CC BY
50
УДК [597-113.32:546.3/7Т]:519.237.8
А. В. Туктаров, А. Н. Неваленный, А. С. Мартьянов
Астраханский государственный технический университет
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛАСТЕРНОГО АНАЛИЗА В ИССЛЕДОВАНИИ ХАРАКТЕРА ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ НА ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ РУССКОГО ОСЕТРА
Введение
В настоящее время в ряде биологических наук, в частности в физиологии, стали возникать проблемы, связанные с обобщением накопленных данных и их анализом как целостных комплексов. Подобные задачи, в особенности на начальных стадиях исследования, когда не имеется четких гипотез относительно структуры полученных данных, с успехом решаются при помощи различных классификационных методов, относимых в целом к многомерному статистическому анализу.
Одним из подобных методов является кластерный анализ, предназначенный прежде всего для решения задач классификации с помощью самых разнообразных техник, а также способный решить сопутствующие задачи - описание данных и выявление определенных закономерностей -и представить их как в табличной, так и в более наглядной графической интерпретации. К преимуществам метода относятся его гибкость в решении задач, разнообразие алгоритмов решения, анализ целостного комплекса данных и возможность обработки данных с пропусками, а также возможность использования метода при отсутствии предварительных гипотез о распределении данных, что наблюдается достаточно часто при исследовании таких сложных структур, как ферменты. Анализ комплекса данных в целом (без вычисления величин, предположительно характеризующих группы данных) составляет отличительную черту кластерного анализа. Использование метода в целом позволяет, по нашему мнению, по-новому взглянуть на получаемые данные и наблюдаемые в них закономерности, а возможно и выявить новые взаимосвязи типа «воздействие - ответ».
Целью данной работы в связи с вышеизложенным является кластеризация при помощи иерархического кластерного анализа данных о влиянии ионов тяжелых металлов на а-амилазу и мальтазу слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра, а также выявление существующих закономерностей.
Работа проводилась в течение 2004-2006 гг. на половозрелых самках русского осетра (Ааретег guldenstйdti Вга^^), выловленных в Северном Каспии. В качестве ферментативно активных препаратов использовались гомогенизированные в растворе Рингера слизистая оболочка кишечника и содержимое пилорической железы, разведенные в 100 раз. Эксперимен-
ты проводили в условиях in vitro при температуре 25 °С. Изучалось влияние 6 ионов тяжелых металлов (Ni2+, Cu2+, Co2+, Fe2+, Zn2+ и Mn2) в концентрациях 10 и 0,1 мг/л на а-амилазу и мальтазу слизистой оболочки кишечника, а также пилорической железы русского осетра. Источниками ионов служили растворимые в воде сернокислые соли исследуемых металлов. При определении активности исследуемых ферментов использовали стандартные физиолого-биохимические методики. Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью программы StatSoft Sta-tistica 6.0, модуль Cluster Analysis.
Необходимо подчеркнуть, что кластерный анализ включает в себя ряд алгоритмов классификации, позволяющих организовать наблюдаемые данные в наглядные структуры. Изучаемое множество данных при этом сжимается в более компактную классификацию объектов. Целью проведения подобного анализа является классификация полученных данных и выделение групп сходных реакций фермента при изменяемых условиях эксперимента, а именно при воздействии на фермент различных ионов в различных концентрациях. Для каждого из исследуемых ферментов анализу подвергалась вся полученная совокупность данных, причем данные, полученные для ферментов слизистой кишечника и пилорической железы, анализировались совместно. Для классификации использовался метод иерархического кластерного анализа (tree clustering), который подразумевает выбор двух параметров: способов вычисления расстояний между объектами (переменными и кластерами) и правил объединения кластеров [1]. Расстояния между объектами вычислялись как евклидовые расстояния по формуле
R = V(x _ xo)2 + (y ~ yo)2 + (z _ zo)2 +...,
где R - расстояние между объектами с координатами (x; y; z; ...) и (x0; y0; z0; .) соответственно (применительно к данному случаю каждая из переменных определялась шестью координатами). В качестве правила объединения переменных в кластеры и кластеров между собой было принято объединение по методу полной связи, известное также как «метод наиболее удаленных соседей». Расстояние между кластерами при этом определяется наибольшим расстоянием между любыми двумя объектами в различных кластерах [2]. Этот метод дает хорошие результаты при существенно различающихся характеристиках исследуемых объектов (хотя в общей совокупности данных эти различия могут не выделяться) [3, 4].
В результате проведения кластерного анализа экспериментальные данные как для а-амилазы, так и для мальтазы были четко подразделены на 3 группы. Однако при интерпретации результатов необходимо учитывать специфику вычисления расстояний между объектами - основное влияние на величину расстояний оказывают доминирующие разности, тогда как мелкие различия практически игнорируются. Особенность проведенного анализа заключается также и в том, что классификацию объектов можно проводить различным образом, в зависимости от расстояния между объектами, и с ростом расстояния число выделенных кластеров уменьшается.
