК с концентрацией 1-100 нг/мкл. В качестве положительного контроля использовали 6 мкл высокомолекулярной ДНК мужчины в концентрации 0,1 нг/мкл с известным генотипом по всем исследуемым локусам (входит в состав набора). Для приготовления отрицательного контроля использовали деионизированную воду (входит в состав набора).
Разделение продуктов ПЦР осуществляли методом капиллярного электрофореза на генетическом анализа-
торе с лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией (Applied Biosystems 3500xL, США) с использованием капилляров 3500xL Genetic Analyzer 24-Capillary Array (Applied Biosystems, США) длиной 50 см и полимера РОР-7 (Applied Biosystems, США). В качестве внутреннего стандарта для построения кривой подвижности исследуемого образца в каждый капилляр одновременно с образцом вносили стандарт S550 (Гордиз, Россия).
Анализ STR-профиля образца
Анализ флуоресцентных профилей проводили в программе GenMapper 6. Предварительно загрузили панель маркеров и бины, предоставленные производителем набора COrDIS "ЭКСПЕРТ 26". Из-за наличия артефактов анализа рассчитанные программой профили проверялись и корректировались оператором в соответствии с принятыми в международной практике алгоритмами ANSI/ATCC ASN-0002-2011.
Полученные STR-профили для клеточных культур из международных коллекций сравнивали с профилями из баз данных ATCC и DSMZ, на основе % совпадения аллелей маркеров принималось решение о подлинности культуры или о повторном проведении анализа образца.
Таблица 3
Сравнение экспериментально полученных генетических профилей клеточных линий 5637, MCF7 и PANC-1 с референсными STR-профилями, аннотированными в базах данных ATCC (A) и DSMZ (Б)
А 5637 MCF7
Маркер Экспериментально полученные аллели Референс по ATCC Экспериментально полученные аллели Референс по ATCC
CSF1PO 11 11 10 10
D13S317 11 11 11 11
D16S539 9 9 12 11, 12
D5S818 11, 12 11, 12 11, 12 11, 12
D7S820 10, 11 10, 11 8,9 8,9
GENDER X, Y X, Y X X
TH01 7, 9 7, 9 6 6
TPOX 8, 9 8, 9 9, 12 9, 12
vWA 18 16, 18 14, 15 14, 15
% совпадения 96,6% 96,3%
Б PANC-1
Маркер Экспериментально полученные аллели Референс по DSMZ
CSF1PO 10, 12 10, 12
D13S317 11 11
D16S539 11 11
D18S51 12 12
D19S433 11, 15. 3 11, 16
D21S11 28 28
D2S1338 23, 24 23, 24
D3S1358 17 17
D5S818 11, 13 11, 13
D7S820 8, 10 8, 10
D8S1179 14, 15 14, 15
FGA 21 21
GENDER X X
TH01 7, 8 7, 8
TPOX 8, 11 8, 11
vWA 15 15
% совпадения 95,8%
Примечание: 8ТК-профили получены с использованием набора СОгБК "ЭКСПЕРТ 26"; % совпадения, полученного в ходе эксперимента 8ТЯ-профиля с профилем-референсом из базы данных, рассчитан по формуле (1); жирным шрифтом выделены экспериментально полученные аллели, по которым наблюдается неполное совпадение с референсными профилями из баз данных.
Процент соответствия рассчитывали по формуле [23]:
С
Ак х 2
общ_
2 Ареф + 2 А(
X 100 (1),
где С — соответствие, %; Аобщ — число общих аллелей, присутствующих и у референса, и у образца; £Ареф — суммарное число аллелей референса; ЕА^ — суммарное число аллелей образца.
При исследовании возможности метода для обнаружения внутривидовой контаминации использовали клеточные линии mel Pet и mel Kas, для которых идентифицировали 9 общих аллелей, а процент соответствия, рассчитанный по формуле (1), составил 27,7%. Это сказывается на эффективности выявления аллелей конта-минирующей линии при построении аналитических диа-
грамм. Для устранения такого влияния перед построением диаграмм общие для этих линий аллели исключали из анализа.
