CC BY
32
УДК / UDC 633.1:631.526.32:543.545
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПРАКТИКЕ ИСПЫТАТЕЛЬНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ В ОБЛАСТИ СЕМЕНОВОДСТВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
THE USE OF THE ELECTROPHORESIS METHOD IN THE PRACTICE OF TESTING LABORATORIES IN THE FIELD OF SEED PRODUCTION OF AGRICULTURAL CROPS
Клименков Ф.И., кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник
Klimenkov F.I., Candidate of Agricultural Sciences, Researcher Градсков С.М., кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Gradskov S.M., Candidate of Agricultural Sciences, Senior Researcher Клименкова И.Н., научный сотрудник Klimenkova I.N., Researcher Кузьмина Н.П., научный сотрудник Kuzmina N.P., Researcher Ворончихин В.В., кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник Voronchikhin V.V., Candidate of Agricultural Sciences, Researcher Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад имени Н.В. Цицина РАН, Москва, Россия Federal State Budgetary Institution of Science Main Botanical Garden named after N.V. Tsitsina RAS, Moscow, Russia
E-mail: [email protected]
Работа выполнена в рамках государственного задания ГБС РАН «Гибридизаиуя у растений в природе и культуре; фундаментальные и прикладные аспекты» (№ 19-119012390082-6)
Все сорта семян сельскохозяйственных культур характеризуются индивидуальным набором глиадинокодирующих локусов, что позволяет при использовании электрофореза по запасным белкам проводить идентификацию практически любого сорта и определения сортовой чистоты. Эти локусы формируются исходя из направления селекционной работы (искусственный отбор) и в меньшей степени, в зависимости от агроклиматических особенностей региона (естественный отбор). Сегодня в практике лабораторного сортового анализа используются различные биохимические методы: маркер-ориентированная и геномная селекция, геномное редактирование, дигаплоидные технологии и т.д., призванные к ускорению селекционного процесса по созданию сортов и недопущению фактов фальсификации на рынке сортовых семян. Одним из наиболее быстрых и сравнительно дешевых маркер-ориентированных методов, является электрофорез по запасным белкам семян. Изучение генетического полиморфизма проламинов, по электрофоретическим спектрам, позволяют использовать его для идентификации внутрипопуляционной структуры сортов и отдельных генотипов. Метод электрофореза по проламиновым белкам хорошо зарекомендовал себя при определении уровня гибридности семян перекростноопыляемых растений в лабораторных условиях. В научной работе показано, что анализ по спектру запасных белков, является эффективным и доступным методом проверки сортовой чистоты и принадлежности семян к сорту на всех этапах семеноводства в лабораторных условиях.
Ключевые слова: сорт, электрофорез, идентификация, сортовая чистота, метод, проламины.
All varieties of seeds of agricultural crops are characterized by an individual set of gliadin-coding loci, which makes it possible, when using electrophoresis for storage proteins, to identify almost any variety and determine varietal purity. These loci are formed based on the direction of breeding (artificial selection) and, to a lesser extent, depending on the agro-climatic characteristics of the region (natural selection). Today, in the practice of laboratory varietal analysis, various biochemical methods are used: marker-oriented and genomic selection, genomic editing, dihaploid technologies, etc., designed to accelerate the selection process
when creating varieties and prevent the facts of falsification of varietal seeds on the market. One of the fastest and relatively cheap marker-oriented methods is seed storage protein electrophoresis. The study of the genetic polymorphism of prolamins, based on electrophoretic spectra, makes it possible to use it for identifying the intrapopulation structure of varieties and individual genotypes. The method of electrophoresis for prolamine proteins showed good results in determining the level of hybridity of seeds of cross-pollinated plants in the laboratory conditions. The scientific work shows that the analysis of the storage proteins spectrum is an effective and affordable method for checking varietal purity and belonging of seeds to a variety at all stages of seed production in the laboratory conditions.
Key words: variety, electrophoresis, identification, varietal purity, method, prolamins.
Введение. В деятельности сельского хозяйства используется большой ассортимент разнообразных сортов семян сельскохозяйственных культур. В одном хозяйстве зачастую высеваются несколько сортов одной и той же культуры. При таких условиях появляется возможность механического смешивания сортов. Происходит это по причине того, что для посева, уборки и доработки зерна используются одни и те же сеялки, комбайны, сортировочные машины, недостаточная их очистка от семян предыдущего сорта [1].
