CC BY
41
COAGULOLOGY
© коллектив авторов, 2017 УДК 616.155.2-073.537
Петрищев Н.Н.1, васина Л.в.1, Селютин А.в.2, Чепанов С.в.2, Сельков С.А.2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ FLUO-3 АМ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО КАЛЬЦИЯ В ТРОМБОЦИТАХ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ
1ФГБУ «Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр им. в.А. Алмазова» Минздрава РФ, 197341, Санкт-Петербург;
2ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» СЗО РАМН, 199034, Санкт-Петербург
Целью данного исследования была оценка возможности применения метода тромбининдуцированного увеличения концентрации Ca2+ в цитоплазме Fluo-3-окрашенных тромбоцитов в качестве экспериментальной модели для изучения механизма действия антитромбоцитарных препаратов in vitro. Влияние антитромбоцитарных веществ на тромби-ниндуцированное увеличение уровня цитоплазматического Ca2+ в тромбоцитах изучали на примере ацетилсалициловой кислоты (АСК). Измерение концентрации цитоплазматического Ca2+ проводили методом проточной цитометрии с помощью флуоресцентного зонда Fluo-3 АМ. Установлено, что в данном тесте АСК ингибирует тромбининдуцированное увеличение цитоплазматического Ca2+ при концентрациях 0,125—5,0 мк/моль. Это свидетельствует о том, что в механизме действия АСК угнетение тромбоксанового пути перестает быть ведущим. Предложенный нами методический подход позволяет оценить антитромбоцитарный эффект веществ по их влиянию на уровень цитоплазматического Ca2+ в тромбоцитах in vitro, однако обладает рядом ограничений, препятствующих широкому применению данного метода.
Ключевые слова: тромбоциты; Fluo-3 АМ; тромбин; ацетилсалициловая кислота; цитоплазматический Ca2+.
Для цитирования: Петрищев Н.Н., Васина Л.В., Селютин А.В., Чепанов С.В., Сельков С.А. Использование Fluo-3 AM для измерения уровня цитоплазматического кальция в тромбоцитах методом проточной цитофлуориметрии. Клиническая лабораторная диагностика 2017; 62 (2): 97-99. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-2-97-99 PetrischevN.N.1, VasinaL.V.1, SeliutinA.V.2, ChepanovS.V.2, SelkovS.A.2
THE APPLICATION OF FLUO-3 AM IN MEASUREMENT OF LEVEL OF CYTOPLASMIC CALCIUM IN THROMBOCYTES BY FLOW CYTOFLUOROMETRY
1 The V.A. Almazov Federal medical research center of Minzdrav of Russia, 197341 St. Petersburg, Russia
2 The D.O. Ott research institute of obstetrics, gynecology and reproductology, 199034 St. Petersburg, Russia
The study was carried out to evaluate possibility of applying technique of thrombin-induced increasing of concentration of Ca2+ in cytoplasm of Fluo-3-colored thrombocytes as an experimental model of studying mechanism of action of anti-thrombocytes medications in vitro. The effect of anti-thrombocyte substances on thrombin-induced increasing of the level of cytoplasmic Ca2+ in thrombocytes was analyzed on example of acetylsalicylic acid. The measurement of concentration of cytoplasmic Ca2+ was implemented using flow cytometry technique with fluorescent probe Fluo-3 AM. It is established that in the given test acetylsalicylic acid inhibits thrombin-induced increasing of cytoplasmic Ca2+ at 0.125-5.0 mk/mol concentrations. This occurrence testifies that in the mechanism of effect of acetylsalicylic acid the suppression of thromboxane path ceases to be a leading one. The proposed methodical approach permits evaluating anti-thrombocite effect of substances according their impact to the level of cytoplasmic Ca2+ in thrombocytes in vitro. However, this approach has a number of limitations preventing wide-spread application of the given technique.
Keywords: thrombocyte; Fluo-3 AM; acetylsalicylic acid; cytoplasmic Ca2+.
For citation: Petrischev N.N., Vasina L.V, Seliutin A.V, Chepanov S.V, Selkov S.A. The application ofFluo-3 AM in measurement of level of cytoplasmic calcium in thrombocytes by flow cytofluorometry. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (2): 97-99. (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821m69-2084-2017-62-2-97-99 For correspondence: Vasina L.V, doctor of medical sciences, senior researcher of the laboratory of micro-coagulation. e-mail: lubov.vasina@gmail.com
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Received 20.07.2016 Accepted 01.09.2016
Введение. Внутриклеточная концентрация ионов кальция имеет большое значение в запуске и регуляции многих клеточных функций, таких как сокращение, рост, секреция, синаптическая передача, пролиферация и других. Появление флуоресцентных методов измерения цитозольного кальция повлекло за собой резкое увеличение количества исследований Са2+-зависимых внутриклеточных процессов [1, 2].