Результаты и обсуждение
1. Сравнение 8ТЯ-профилей, полученных для культур, анонсированных в международных базах данных
Профилирование 18 клеточных линий (таблица 1), анонсированных в международных базах данных, показало, что профили 15 линий на 100% совпадали с заявленными в базах. Три культуры: 5637, МСБ7 и РАКС-1 имели 8ТЯ-профили, совпадаю-
96,8 100 100
| | Уникальные аллели mel Pet | | Уникальные аллели mel Kas —Q— Обнаружение контаминирующих аллелей
Рис. 1 Диаграмма распределения аллелей в STR-профилях смесей ДНК с различным соотношением клеточных культур mel Pet и mel Kas. Примечание: на рисунке представлена диаграмма, иллюстрирующая распределение уникальных аллелей в STR-профилях, полученных для смесей с различным %-ным содержанием ДНК клеточных культур mel Pet и mel Kas. Синим цветом обозначен процент содержания аллелей, уникальных для культуры mel Pet, зеленым — уникальных для культуры mel Kas. Оранжевой линией соединены рассчитанные значения %-го обнаружения уникальных аллелей контаминанта в профиле преобладающей клеточной культуры. Цветное изображение доступно в электронной версии журнала.
щие на 96,6, 96,3 и 95,8%, соответственно (таблица 3). Для 16 линий провели сравнение профилей с базой ATCC, информация по двум линиям (Efo-21 и PANC-1) в ней отсутствовала, поэтому использовали данные базы DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture).
Согласно рекомендациям ANSI/ATCC ASN-0002-2011 для подтверждения подлинности клеточной линии соответствие должно составлять 80100%. Совпадение на 80-50% требует повторного анализа культуры, а значение параметра <50% подтверждает отличное от референса происхождение клеток. Таким образом, в рамках настоящей работы подтверждена подлинность 18 клеточных линий, анонсированных в международных базах.
2. Формирование внутренней базы данных STR-профилей для уникальных культур, полученных в "НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина"
Для формирования базы данных генетических профилей уникальных образцов исследовали 19 клеточных линий (таблица 1). Для каждого образца повторяли исследование не <3 раз и только при полной воспроизводимости результатов клеточной
линии присваивали профиль. Полученные профили позволили заложить начало базы данных БРК центра, информация вносится в паспорт клеточной линии, и предоставляется пользователям по запросу.
При проверке новой клеточной линии на контаминацию клетками других линий полученный профиль сравнивали с референсом. В качестве референсного использовали STR-профиль ДНК, выделенной из фрагмента ткани пациента, использованного в последующем для получения новой клеточной линии. Данный профиль можно использовать только для выявления контаминации за счет обнаружения новых аллелей, но не в качестве основного, поскольку в процессе возможны различные хромосомные перестройки, приводящие к изменению STR-профиля, например, потеря гетерозиготно-сти, как это происходит в случае линии mel Pet.
3. Определение порогов контаминации другими клеточными линиями
Как уже обсуждалось выше, контаминация другой клеточной линией является широко распростра-
100 100
mel Pet P96K4 P90K10 P80K20 P70K30 P50K50 P30K70 P20K80 P10K90 P4K96 mel Kas
| | Уникальные аллели mel Kas | | Уникальные аллели mel Pet —Q— Обнаружение контаминирующих аллелей смеси клеток
Рис. 2 Диаграмма распределения аллелей в STR-профилях смесей клеточных культур mel Pet и mel Kas с различным соотношением клеток. Примечание: на рисунке представлена диаграмма, иллюстрирующая распределение уникальных аллелей в STR-профилях, полученных для смесей с различным %-ным содержанием клеток культур mel Pet и mel Kas. Синим цветом обозначен процент содержания аллелей, уникальных для культуры mel Pet, зеленым — уникальных для культуры mel Kas. Оранжевой линией соединены рассчитанные значения %-го обнаружения уникальных аллелей контаминанта в профиле преобладающей клеточной культуры. Цветное изображение доступно в электронной версии журнала.
