16IIМеждународная научно-практическая конференция
УДК 577.22
Сабуров Александр Сергеевич Saburov Alexander Sergeyevich
Магистрант Master student
Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М Сеченова
I.M. Sechenov First Moscow State Medical University
Лупанова Татьяна Николаевна Lupanova Tatiana Nikolaevna
Младший научный сотрудник Junior researcher
Уласов Алексей Валентинович Ulasov Aleksey Valentinovich
Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
PhD in Biology, senior scientist Институт биологии гена РАН Institute of Gene Biology RAS
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЕЙЦИНОВОЙ МОЛНИИ ДЛЯ ПРИСОЕДИНЕНИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА NRF2 К МОДУЛЬНОМУ НАНОТРАНСПОРТЕРУ
USING LEUCINE ZIPPER TO ATTACH NRF2 TRANSCRIPTION FACTOR
TO MODULAR NANOTRANSPORTER
Аннотация: Показана возможность посттрансляционного соединения модульного нанотранспортера (МНТ) и транскрипционного фактора Nrf2 при помощи высокоафинного белкового мотива лейциновой молнии.
Abstract: Shown the possibility of post-translation combining of modular nanotransporter (MNT) and Nrf2 via high affinity protein leucine zipper motif.
Ключевые слова: Nrf2, Ze/Zr, МНТ, лейциновая молния, факторы транскрипции. Key words: Nrf2, Ze/Zr, MNT. leucine zipper, transcription factor.
Nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2 (Nrf2) это транскрипционный фактор человека, который играет критическую роль в поддержании клеточного гомеостаза при окислительном стрессе. В литературе транскрипционный фактор Nrf2 описывают как «мастер-регулятор клеточного ответа на окислительный
Новые импульсы развития: вопросы научных исследований стресс», отсылая к широкому спектру контролируемых им процессов: от антиоксидантной и антиксенобиотической защиты, до регуляции аутофагии, контроля активности протеасом и метаболизма питательных веществ [1].
В клетках Nrf2 находится под постоянным контролем репрессорного белка Keap1 (Kelch-like ECH associating protein 1), являющегося своеобразным молекулярным «сенсором» изменения внутриклеточного гомеостаза. Связанный с Keap1, Nrf2 непрерывно подвергается убиквитинилированию с последующей деградацией в протеосомах. В случае окислительного стресса или действия ксенобиотиков происходит модификация остатков цистеина Кеар1, что ведет к изменению его конформации и высвобождению Nrf2 из комплекса с ингибитором с последующей транслокацией Nrf2 в ядро, где он связывается с Antioxidant Response Elements (ARE-элементами) в промоторной области регулируемых им генов, тем самым активируя их. Тесная взаимосвязь этих двух белков позволяет объединить их в единую редокс-чувствительную сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, контролирующую активность более сотни цитозащитных генов. Как пример можно назвать глутатионовые и тиоредоксиновые антиоксидантные системы, ферменты I, II и III фаз детоксикации, гены метаболизма гема, липидов, углеводов и регенерации NADPH [2].
С практической точки зрения, Nrf2 интересен своей вовлеченностью в патогенез большого числа заболеваний, ассоциированных с окислительным стрессом: диабет, нейродегенеративные, сердечно-сосудистые заболевания и рак. На различных клеточных и животных моделях этих заболеваний активация Nrf2/ARE дает значительный терапевтический эффект. В случае же с злокачественными новообразованиями, наоборот интерес представляет ингибирование действия транскрипционного фактора [2, 3].
Индукторы Nrf2 в большинстве своем представлены электрофильными соединениями, которые модифицируют остатки цистеина ^ар-1. Другим типом активаторов Nrf2 являются ингибиторы белок-белкового взаимодействия Keap1:Nrf2. В настоящее время предложено значительное количество
//Международная научно-практическая конференция преимущественно электрофильных индукторов Nrf2, находящихся на разных фазах клинических испытаний или уже одобренных к применению, как TECFIDERA (dimethyl fumarate) от Biogen для лечения рассеянного склероза. Однако, эти соединения отличает высокая реактивность и неспецифичность действия [3].
Альтернативой этому подходу является доставка Nrf2 в полноразмерном виде в клетки-мишени. Для достижения этой цели мы планируем использовать модульные нанотранспортеры (МНТ), рекомбинантные белки, ранее доказавшие свою эффективность в доставке регуляторных белков и низкомолекулярных соединений в клетки [4]. Препятствием на этом пути выступают ограничения систем бактериального синтеза, в которых затруднительно наработать рекомбинантный белок более 100 кДа. В связи с этим была избрана стратегия посттрансляционного соединения рекомбинантных Nrf2 и МНТ, наработанных в E. coli. Для решения задачи нами был выбран высокоафинный белковый мотив лейциновой молнии, обеспечивающий соединение этих белков в комплекс за счет амфифильных взаимодействий доменов [5].
На N-конец Nrf2 и C-конец МНТ в рамках настоящей работы были клонированы фрагменты лейциновой молнии Ze/Zr. Наработку белков проводили в штамме E. Coli BL21(DE3). МНТ выделяли из растворимой фракции с помощью Ni-NTA аффинной хроматографии, как описано ранее [6]. Биомассу клеток с индукцией синтеза Nrf2 лизировали, затем белки были выделены из телец включения солюбилизирующим буфером с 8M Urea и 100 цМ DTT и диализованы в PBS с 100 цМ DTT. Образование комплекса МНТ с Nrf2 проводили при 4oC и различных молярных соотношениях (1:1, 2:1 и 4:1) в течение. 18-21 часов. После образования комплекса МНТ-М^, он был очищен с помощью Ni-NTA аффинной хроматографии, за счет His-tag в составе МНТ. Подтверждение образования комплекса осуществлялось иммуноблоттингом с антителами на МНТ и Nrf2.
Новые импульсы развития: вопросы научных исследований
Проведенная работа показывает принципиальную возможность пострансляционного объединения крупных белков при помощи высокоафинной лейциновой молнией Ze/Zr.
Работа поддержана грантом Российского научного фонда (проект № 17-1401304).
Библиографический список:
1. Hayes J. D., Dinkova-Kostova A. T. The Nrf2 regulatory network provides an interface between redox and intermediary metabolism //Trends in biochemical sciences. - 2014. - Т. 39. - №. 4. - С. 199-218.
2. Robledinos-Anton N. et al. Activators and inhibitors of NRF2: a review of their potential for clinical development //Oxidative medicine and cellular longevity. -2019. - Т. 2019.
3. Li Q. et al. Reasonably activating Nrf2: A long-term, effective and controllable strategy for neurodegenerative diseases //European journal of medicinal chemistry. - 2019. - С. 111862.
4. Rosenkranz A. A. et al. Delivery systems exploiting natural cell transport processes of macromolecules for intracellular targeting of Auger electron emitters //Nuclear Medicine and Biology. - 2019.
5. Moll J. R. et al. Designed heterodimerizing leucine zippers with a ranger of pIs and stabilities up to 10- 15 M //Protein Science. - 2001. - Т. 10. - №. 3. - С. 649655.
6. Gilyazova D. G. et al. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters //Cancer research. - 2006. - Т. 66. - №. 21. - С. 10534-10540.