Для корреспонденции: Васина Любовь Васильевна, д-р мед. наук, ст. науч.сотр.лаб. микроциркуляции; e-mail: lubov. vasina@gmail.com
Са2+-зонды бывают двух типов: у одних, принадлежащих к семейству Fura, к ионам кальция особенно чувствителен спектр возбуждения, а у других, принадлежащих к семейству Fluo-спектр флуоресценции.
Удобным для метода проточной цитометрии флуоресцентным кальциевым зондом, возбуждаемым видимым светом, является Fluo-3 АМ [3, 4]. Применение данного красителя позволяет измерить уровень цитоплазматического ca2+ индивидуально в каждой живой клетке. Наиболее интересным объектом исследования являются тромбоциты, поскольку повышение уровня свободного цитоплазматического ca2+ является универсальным
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2017; 62(2) DOI 10.18821/0869-2084-2016-62-2-97-99
КОАГУЛОЛОГИЯ
механизмом для всех путей активации (тромбоксанового, по-лифосфоинозитидного и протеин-тирозинкиназного) при действии на тромбоциты различных индукторов агрегации [5].
В настоящее время остается актуальным поиск препаратов, обладающих способностью подавлять агрегацию тромбоцитов и, таким образом, ингибировать тромбообразование. Одним из перспективных направлений в изучении механизма действия соединений с антитромбоцитарной активностью является оценка их влияния на уровень свободного цитоплаз-матического Ca2+. В литературе встречаются немногочисленные экспериментальные исследования, посвященные изучению влияния веществ с антитромбоцитарными свойствами на уровень свободного цитоплазматического кальция в тромбоцитах in vitro [6—8].
Целью данной работы была оценка возможности применения метода тромбининдуцированного увеличения концентрации Са2+ в цитоплазме Fluo-3-окрашенных тромбоцитов в качестве экспериментальной модели для изучения механизма действия антитромбоцитарных препаратов in vitro.
Материал и методы. Оценку влияния антитромбоци-тарных препаратов на тромбининдуцированное увеличение цитоплазматического ca2+ в тромбоцитах проводили на примере ацетилсалициловой кислоты (АСК).
Для приготовления раствора АСК с концентрацией 50 мкмоль/мл использовали 0,05 М раствор трис-HCl, pH 7,4. Растворы с более низкой концентрацией (25, 12,5, 5 и 1,25 мкмоль/мл) готовили путем разведения концентрированного раствора тем же раствором трис-HCl. Хранили раствор с концентрацией 50 мкмоль/мл при 4—8°C не более 24 ч, более разбавленные растворы использовали свежеприготовленными.
Кровь для исследования брали у доноров (n = 7) обоего пола в возрасте 20—35 лет, не получавших в течение 7—10 сут препаратов, влияющих на функцию тромбоцитов. Для предотвращения активации тромбоцитов кровь брали в вакуумные пробирки, содержащие в качестве стабилизатора цитрат натрия (0,129 М). Стабилизированную кровь центрифугировали со скоростью 1000 об/мин (140—160 g) в течение 5—7 мин для получения богатой тромбоцитами плазмы.
В качестве стимулятора выхода интрацеллюлярного кальция из внутриклеточных депо использовали тромбин (Chrono-par Thrombin reagent фирмы «CHRONO-LOG», США). Лиофи-лизированный тромбин растворяли в 1 мл стерильного физиологического раствора до концентрации 10 ед/мл.
Регистрацию изменения концентрации внутриклеточного кальция в тромбоцитах проводили с использованием флуоресцентного зонда Fluo-3 АМ (пентаацетоксимети-ловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксо-9-ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этан-ПП,№,№-тетрауксусной кислоты («Sigma», США). Fluo-3 эффективно возбуждается линией 488 нм аргонового лазера.
Порошкообразный реактив Fluo-3 АМ растворяли в 1 мл диметилсульфоксида (DMSO) до конечной концентрации 10 мМ. Перед экспериментом раствор Fluo-3 AM в DMSO нагревали до комнатной температуры.