ненной проблемой. Стратегия контроля качества образцов, принятая в БРК клеточных линий и первичных опухолей "НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина", подразумевает строгий контроль контаминации, в т.ч. внутривидовой. Метод STR-профилирования прекрасно подходит для этих целей, т.к. каждая из клеточных линий имеет свой уникальный генетический профиль, а в смеси клеточных линий окончательный результат будет отражать комбинацию профилей присутствующих клеток. Нашей задачей было определить параметры оценки контаминации и установить их пределы обнаружения. Хотя интерпретация пиков в одном локусе может быть сложной и неоднозначной, анализ 26 различных локусов идентифицирует пики, которые четко указывают на наличие загрязняющей клеточной линии.
Обнаружение контаминации основано на выявлении в STR-профиле нехарактерных для данной клеточной культуры дополнительных аллелей6. Результаты, полученные при изучении смесей с раз-
6 Authenticating human cell lines using CLA IdentiFiler and CLA GlobalFiler kits on capillary electrophoresis platforms. Thermo Fisher Scientific Application Note. 2020. https://assets.thermofisher.com/ TFS-Assets/GSD/Application-Notes/authenticating-human-cell-lines-str-kits-capillary-electrophoresis-application-note.pdf. (9 августа 2022).
ным соотношением ДНК двух клеточных линий mel Pet и mel Kas, представлены на рисунке 1.
В смесях ДНК уже при 4%-ной контаминации mel Pet в STR-профиле проявляются дополнительные аллели для 4-х маркеров, при 10%-ной контаминации детектируется более половины аллелей посторонней культуры, а при 20%-ном содержании удается практически на 100% восстановить профиль и идентифицировать культуру-контаминант. При 20%-ом содержании mel Kas проявляется только половина специфичных аллелей.
В эксперименте по смешиванию двух клеточных культур получены схожие результаты (рисунок 2). Из рисунка 2 видно, что уже при 4%-ной контаминации на STR-профиле культуры наблюдаются посторонние дополнительные аллели, однако установление полного профиля культуры-конта-минанта достигается при 30%-ной контаминации.
Культура mel Pet проявляет тенденцию к более раннему обнаружению в смеси. Этот эффект ярко выражен в ДНК смесях, но также сохраняется в смесях клеточных культур. Возможной причиной такого явления могут быть особенности клеточной линии, связанные с плоидностью или с выраженной аллель-ной гомозиготностью культуры, хорошо заметной в STR-профиле. В таком случае при появлении ге-
Рис. 3 Электрофореграммы смесей культур клеток mel Pet и mel Kas.
Примечание: на рисунке представлены профили клеток mel Pet и mel Kas и их смесей по 6 маркерам, %-ное содержание клеток линии mel Pet показано синим цветом, mel Kas — красным. Кружками отмечены пики, которые программа не считывает за сигнал, а оператор может определить как проявление дополнительного аллеля и контаминации. Числовые значения выдает ПО: синим цветом — аллели, характерные для линии mel Pet, красным — для линии mel Kas, черным — общие для двух линий. Цветное изображение доступно в электронной версии журнала.
терозиготности или третьего аллеля по отдельным маркерам легче заподозрить контаминацию.
В ходе анализа результатов эксперимента выяснилось, что настройки программного обеспечения (ПО) не позволяют по числовому коду, определяющему генетический профиль, обнаружить <20-30% контаминанта, в то время как дополнительная обработка результатов эксперимента, основанная на анализе электрофореграмм, позволяет оператору детектировать отдельные аллели уже при 4%-ом содержании контаминирующей линии. На рисунке 3 представлены примеры изменения высоты пиков при разных соотношениях клеточных линий для 6 маркеров: D22S1045, D18S51, D16S539, D8S1179, CSF1PO и D6S1043. Пик аллеля маркера D18S51, характерный для клеточной линии mel Kas, появляется при содержании всего 4% линии-контами-нанта, однако ПО расценивает его как шум или артефакт. Высота данного пика относительно основного, с одной стороны, невелика (1121 RFU к 13862 RFU), но при этом превышает пороговые значения сигнала (>500 RFU) — двусмысленная ситуация не позволяет оператору точно идентифицировать дополнительный аллель. В этом случае необходимо обратить внимание на электрофореграммы всех маркеров и, при наличии аналогичной картины хотя бы по некоторым из них, принять решение о статусе рассматриваемого пика. При 10%-ой контаминации линией mel Kas пик по данному маркеру дает оператору возможность с большей уверенностью предположить появление дополнительного аллеля и проверить гипотезу анализом пиков по другим маркерам. ПО определяет аллель по данному маркеру при 20%-ом содержании контаминирующей линии, а по маркерам D16S539 и D8S1179 — только при 50%-ом содержании линии mel Kas.
