CC BY
14
В частности, при выборе пищевых продуктов и сырья для лабораторного контроля на наличие ГМО необходимо руководствоваться современным перечнем зарегистрированных линий биотехнологических растений, рейтингом и тенденциями их использования.
За унифицированной системой контроля за производством и оборотом ГМО стоит стан-
дартизированная методология по обнаружению и оценке генетически модифицированного сырья и продукции сельского хозяйства. Это помогает обеспечить преемственность между импортирующими и экспортирующими сторонами на международном продовольственном рынке.
Библиографический список
1. Правовое регулирование использования и охраны биологических ресурсов: науч.-практич. пособие / С. А. Боголюбов [и др.]; под. ред. Е. Л. Минина. М.: Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации: ИНФРА-М, 2018. 328 с.
2. Теоретические и практические аспекты использования биотехнологии и генной инженерии: монография / Г. В. Максимов [и др.]. Изд. 2-е, перераб. и доп. Пос. Персиановский: Донской ГАУ, 2014. 399 с.
3. Тышко Н. В., Садыкова Э. О. Генно-инженерно-модифицированная пищевая продукция: развитие российской системы оценки безопасности // Анализ риска здоровью. 2018. № 4. С. 120-127.
© Тесля Е. А, Кузьменко А. С., Якушкин И. В., 2021
УДК 639.2.09
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИННОВАЦИОННЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МЕТАЦЕРКАРИЕВ ОПИСТОРХИСА В ПРОМЫСЛОВОЙ РЫБЕ
Тесля Елена Александровна,
студент
Кузьменко Анастасия Сергеевна,
студент
Якушкин Игорь Викторович,
канд. ветеринар. наук, доцент кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы Омский государственный аграрный университет им. П. А. Столыпина (г. Омск)
В научной статье рассматривается эффективность использования инновационных методов обнаружения метацеркариев описторхиса в промысловой рыбе на примере ПЦР и ИФА. Проводится их сравнительная оценка с традиционными методами исследования.
Ключевые слова: описторхоз, ПЦР, ИФА, инвазия.
THE USE OF INNOVATIVE DIAGNOSTIC METHODS TO DETECT OPISTHORCHIS METACERCARIAE IN COMMERCIAL FISH
Teslya Elena Aleksandrovna,
graduate student
Kuzmenko Anastasia Sergeevna,
graduate student
Yakushkin Igor Viktorovich,
Ph. D. in Veterinary Sciences, Associate Professor of the Veterinary and Sanitary Expertise Department Omsk State Agrarian University named after P. A. Stolypin (Omsk)
In this article we consider the efficiency of innovative methods of opisthorchis metacercariae detection in commercial fish on the example of PCR and ELISA. We will carry out their comparative evaluation with traditional research methods.
Key words: opisthorchiasis, PCR, ELISA, infestation.
Описторхоз - природно-очаговое заболевание ряда млекопитающих, преимущественно собак, кошек, пушных зверей, львов, реже свиней, а также человека, вызываемое трематодой Opisthorchis felineus (кошачья или сибирская двуустка), сем. Opisthorchidae, паразитирующей в желчных ходах печени, желчном пузыре и реже в протоках поджелудочной железы [1].
Описторхоз - важная социальная проблема в России. Именно на нашу страну приходится большая часть зарегистрированных заболеваний в мире. Описторхоз составляет около 80 % всех гельминтозов. Согласно официальным статистическим данным, ежегодно регистрируется до 26 000 случаев. Фактическое количество больных описторхозом, с учетом корректирующего фактора, - в 15 раз больше.
Всего в 2014-2018 годах выявлено 106 362 случая инвазии. Максимальное количество случаев зафиксировано в 2014 году (25 545 случаев), минимальное - в 2017 году (18 755 случаев). Заболеваемость описторхозом среди населения в 2018 году снизилась на 25,3 % по сравнению с 2014 годом, составив 12,79-17,51 случаев на 100 тыс. человек населения [2].