Суспензию тромбоцитов (смешивали с 20 мкл богатой тромбоцитами плазмы и с 980 мкл среды Хенкса) нагружали флуоресцентным кальциевым индикатором в процессе инкубации тромбоцитов с 8 мкл Fluo-3 AM в течение 30 мин при
досадочную жидкость отбирали, к тромбоцитарной бляшке добавляли 2 мл среды Хенкса и снова центрифугировали. Затем осадок ресуспендировали в 1 мл среды Хенкса и снова инкубировали в течение 15 мин при 37°С для протекания процесса деэфиризации. После деэфиризации клетки снова однократно отмывали, инкубировали без красителя 10—20 мин и измеряли интенсивность флуоресценции (FL1) Fluo-3-окрашенных тромбоцитов до и после активации тромбином.
Влияние АСК на уровень цитоплазматического кальция в тромбоцитах определяли, смешивая 900 мкл суспензии окрашенных тромбоцитов и 100 мкл раствора АСК (конечная концентрация вещества составляла 0,125, 0,5, 1,25, 2,5 и 5,0 мкмоль/мл). В контроле к суспензии тромбоцитов добавляли 100 мкл 0,05 М раствор трис-HCl, pH 7,4. Смесь инкубировали в течение 2 мин при 37°C, после чего вносили 10 мкл раствора тромбина (конечная концентрация 0,09 ед/мл) и на проточном цитометре определяли интенсивность флуоресценции стимулированных тромбоцитов.
Цитометрический анализ проводили на проточном ци-тофлуориметре FACSCanto II (США). Количество тромбоцитов, содержащихся в образце, определяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica/w 6.0 фирмы «StatSoft, Inc.» (США) с использованием критерия Манна—Уитни. ЕС50 вычисляли с применением программы IBM SPSS Statistics 20 (США) по уравнению зависимости величины эффекта от концентрации.
Результаты и обсуждение. В данном исследовании анти-тромбоцитарные свойства АСК оценивали по ее влиянию на тромбининдуцированное увеличение концентрации CA2+ в цитоплазме тромбоцитов in vitro (см. таблицу).
Установлено, что у доноров интенсивность FL1 Fluo-3-окрашенных тромбоцитов до активации тромбином (отрицательный контроль, K(-)) составила 263,4 ± 18,1 отн. ед., после активации тромбином (положительный контроль, K(+)) — 783,4 ± 42,4 отн. ед. (p < 0,05).
Как видно из представленных данных, АСК оказывала статистически значимое по сравнению с (K+) ингибирующее влияние на тромбининдуцированное увеличение концентрации Ca2+ в цитоплазме тромбоцитов при всех изученных концентрациях. ЕС50 для АСК в данном исследовании составила 1,4 мкмоль/мл.
Главную роль во включении полифосфоинозитидного пути передачи сигнала активации при стимуляции PAR-1 рецепторов тромбином играет фосфолипаза Cp, которая опосредованно через мембранные G-протеины активируется еще при достаточно низком уровне цитоплазматического Ca2+. Фосфолипаза Cp расщепляет мембранный фосфатидилино-зитолдифосфат (PIP2) с образованием активных вторичных мессенджеров: диацилглицерола (DG) и инозитолтрифосфа-та (IP3). В физиологических условиях выброс Ca2+ из сарко-плазматического ретикулума индуцируется IP3 и повышением концентрации в цитозоле самих ионов Ca — так называемым механизмом кальцийиндуцированного высвобождения Ca2+ (CICR — calcium-induced calcium release). Повышение концентрации внутриклеточного Ca2+ под действием тромбина стимулирует активацию фосфолипазы А2 и образование ТхА2 — агониста тромбина. Активацию системы ТХА2 при
37°С.
Далее клетки дважды Влияние АСК на тромбининдуцированное увеличение концентрации кальция в цитоплазме тромбоцитов
отмывали в среде Хенкса: суспензию тромбоцитов разводили средой Хенкса без Са2+ в соотношении 1:1 по объему, после чего центрифугировали 10 мин при 250 об/мин. На-
Параметр Интенсивность FL1 Fluo-3-окрашенных тромбоцитов, отн. ед.
Соединение контроль (K+) Концентрация, мкмоль/мл
0,125 0,5 1,25 2,5 5
АСК 783,4 ± 42,4 713,8 ± 38,4* 651,8 ± 36,1* 583,8 ± 58,7* 439,3 ± 47,6* 313,9 ± 51,9*
Примечание.