Другой интересный пример представлен на рисунке 3 для маркера CSF1PO. Для линий mel Pet и mel Kas аллели по этому маркеру находятся очень близко, поэтому появление дополнительных пиков, характерных для контаминирующих клеток, при 30%-ой контаминации может быть расценено оператором либо как широко распространенный артефакт (статтеры), либо в качестве самостоятельных аллелей, в то время как ПО определяет их как дополнительные аллели при 20-30% контаминации.
Литература/References
1. Allen M, Bjerke M, Edlund H, et al. Origin of the U87MG glioma cell line: Good news and bad news. Sci Transl Med. 2016;8(354):354re3. doi:10.1126/scitranslmed.aaf6853.
2. Elgui de Oliveira D, Marques CS, Losi VC. "Cell identity" crisis: Another call for immediate action. Cancer Lett. 2016;381(1):122-3. doi:10.1016/j.canlet.2016.07.031.
3. Horbach SPJM, Halffman W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 2017;12(10):e0186281. doi:10.1371/journal.pone.0186281.
Эти примеры свидетельствуют, что, с одной стороны, данный метод более чувствителен по сравнению с очевидными признаками внутривидовой контаминации: изменение морфологии и скорости роста, изменение результатов воздействия различными препаратами и т.д. С другой стороны, требуется сформулировать общие рекомендации по настройке фильтра аллелей в ПО и разработать четкий алгоритм действий оператора при анализе результатов 8ТЯ-профилирования.
Заключение
Идентификация клеточных линий необходима для обеспечения надлежащего качества исследований и воспроизводимости результатов. Использование метода профилирования на основе коротких тандемных повторов является "золотым стандартом" для подтверждения подлинности клеточных линий человека, хранящихся в биобанках.
Полученные результаты показали соответствие профилей коммерческих клеточных линий с данными в международных базах, что подтверждает возможность использования набора СОгБК "ЭКСПЕРТ 26" (Гордиз, Россия) для идентификации образцов коллекции.
В рамках настоящей работы были получены профили уникальных линий и заложено начало собственной генетической базы БРК, что обеспечивает контроль качества образца на всех этапах существования клеточной линии в коллекции и гарантирует пользователям предоставление материала надлежащего качества.
Исследования на выявление предела обнаружения контаминации другой линией показали, что при содержании в общем пуле даже 4% культуры-контаминанта удается выявить ее отдельные аллели. Данные результаты свидетельствуют о более высокой чувствительности метода по сравнению с очевидными признаками внутривидовой контаминации: изменение морфологии и скорости роста, изменение результатов воздействия различными препаратами и т.д.
Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.
4. Capes-Davis A, Theodosopoulos G, Atkin I, et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. Int J Cancer. 2010;127(1):1-8. doi:10.1002/ijc.25242.
5. Drexler HG, Dirks WG, MacLeod RA, et al. False and mycoplasma-contaminated leukemia-lymphoma cell lines: time for a reappraisal. Int J Cancer. 2017; 140(5):1209-14. doi:10.1002/ ijc.30530.
6. Neimark J. Line of attack. Science. 2015;347(6225):938-40. doi:10.1126/science.347.6225.938.
7. Jarvis MF, Williams M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends Pharmacol Sci. 2016;37(4):290-302. doi:10.1016/j.tips. 2015.12.001.
8. Geraghty RJ, Capes-Davis A, Davis JM, et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 2014; 111(6):1021-46. doi:10.1038/bjc.2014166.