Обь-Иртышский бассейн занимает главенствующее место как очаг инвазии описторхи-са. Рыбы семейства карповых на 85 % поражены метацеркариями, что, несомненно, влияет на здоровье населения Западно-Сибирского региона. Поэтому важно своевременно выявлять пораженную метацеркариями рыбу ещё на стадии допуска к продаже.
Стандартным методом исследования промысловой рыбы на поражение описторхозом является компрессорный метод и переваривание мышечной ткани в искусственном желудочном соке.
В связи с потенциальным риском передачи описторхоза в результате торговли рыбой, для
обеспечения безопасности пищевых продуктов приобрели значение быстрые и надежные методы обнаружения. Молекулярная диагностика описторхоза с помощью полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР), нацеленной на повторяющийся элемент ДНК, обеспечивает высокую специфичность и вариабельную чувствительность [3].
Несмотря на ряд преимуществ, которыми обладают классические методы диагностики и мониторинга гельминтозов промысловой рыбы, такие как компрессорный метод и метод переваривания мышечной ткани в искусственном желудочном соке, внедрение современных методов паразитологического анализа может привести к повышению эффективности проводимого исследования за счет лучшей чувствительности и специфичности к определенным паразитам. Данные методы способны обеспечить быстрый и экономичный инструмент для одновременной идентификации нескольких видов паразитов. Это связано с упрощением диагностики, мониторинга и систематизации полученных результатов, например, используя метод ПЦР при ветеринарно-санитарной оценке промысловой рыбы [4].
Однако необходимо отметить, что, в сравнении с процессом компрессорного анализа, исследование рыбы методами ПЦР или имму-ноферментного анализа (далее - ИФА), может иметь не только свои преимущества, но также достаточно трудностей, с которыми могут столкнуться специалисты при работе с ними. Для более наглядной демонстрации различных сторон методов паразитологического анализа было решено прибегнуть к сравнительному анализу. В таблице рассмотрим критерии, определяющие целесообразность использования того или иного метода паразитологическо-го анализа рыбы.
Сравнительный анализ методов диагностики описторхоза
Критерии Компрессионный метод Метод переваривания мышечной ткани в искусственном желудочном соке Метод ПЦР
Чувствительность 0,3-0,4 % (3-4 лич./г) 0,1 % (1 лич./г) 0,001 % (100 лич./г)
Специфичность Слабая + +
Наличие контроля - - +
Эффективность при наличии личинок:
мертвых Надежен Неэффективен Надежен
живых При слабой инвазии неэффективен Надежен Надежен
Экономичность Не экономичен Экономичен на 30 % и более Экономичен на 30 % и более
Время 30 мин. 4 ч. 6-8 ч.
Количество проб за один анализ 1 От 1 до усредненной пробы из 10 рыб До 96 и более
Перекрестная реакция - - +
По результатам аналитической сравнительной оценки методов исследования рыбы на природно-очаговые гельминтозы получены данные, которые позволяют определить эффективность двух методов: метода переваривания мышц в ИЖС и полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ). Работы отечественных и зарубежных исследователей подтверждают низкую эффективность компрессорного метода при низкой инвазии.
В тоже время мы видим, что из всех методов, представленных в таблице, именно поли-меразная цепная реакция в реальном времени обладает всеми качественными характеристиками, которые необходимы для объективного выявления возбудителей паразитарных инфекций. В частности:
- для диагностики необходимо малое количество продукта;
- обладает высокой чувствительностью и специфичностью;
- не требует специальной и длительной подготовки;
- быстрота исследования;
- способность различать разные типы генетических модификаций.
Разберем отдельно преимущества метода ПЦР:
а) высокая специфичность - основана на образовании между матрицей и праймерами
комплементарных комплексов, которые являются уникальными только для определенного вида возбудителя. Как правило, специфичность метода ПЦР составляет 95-99 %;
б) высокая чувствительность - позволяет выявить наличие гельминтозов при самой малой концентрации ДНК возбудителя, так как чувствительность достигает 0,001 % или 100 копий ДНК ;
в) быстрота анализа - за счет автоматизации процесса «размножения» искомого фрагмента ДНК с последующей детекцией полный анализ можно провести за короткий промежуток времени (в среднем это 6-8 часов);
г) наличие контроля - наличие реакции внутреннего положительного контроля позволяет исключить появление ложноположитель-ного результата;
д) низкий риск контаминации - использование специальных реагентов и приборов позволяет следить за кинетикой накопления продуктов амплификации без прямого участия;
е) регистрация и учет данных в электронном формате - программное обеспечение ам-плификатора позволяет автоматически формировать таблицы и отчеты с интерпретацией результатов.