При возделывании сортов и дальнейших продажах, закупках, часто возникают спорные вопросы о соответствии семян сорту и их чистосортности [2]. Зачастую, сложно визуально оценить сортовые качества семян. Грунтовой контроль и апробация сортовых посевов не всегда могут гарантировать точность этих показателей на 100%. Для идентификации сорта и определения сортовой чистоты семян используют различные биохимические методы: ПЦР технологии, геномное редактирование и т.д. Наибольшее распространение сегодня, получил маркер-ориентированный метод - метод электрофореза [3].
По мнению многих ученых, определить сортовую примесь и принадлежность к сорту позволяет метод электрофореза в полиакриламидном геле [4]. Анализ запасных белков семян с помощью электрофореза, дает возможность его применения не только для зерновых культур, но и для большого спектра семян сельскохозяйственных растений [5].
Цель исследований - провести генетический анализ различных партий сортов зерновых культур, используя метод электрофореза запасных белков, с целью установления сортовой чистоты и принадлежности к сорту.
Условия, материалы и методы. В процессе выполнения исследований пользовались научно-методическим руководством «Методика проведения лабораторного сортового контроля по группам сельскохозяйственных растений» [6]. При постановке электрофореза отбирались индивидуальные зерновки из композитной пробы от общей партии семян отобранной в соответствии с требованиями нормативно-технической документации.
Вертикальный электрофорез запасных белков, проводили по стандартной методике, с некоторыми изменениями. Глиадины экстрагировали 70% этанолом из размолотых семян, в присутствии красителя метиленового зеленого и 80% сахарозы. Электрофорез проводили в 7,5 % полиакриламидном геле в лактат-алюминиевом буфере (рН 3.1) при постоянном напряжении 550 V и времени 2,5 часа. После окончания электрофореза гели фиксировали и окрашивали в 10% трихлоруксусной кислоты с присутствием Кумасси R-250 [7].
Электрофорез в вертикальных пластинках ПААГ проводили на комплекте приборов для электрофореза белков, разработанном в Институте аналитического приборостроения КАС «Элфор-01» (г. Санкт-Петербург), так же, сканер для последующего хранения электрофореграмм в электронном виде, для
первичного анализа, установка с подсветкой через матовое стекло, магнитная мешалка и ручные дозаторы переменного объема.
Для идентификации и сравнения использовался эталонный спектр сорта, с которым сравнивали результат. В общий анализ исследуемой пробы подставлялась зерновка эталонного сорта, с которым необходимо проводить сравнение.
Исследования проводились на базе ФГБУ «Брянская межобластная ветеринарная лаборатория» в испытательной лаборатории семян.
Результаты и обсуждение. Для установления принадлежности к сорту и определения сортовой чистоты семян применяют общепризнанные методы: полевая апробация; грунтконтроль - посевы на делянках и сортовой лабораторный анализ.
Один из самых распространенных и широко применяемых сегодня - метод полевой апробации. При его использовании проводится оценка по морфологическим признакам растения, путем отбора и анализа апробационного снопа. Недостатком является субъективная оценка морфологических признаков сорта, только к моменту уборки, возможно, определить сортовую чистоту и принадлежность к тому или иному сорту. В практике повсеместно присутствуют случаи засорения семян при уборке урожая, послеуборочной доработке, при транспортировке и хранении.
Грунтконтроль, более точный метод, но в большей степени подходит для спорных и арбитражных целей, научных исследований. Высев семян осуществляется на делянках в поле, с последующими фенологическими наблюдениями за растениями на протяжении всего вегетационного периода. Метод по праву можно считать трудоемким, энергетически затратным и не устраняющим недостатки полевой апробации, связанные с возможностью засорения семян.
Из лабораторных методов сортового контроля, наиболее удобным, является идентификация сортов по электрофоретическому спектру проламинов
- запасных белков семян.
Метод полевой апробации не дает такой объективной оценки, как метод электрофореза. Это, в свою очередь, связано с двумя общеизвестными фактами
- апробация проводится только в вегетационный период и апробатор должен иметь соответствующую квалификацию, широкую область теоретических знаний в морфологических признаках апробируемых посевов сортовых семян. Полевая апробация имеет ограничения по времени, так как проводится только в фазу цветения, то метод электрофореза, возможно, успешно применять на всех этапах от уборки и до посева.