Результаты кластеризации показаны на рис. 1 и 2. Как видно из рис. 1, на расстоянии равном 5 выделяется 5 кластеров, на расстоянии 8 - 3, на расстоянии 10 - 2 кластера, а на расстоянии 20,8 все объекты объединяются в 1 кластер. Выбор расстояния зависит от необходимой подробности описания, а также от предварительных целей проведения анализа. Однако в любом случае результаты анализа показывают сильную обособленность группы, включающей в себя данные о влиянии изучаемых ионов в концентрации 10 мг/л на а-амилазу слизистой оболочки кишечника (рис. 1).
Tree D i a g га m f о г Va ri а Ы es Complete Linkage Euclidean distances
Control, 10i Mn, 10i Fe, 10 i Zn, 10i Co, 10i Си, 10 i Ni. 10i Control, 1/1 Oi Co. 1/10i Fe,10p Hi. 10p Mn. 1/10i Cu. 10p Zn. 10p Fe. 1/10i Cu. 1/1 Oi Hi. 1/10 i Zn. 1/10 i Control, p Cu. 1/10p Fe. 1/10p Mn, 10p Hi. 1/1 Op Mn. 1/1 Op Co. 1/10p Zn. 1/1 Op Co. 10p
0 5 10 15 20 25
Linkage Distance
Рис. 1. Результаты классификации, полученные для а-амилазы слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра. Обозначения: по вертикали - переменные, содержащие данные по уровням активности фермента в присутствии ионов металлов в концентрации 10 и 0,1 мг/л. Индекс <а» - данные для фермента слизистой оболочки кишечника, «р» - пилорической железы
В случае мальтазы данные о влиянии на фермент ионов в концентрации 10 и 0,1 мг/л также достаточно четко разграничены, тогда как результаты относительно ферментов кишечника и пилорической железы полностью обособлены, что показано на рис. 2 (для а-амилазы такая «изоляция» объектов в зависимости от происхождения энзима является не столь полной).
В целом нам представляется, что успешная классификация данных, учитывающая цели исследования, может быть произведена при выбранном расстоянии 8 для а-амилазы (рис. 1) и 10 - для мальтазы (рис. 2). Существенно также и то обстоятельство, что результаты классификации этих 2-х ферментов можно сравнивать, несмотря на то, что уровни их активности измерены различным образом.
Рис. 2. Результаты классификации, полученные для мальтазы слизистой оболочки кишечника и пилорической железы русского осетра. Обозначения те же, что и для рис. 1
Полученные в результате анализа дендрограммы дают понятие о распределении изучаемых переменных (т. е. объектов) относительно друг друга. При этом переменные, расположенные наиболее близко друг от друга, объединены в группы - кластеры. Кластеры по тому же принципу объединены между собой, число их с расстоянием уменьшается, а в конечном итоге все переменные объединяются в единый кластер. Однако можно заметить, что наиболее четко различные группы данных обособлены друг от друга на расстоянии 8 (рис. 1) и 10 (рис. 2).
Каждая из переменных представляет собой реакцию фермента на присутствие в растворе какого-либо из исследуемых ионов, причем содержит данные по всем наблюдениям относительно данного иона определенной концентрации и определенного типа ферментативно активного препарата, причем данные наблюдений представлены как координаты этой переменной [5]. При этом необходимо учитывать, что при взаимодействии исследуемых ионов с ферментами может иметь место не только механизм прямого связывания иона с серосодержащими аминокислотами каталитического центра белка, но и кооперативный аллостерический эффект, приводящий не к снижению, а к повышению эффективности катализа [6].
Заключение
Непосредственно результаты кластерного анализа свидетельствуют о серьезных различиях в уровне активности и в её изменении под воздействием ионов металлов между ферментами слизистой оболочки и кишечника и содержимого пилорической железы, что особенно ярко проявляется в случае мальтазы (переменные с индексом «i» отделены от переменных с индексом «р». При анализе результатов оказалось, что совокупность данных отчетливо подразделяется на 3 группы, в случае а-амилазы расстояние между группами равно 8, а для мальтазы - 10. Кластеры, соответствующие указанным расстояниям, содержат следующие группы переменных (выделяемые согласно приведенным рисункам в направлении сверху вниз):
1. Для а-амилазы:
- Control, 10i; Mn, 10i; Fe, 10i; Zn, 10i; Co, 10i; Cu, 10i, Ni, 10i;
- Control, 1/10i; Co, 1/10i; Fe, 10p; Ni, 10p; Mn, 1/10i; Cu, 10p; Zn, 10p; Fe, 1/10i; Cu, 1/10i; Ni, 1/10i; Zn, 1/10i;
- Control, p; Cu, 1/10p; Fe, 1/10p; Mn, 10p; Ni, 1/10p; Mn, 1/10p; Co, 1/10p; Zn, 1/10p, Co, 10p.