статистически значимые различия по отношению к (K+), (p < 0,05).
этом рассматривают как последствие активации фосфолипа-
зы С0. Большое значение имеет способность Т„А_ после вы-р _ Х 2
деления из тромбоцитов при соединении с его рецепторами на плазмолемме стимулировать фосфолипазу С через сопряженный с PAR-1 Gqa-протеин и включать полифосфоинози-тидный путь активации [9, 10].
По данным литературы [11—13], в опытах in vitro аспирин либо не влияет на тромбининдуцированную активацию тромбоцитов, либо оказывает ингибирующий эффект при высоких концентрациях, как это имело место и в нашем исследовании. Это свидетельствует о том, что в механизме действия АСК торможение тромбоксан А2 (ТХА2)-зависимого пути активации тромбоцитов в результате блокады циклооксигеназы-1 (СОХ-1) перестает быть ведущим. Показано, что АСК не может быть использована в некоторых исследованиях in vitro, так как является нестабильным соединением [14]. Возможно, в нашем эксперименте слабый ингибирующий эффект АСК обусловлен влиянием ее активного метаболита, подавляющего активность АСК in vitro. Эта гипотеза основана на данных, свидетельствующих о способности салициловой кислоты ингибировать антиагрегантные свойства АСК [15, 16].
Последние исследования показывают, что аспирин может ацилировать не только СОХ-1, но и другие белки [17]. Этими реакциями ацилирования можно объяснить многие из необъяснимых до настоящего времени эффектов аспирина.
В большинстве работ, посвященных изучению содержания цитоплазматического Са2+ в тромбоцитах, исследователи использовали ратиометрический зонд Fura-2, возбуждаемый ультрафиолетовым светом, определяя соотношение величин флуоресцентных сигналов, зарегистрированных с помощью спектрофлуориметра, для двух длин волн — 340 и 380 нм, длина волны излучения при этом составляет 510 нм. Данная методика позволяет получать результаты, которые не зависят от оптических свойств регистрирующей системы и интенсивности флуоресцентного сигнала исследуемого объекта [18—21]. При нератиометрических измерениях Са2+ (в частности, при использовании зонда Fluo-3 AM) интенсивность флуоресценции зависит от концентрации индикатора в клетке, и эта зависимость носит нелинейный характер. Высокотехнологичный метод проточной цитометрии позволяет оценить антитромбоцитарный эффект веществ по их влиянию на уровень свободного цитоплазматического кальция в тромбоцитах in vitro, однако является дорогостоящим и трудозатрат-ным методом. Очевидно, что предпочтение следует отдавать ратиометрическому измерению уровня цитоплазматического Са2+ с использованием спектрофлуориметра, так как данный метод обладает большей пропускной способностью и позволяет снизить трудозатраты и стоимость исследования.
Заключение. Таким образом, в механизме эффекта АСК в тесте тромбининдуцированного увеличения концентрации Са2+ в цитоплазме Fluo-3-окрашенных тромбоцитов угнетение тром-боксанового пути перестает быть ведущим, однако выяснить дополнительные механизмы действия АСК в рамках данного исследования не представляется возможным. Сложности обсуждаемого методического подхода требуют дальнейшего изучения и анализа методов, позволяющих проводить исследования по влиянию соединений с антитромбоцитарной активностью на уровень внутриклеточного кальция в тромбоцитах in vitro.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENСES
1. Paredes R.M., Etzler J.C, Watts L.T., Zheng W., Lechleiter J.D.
^emical calcium indicators. Methods. 2008; 46(3): 143—51.
COAGULOLOGY
2. Nesbitt W.S., Harper I.S., Schoenwaelder S.M., Yuan Y, Jackson S.P. A live cell micro-imaging technique to examine platelet calcium signaling dynamics under blood flow. Methods Mol. Biol. 2012; 788: 73—89.
3. Merritt J.E., McCarthy S.A., Davies M.P., Moores K.E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Biochem. J. 1990; 269(2): 513—9.
4. Do Ceu Monteiro M., Sansonetty F., Gonjalves M.J., O'Connor J.E. Flow cytometric kinetic assay of calcium mobilization in whole blood platelets using Fluo-3 and CD41. Cytometry. 1999; 35(4): 302—10.
5. Wave J.A., Smith M., Salzman E.W. Synergism of platelet-aggregating agents. Role of elevation of cytoplasmic calcium. J. Clin. Invest. 1987; 80(1): 267—71.