Электрофорез запасных белков - метод сравнительно недорогой, более надежный и быстрый, утвержденный в качестве международного стандартного метода семенного контроля International Seed Testing Association - ISTA (международная ассоциация по контролю за качеством семян). Метод имеет широкое распространение по разным группам сельскохозяйственных культур - зерновые, зернобобовые, овощные и т.д. Суть метода заключается в использовании белков, которые под действием напряжения «разгоняются», в итоге получается картинка -электрофореграмма, которую уже можно сравнить с эталоном (стандартом) сорта, он так же уникален, как отпечаток пальца (рис.). Метод является признанным в Белоруссии, Украине, в странах Евросоюза. Всё большую значимость в сортовом контроле приобретает биохимический паспорт сорта (генетическая формула запасных белков сорта), которая включается в описание морфологических признаков сорта наряду с хозяйственно-биологической характеристикой в каталог используемых сортов и патентуется одновременно с сортом.
Рисунок - Визуальные возможности метода электрофореза по полиморфизму глиадиновьх спектров различных сортов пшеницы из коллекции ФГБУ «Брянская МВЛ»
Уникальность метода заключается в том, что он дает возможность работать с генотипом растений, что позволяет не допускать ошибок, вызванных сортовой изменчивостью, при фенотипической оценке, так как спектр белков остается стабильным и независимым от условий окружающей среды.
Метод электрофореза является наиболее эффективным на технологических этапах уборки, транспортировки, доработки, хранения и реализации семян, на которых и происходит подавляющее большинство случаев механического засорения сортов.
Широкое применение метод электрофореза запасных белков получил в пивоваренной промышленности. Для получения солода высокого качества, одним из необходимых условий является равномерность и дружность всходов на определенный день. Это, в свою очередь, достигается только при проращивании однотипных сортов пивоваренного ячменя с одинаковым периодом вегетации. Для выполнения этого условия нужно знать сортовую чистоту, той или иной партии семян, а еще более основополагающим фактором является соответствие принадлежности к заявленному сорту. Здесь, электрофорез, является основным лабораторным методом.
На базе ФГБУ «Брянская МВЛ» в испытательной лаборатории семян с 2010 года был освоен и внедрен в практику метод вертикального электрофореза с целью определения принадлежности к сорту и сортовой чистоты (или чистосортности) семян злаковых культур.
С 2012 по 2015 гг., испытательная лаборатория провела исследования по 170 партиям семян зерновых культур, общим весом 13394 тонн, от которых для лабораторного сортового анализа было отобрано 281 проба (табл.). По результатам исследований установлено несоответствие требованиям нормативных документов по сортовой чистоте в 70 партий семян общим весом 7087,4 тонн, различных категорий семян (41% от партий и 53% от общего веса соответственно). Одна партия элитных семян озимой пшеницы сорта «Московская 39» из Тамбовской области, не соответствовала заявленному сорту, показатель сортовой чистоты составил 7% от заявленного сорта, выявлена фальсификация при закупке семян. У сорта «Московская 56» на стадии перехода оригинальных семян в элитные, выявлены признаки нарушения одного из важных условий сортоведения - стабильность сорта на генетическом уровне. С помощью электрофореза выявлены генетические различия между индивидуальными зерновками сорта «Московская 56» в посевах питомника 1 года размножения и элиты.
Таблица - Информация о сортовых качествах семян сельскохозяйственных растений за 2012-2015 гг._
Год Проведено исследований всего Выявлено объектов несоответствующих требованиям ГОСТ
Количество Масса Количество Количество Масса Количество
партий, шт. партий, ц проб, шт. партий, шт. партий, ц проб, шт.
2012 30 16923 30 16 10304 16
2013 47 28195 66 18 8750 23
2014 51 34937 78 23 21120 44
2015 42 53885 107 13 30700 58
Аккредитация ФГБУ «Брянская МВЛ» Федеральной службой по аккредитации «Росаккредитация» в системе государственного надзора в области семеноводства в 2011 году, уполномочивание испытательной лаборатории Учреждения в системе добровольной сертификации семян «СемСтандарт» в 2012 году в качестве органа по сертификации и испытательной лаборатории по определению сортовых, посевных качеств семян и посадочного материала, позволила в полной мере и на законных основаниях приступить к проведению испытаний по идентификации сортов зерновых культур методом вертикального электрофореза, с выдачей протокола испытаний установленного образца.
Согласно Федеральному закону от 27.12.2002 N 184-ФЗ (ред. от 02.07.2021) «О техническом регулировании» на основании Статьи 21. «Добровольное подтверждение соответствия», все партии семян каждого сорта при перемещении и реализации, должны сопровождаться актом апробации и протоколом испытаний (сертификатом соответствия), подтверждающего сортовые и посевные качества семян, Управление Россельхознадзора по Брянской и Смоленской областям, при осуществлении контрольно-надзорной деятельности, смогло пресекать последующую реализацию партий семян не соответствующих требованиям нормативных документов по сортовой чистоте.