2. Для мальтазы:
- все данные, полученные на слизистой кишечника;
- данные, полученные при исследовании воздействия ионов в концентрации 1/10 мг/л на мальтазу содержимого пилорической железы, а также Cu, 10p, Zn, 10p и Fe, 10p;
- Control, p; Ni, 10p; Co, 10p; Mn, 10p.
Итак, для амилазы четко выделен кластер, отграничивающий данные о воздействии ионов в концентрации 10 мг/л на ферменты слизистой оболочки кишечника, тогда как для мальтазы все данные о воздействии исследуемых ионов на мембранно-связанные ферменты кишечника выделены в отдельную группу. Это свидетельствует о большем различии реакций на присутствие ионов тяжелых металлов между ферментами слизистой оболочки кишечника и пилорической железы в случае изучения мальтазы, нежели адсорбированной а-амилазы.
Однако в том и в другом случае классификация свидетельствует о серьезном различии в поведении ферментов кишечника и пилорической железы (это наблюдается даже при сравнении точек контроля), что позволяет предположить значительные структурные и функциональные различия данных ферментов. К тому же более внимательное изучение группировок, образуемых на расстояниях порядка 2,5, позволяет обнаружить (особенно для а-амилазы) разграничение в отдельные группы данных соответственно изучаемым концентрациям ионов. Этот вывод подтверждают также и более ранние исследования [1], в которых обработка данных производилась методами вариационной статистики.
Другой момент заключается в положении точек данных относительно контроля, где производилось определение нативной активности ферментов (на рис. 1, 2 обозначена как переменная Control). Во всех случаях (за исключением кластера, содержащего переменную Control, 1/10i в результатах анализа а-амилазы) ближайшими точками к переменной Control,
с которыми она объединялась в один кластер, были точки, содержащие данные по воздействию на фермент концентраций 10 мг/л (т. е. самой высокой концентрации, а не низкой, как можно было бы ожидать). Результаты классификации не позволяют сделать надежных выводов о зависимости уровня активности исследуемых ферментов от природы изучаемых токсикантов, однако данные довольно четко кластеризованы относительно исследуемых концентраций ионов. Относительно изучаемого явления целесообразно, по нашему мнению, выделить следующие положения:
1. Модельность эксперимента.
2. Несомненность взаимодействия всех исследуемых металлов с исследуемыми ферментами.
3. Положение о 2-х факторах, оказывающих влияние на поведение ферментов: концентрация металла и природа металла (сродство к активному центру, строение электронной оболочки), хотя последняя не поддается четкой оценке либо классификации.
4. Неодинаковый характер воздействия металлов на уровень активности а-амилазы и мальтазы, а также на ферменты слизистой оболочки кишечника и пилорической железы.
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Электронный учебник по статистике. - М.: StatSoft. WEB: http://www.statsofl.ru/ ^теЛехШоокМе!аик.Йт.
2. Глинский В. В., Ионин В. Г. Статистический анализ: Учеб. пособие. - 3-е изд., пере-раб. и доп. - М.: ИНФРА-М; Новосибирск: Сибирское соглашение, 2002. - 241 с.
3. Репин С. В., Шеин А. С. Математические методы обработки статистической информации с помощью ЭВМ. - Минск: Университетское, 1990. - 128 с.
4. Дюран Б. Кластерный анализ - М.: Статистика, 1977 - 128 с.
5. Факторный, дискриминантный и кластерный анализ / Под ред. И. С. Енюкова. -М.: Финансы и статистика, 1989. - 215 с.
6. Неволенный А. Н., Туктаров А. В., Бедняков Д. А. Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб: Моногр. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2003. - 152 с.
Статья поступила в редакцию 24.03.06, в окончательном варианте - 20.04.06
THE USE OF CLUSTER ANALYSIS IN THE CHARACTER RESEARCH OF THE INFLUENCE OF METAL IONS ON DIGESTIVE ENZYMES OF THE RUSSIAN STURGEON
A. V. Tuktarov, A. N. Nevalennyy, A. S. Martyanov
A comparatively new approach to the data analysis on the influence of environmental aspects on the realization of physiological
functions of hydrobionts organisms is demonstrated in the article. The data on the influence of metal ions on the activity level of digestive enzymes of the Russian sturgeon are analysed there. The classification method used for the analysis allows marking out some groups of data. On considering them, it is possible to find out some differences in the behaviour depending on the effect of investigated factors between enzymes as well as between ferments that have different origin. The authors of the article came to the conclusion that the concentration of metal ions has a greater influence on the activity level of enzymes in comparison with the nature of influencing factors.