6. Shen Z.Q., Chen Z.H., Ma G.Y., Wang D.C., Wu W.L., Liu W.P. et al. Inhibitory effects of copper-aspirin complex on platelet aggregation. Acta Pharmacol. Sin. 1997; 18(4): 358—62.
7. Shen Z.Q., Li L., Wu L.O., Chen Z.H., Liu W.P. Effects of copper-aspirin complex on plasma prostaglandin F1a level and platelet cytosolic calcium in rabbits. Platelets. 1999; 10(5): 345—8.
8. Hecker M., Brüne В., Decker K., Ullrich V. The sulfhydryl reagent thimerosal elicits human platelet aggregation by mobilization of intracellular calcium and secondary prostaglandin endoperoxide formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989; 159(3): 961—8.
9. Holinstat M., Voss В., Bilodeau M.L., McLaughlin J.N., Cleator J., Hamm H.E. PAR4, but not PAR1, signals human platelet aggregation via Ca2+ mobilization and synergistic P2Y12 receptor activation. J. Biol. Chem. 2006; 281(36): 26665—74.
10. Holinstat M., Voss В., Bilodeau M.L., Hamm H.E. Protease-activated receptors differentially regulate human platelet activation through a phosphatidic acid-dependent pathway. Mol. Pharmacol. 2007; 71(3): 686—94.
11. Wallace J.L., McKnight W., Del Soldato P., Baydoun A.R., Cirino G. Anti-thrombotic effects of a nitric oxide — releasing, gastric-sparing aspirin derivative. J. Clin. Invest. 1995; 96(6): 2711—8.
12. McKenzie M.E., Malinin A.I., Bell C.R., Dzhanashvili A., Horowitz E.D., Oshrine B.R. et al. Aspirin inhibits surface glycoprotein IIb/ IIIa, P-selection, CD63, and CD107a receptor expression on human platelets. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2003; 14(3): 249—53.
13. Shen Z.Q., Chen P., Li L., Chen P., Liu W.P. Effects of copper-aspirin complex on platelet — neutrophil interaction. Acta Pharmacol. Sin. 2004; 25(5): 576—80.
14. Warner T.D., Giuliano F., Voinovic I., Bukasa A., Mitchell J.A., Vane J.R. Nonsteroid drug selectivities for cyclo — oxygenase — 1 rather than cyclo — oxygenase — 2 are associated with human gastrointestinal toxicity: A full in vitro analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(16): 7563—8.
15. Nitelius E., Brantmark B., Fredholm B., Hedner U., Plym Forshell G., Wahlin — Boll E. et al. Actions and interactions of acetylsalicylic acid, salicylic acid and diflunisal on platelet aggregation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1984; 27(2): 165—8.
16. Brown N., May J.A., Wilcox R.G., Allan L.M., Wilson A.M., Kiff P.S. et al. Comparison of antiplatelet activity of microencapsulated aspirin 162.5 mg (Caspac XL), with enteric coated aspirin 75 mg and 150 mg in patients with atherosclerosis. Br. J. Clin. Pharmacol. 1999; 48(1): 57—62.
17. Alfonso L.F., Srivenugopal K.S., Bhat G.J. Does aspirin acetylate multiple cellular proteins? (Review). Mol. Med. Rep. 2009; 2(4): 533—7.
18. Rink T.J., Sage S.O. Stimulated calcium efflux from fura — 2-loaded human platelets. J. Physiol. 1987; 393: 513—24.
19. Park J.Y., Oh W.J., Kwak D.M., Kim M.G., Seo G.S., Hong S.B. et al. The anti-platelet activity of Hypsizygus marmoreus extract is involved in the suppression of intracellular calcium mobilization and integrin aIIbß3 activation. J. Med Plant. Res. 2011; 5(11): 2369—77.
20. Oh W.J., Endale M., Park J.Y., Kwak Y.S., Kim S., Kim G.S. et al. The inhibitory effect of Opuntia humifusa Raf. ethyl acetate extract on platelet aggregation. J. Med. Plant. Res. 2011; 5(8): 1418—24.
21. Redondo P.C., Salido G.M., Pariente J.A., Rosado J.A. Dual effect of hydrogen peroxide on store-mediated calcium entry in human platelets. Biochem. Pharmacol. 2004; 67(6): 1065—76.
Поступила 20.07.16 Принята к печати 01.09.16