9. Visconti P, Parodi F, Parodi B, et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. Int J Cancer. 2021;148(6):1489-98. doi:101002/ijc.33370.
10. Almeida JL, Dakic A, Kindig K, et al. Interlaboratory study to validate a STR profiling method for intraspecies identification of mouse cell lines. PLoS One. 2019;14(6):e0218412. doi:10. 1371/journal.pone.0218412.
11. Gu M, Yang M, He J, et al. A silver lining in cell line authentication: Short tandem repeat analysis of 1373 cases in China from 2010 to 2019. Int J Cancer. 2022;150(3):502-8. doi:10.1002/ijc.33789.
12. Castro F, Dirks WG, Fähnrich S, et al. High-throughput SNP-based authentication of human cell lines. Int J Cancer. 2013;132(2):308-14. doi:10.1002/ijc.27675.
13. Didion JP, Buus RJ, Naghashfar Z, et al. SNP array profiling of mouse cell lines identifies their strains of origin and reveals cross-contamination and widespread aneuploidy. BMC Genomics. 2014;15(1):847. doi:101186/1471-2164-15-847.
14. Fasterius E, Raso C, Kennedy S, et al. A novel RNA sequencing data analysis method for cell line authentication. PLoS One. 2017;12(2):e0171435. doi:101371/journal.pone.0171435.
15. Chen X, Qian W, Song Z, et al. Authentication, characterization and contamination detection of cell lines, xenografts and organoids by barcode deep NGS sequencing. NAR Genom Bioinform. 2020;2(3):lqaa060. doi:101093/nargab/lqaa060.
16. Lung O, Candlish R, Nebroski M, et al. High-throughput sequencing for species authentication and contamination detection of 63 cell lines. Sci Rep. 2021;11(1):21657. doi:10.1038/ s41598-021-00779-5.
17. Masters JR, Thomson JA, Daly-Burns B, et al. Short tandem repeat profiling provides an international reference standard for
human cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98(14):8012-7. doi:10.1073/pnas.121616198.
18. Melnikova EV, Merkulova OV, Merkulov VA, et al. Human cell line identification by typing of short tandem repeats: world practice. Biopharm.J 2015;7(6):3-10. (In Russ.) Мельникова Е. В., Меркулова О. В., Меркулов В. А. и др. Идентификация клеточных линий человека с использованием метода генотипиро-вания короткими тандемными повторами: мировая практика. Биофармацевтический журнал. 2015;7(6):3-10. EDN VRRBXF.
19. Khorolsky MD, Semenova IS, Melnikova EN, et al. The use of short tandem repeat analysis for cell line authentification. BlOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie. 2019;19(4):251-60. (In Russ.) Хорольский М. Д., Семенова И. С., Мельникова Е. В. и др. Применение метода коротких тандемных повторов для аутентификации клеточных линий. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019;19(4):251-60. doi:10.30895/2221-996X-2019-19-4-251-260.
20. Tan JYY, Tan YP, Ng S, et al. A preliminary evaluation study of new generation multiplex STR kits comprising of the CODIS core loci and the European Standard Set loci. J Forensic Leg Med. 2017;52:16-23. doi:10.1016/j.jflm. 2017.07.017.
21. Cho WC, Jung JK, Cho Y, et al. Validation and assessment of the Investigator® 24plex QS kit for forensic casework application: Comparison with the PowerPlex® fusion system and GlobalFiler™ PCR amplification kits. Leg Med (Tokyo). 2021;52:101902. doi:101l016/j.legalmed.20211l01902.
22. Bär W, Brinkmann B, Budowle B, et al. DNA recommendations. Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems. International Society for Forensic Haemogenetics. Int J Legal Med. 1997;110(4):175-6. doi:101007/s004140050061.
23. Tanabe H, Takada Y, Minegishi D, et al. Cell line individualization by STR multiplex system in the cell bank found cross-contamination between ECV304 and EJ-1/T24. Tissue culture research communications: the journal of experimental & applied cell culture research. 1999;18:329-38. doi:10.11418/ jtca1981.18.4_329.