Также рассмотрим возможности метода по-лимеразной ценой реакции при проведении исследовании рыбы на описторхоз:
а) определение степени экспрессии - с помощью метода ПЦР РВ, который применим для измерения даже малых количеств ДНК ли РНК в пробе, возможно получить количественную информацию о содержании искомого гена, таким образом можно судить об уровне его экспрессии в в отдельной клетке или ткани;
б) определение большого количества проб за один анализ - в настоящее время возможно использование новейших амплификаторов, которые позволяют одновременно проводить анализ в 96 пробах (например, амплификатор серии 1000 компании BIO-RAD);
в) универсальность процедуры различных видов возбудителей - материалом для проведения ПЦР являются фрагменты ДНК или РНК возбудителя, которые имеют сходство химического состава нуклеиновых кислот;
г) снижение субъективности оценки результатов - что практически весь процесс анализа является автоматизированным.
Следует отметить и слабые стороны исследуемого метода:
а) изменчивость генома затрудняет выбор праймеров при получении информации о последовательности нуклеотидов или фрагментов ДНК;
б) относительная дороговизна оборудования - диапазон стоимости оборудования лаборатории ПЦР РВ находится от 1 млн до 5 млн рублей. При этом рекомендуемый объём исследований составляет до 200 проб в день, что, в свою очередь, окупает затраты на оборудование в короткие сроки;
в) может возникать перекрестная реакция при обработке образцов или в процессе приготовления реакционной смеси. Следствие перекрестной контаминации - спорадические лож-ноположительные результаты. При несоблюдении мер безопасности с течением времени в лаборатории могут накапливаться ампликоны, что приводит к появлению тотальной контаминации.
Стоит отметить, что детекцию продуктов амплифиции эффективнее проводить в реальном времени (ПЦР РВ), что исключит процесс контаминации исследуемых образцов.
Важно помнить, что интерпретация результата будет зависеть от выбора типа последовательностей-мишеней, например целевых генов, то есть от выбора тест-систем, содержащих определенные промоторы, терминаторы и целевые гены. Следовательно, выбранный диа-гностикум должен гарантировать охват максимально возможных вариаций возбудителей описторхоза и клонорхоза.
Также необходимо знать, что большую роль в проведении ПЦР-анализа играет такая процедура, как выделение ДНК. Результаты ПЦР-анализа зависят от правильности выбора метода выделения ДНК. Особенно важно учитывать компоненты буферных растворов для предварительной обработки организма, также важно учитывать рН буфера, время и градус инкубации. Всё это и многое другое напрямую зависит от чистоты выделенной ДНК.
Библиографический список
1. Инвазионные заболевания, передающиеся человеку через мясо и рыбу, ветеринарно-санитарная оценка продуктов убоя: учебное пособие / Л. В. Резниченко, С. Н. Водяницкая, С. Б. Носков [и др.]. 2-е изд., стер. Санкт-Петербург: Лань, 2020. 80 с.
2. Латыпов Д. Г. Гельминтозы животных, опасные для человека: учебное пособие. 3-е изд., перераб. Санкт-Петербург: Лань, 2017. 440 с.
3. Current Perspectives on Opisthorchiasis Control and Cholangiocarcinoma Detection in Southeast Asia / Narong Khuntikeo [and others] // Frontiers in Medicine. 2018. DOI: 10.3389/fmed.2018.00117.
4. The World Largest Focus of the Opisthorchiasis in the Ob-Irtysh Basin, Russia, Caused by Opisthorchisfelineus / A. V. Sima-kova [and others] // Open access peer-reviewed chapter ONLINE FIRST. 2020. DOI: 10.5772/intechopen.91634.
© Тесля Е. А, Кузьменко А. С., Якушкин И. В., 2021