Заключение. Метод электрофореза является одним из перспективных для идентификации видовых и сортовых смесей в семенном контроле, которые при визуальной оценке невозможно отличить по морфологическим признакам. Плюсом метода является его относительная доступность, высокая экономическая целесообразность при сравнении с другими биохимическими методами. Спектры электрофореза запасных белков практически не зависят ни от условий выращивания, ни от условий и длительности хранения семян. Объективные электрофореграммы уже возможно получать в период молочной спелости зерна. Таким образом, при использовании лабораторного сортового контроля с помощью метода электрофореза проламиновых белков, возможно, достаточно точно и быстро устанавливать внутрипопуляционный полиморфизм, генотипы растений, принадлежность к сорту и сортовую чистоту семян, сопоставляя результаты с проведенной апробацией сортовых посевов, но ни коем образом не подменяя их. Результаты исследований, полученные при использовании метода электрофореза, не заменимы в осуществлении контрольно-надзорной деятельности в области семеноводства со стороны надзирающих органов.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Батманова Л.С. Разработка экспресс-метода определения сортовой чистоты путем электрофоретического анализа белков семян овощных культур семейства капустных: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Москва, 1991, 23 с.
2. Тоболова Г.В. Идентификация сортов пшеницы различных партий семян элиты в Тюменской области // Аграрный вестник Урала. 2009. № 5 (59). С. 63-64.
3. Тоболова Г.В. Идентификация и сортовая чистота партий элиты пшеницы в Тюменской области // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2012. № 3. С. 12-18.
4. Поморцев A.A., Лялина Е.В. Лабораторный контроль сортовой принадлежности и сортовой чистоты партий семян и товарного зерна пивоваренного ячменя // Зерновое хозяйство России. 2009. № 6. С. 29-39.
5. Полиморфизм запасных белков и использование его в семеноводстве пшеницы и ячменя / Н.В. Давидчук, Е.М. Корабельская, Н.В. Еремеева, Г.И. Кобыльский // Вестник Тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. 2009. Т. 14. № 1. С. 116-121.
6. Методика проведения лабораторного сортового контроля по группам сельскохозяйственных растений / A.A. Поморцев [и др.]. М.: Издательство ФГНУ «Росинформагротех», 2004. 95 с.
7. Шпилев Н.С., Ториков В.Е., Клименков Ф.И. Использование электрофореза в оригинальном семеноводстве зерновых культур // Вестник Брянской государственной сельскохозяйственной академии. 2019. № 1 (71). С. 27-32.
REFERENCES
1. Batmanova L.S. Razrabotka ekspress-metoda opredeleniya sortovoy chistoty putem elektroforeticheskogo analiza belkov semyan ovoshchnykh kultur semeystva kapustnykh: avtoref. dis. ... kand. biol. nauk. Moskva, 1991, 23 s.
2. Tobolova G.V. Identifikatsiya sortov pshenitsy razlichnykh partiy semyan elity v Tyumenskoy oblasti // Agrarnyy vestnik Urala. 2009. № 5 (59). S. 63-64.
3. Tobolova G.V. Identifikatsiya i sortovaya chistota partiy elity pshenitsy v Tyumenskoy oblasti // Sibirskiy vestnik selskokhozyaystvennoy nauki. 2012. № 3. S. 12-18.
4. Pomortsev A.A., Lyalina Ye.V. Laboratornyy kontrol sortovoy prinadlezhnosti i sortovoy chistoty partiy semyan i tovarnogo zerna pivovarennogo yachmenya // Zernovoe khozyaystvo Rossii. 2009. № 6. S. 29-39.
5. Polimorfizm zapasnykh belkov i ispolzovanie ego v semenovodstve pshenitsy i yachmenya / N.V. Davidchuk, Ye.M. Korabelskaya, N.V. Yeremeeva, G.I. Kobylskiy // Vestnik Tambovskogo universiteta. Seriya: Yestestvennye i tekhnicheskie nauki. 2009. T. 14. № 1. S. 116-121.
6. Metodika provedeniya laboratornogo sortovogo kontrolya po gruppam selskokhozyaystvennykh rasteniy / A.A. Pomortsev [i dr.]. M.: Izdatelstvo fGnU «Rosinformagrotekh», 2004. 95 s.
7. Shpilev N.S., Torikov V.Ye., Klimenkov F.I. Ispolzovanie elektroforeza v originalnom semenovodstve zernovykh kultur // Vestnik Bryanskoy gosudarstvennoy selskokhozyaystvennoy akademii. 2019. № 1 (71). S. 27-32.
