CC BY
71
УДК 616.41
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ ДЛЯ ГЕНЕРАЦИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ ГЕМОБЛАСТОЗАМИ
Екатерина Яковлевна ШЕВЕЛА1, Егор Васильевич БАТОРОВ1, Дарья Сергеевна БАТОРОВА1, Марина Александровна ТИХОНОВА1, Ирина Валентиновна КРЮЧКОВА1, Александр Анатольевич ОСТАНИН1, Елена Рэмовна ЧЕРНЫХ1
1 ФГБУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14
2 ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России
630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52
В работе исследовано влияние основного фактора роста фибробластов (FGF-b) на пролиферативную активность костно-мозговых мезенхимальных стромальных клеток (МСК) больных гемобластозами (п = 16). Показано, что у больных лимфомами и острыми лейкозами генерация МСК в присутствии FGF-b сопровождается сокращением сроков культивирования, увеличением выхода клеток и возрастанием числа цикли-рующих МСК. В то же время МСК больных апластической анемией отличаются низкой чувствительностью к стимулирующему действию FGF-b. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования FGF-b с целью оптимизации протоколов трансплантационного лечения гематологических больных.
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, ростовые факторы, пролиферация, гемобластозы.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермаль-ного происхождения, обладают выраженной им-мунорегуляторной активностью, а также играют важную роль в обеспечении функционирования гемопоэтических ниш в костном мозге. Гемопо-эзстимулирующая активность МСК была продемонстрирована в моделях приживления клеток при трансплантации костного мозга, а также в от дельных клинических испытаниях [6, 11, 13,
15]. Поэтому в настоящее время предлагается проводить совместную трансплантацию стволовых кроветворных и мезенхимальных стромаль-ных клеток с целью ускорения восстановления кроветворения у больных гемобластозами после высокодозной химиотерапии [6, 13].
В клинической практике наиболее безопасным считается использование аутологичного клеточного материала, однако свойства МСК при патологии могут быть изменены. Так, нами и другими авторами было показано, что в костном мозге больных гемобластозами регистрируется снижение числа клоногенных предшест-
Шевела Е.Я. - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии, e-mail: shevelak@mail.ru
Баторов Е.В. - аспирант лаборатории клеточной иммунотерапии, e-mail: ebatorov@mail.ru Баторова Д.С. - врач-гематолог отделения гематологии и трансплантации костного мозга, e-mail: bmt-novosibirsk@mail.ru
Тихонова М.А. - к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии, e-mail: martix-59@mail.ru
Крючкова И.В. - к.м.н., зав. отделением гематологии и трансплантации костного мозга, e-mail: bmt-novosibirsk@mail.ru
Останин А.А. - д.м.н., проф., главный научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии, e-mail: ct_lab@mail.ru
Черных Е.Р. - д.м.н., проф., член-кор. РАМН, e-mail: ct_lab@mail.ru
венников (фибробластных колониеобразующих единиц, КОЕ-Ф) и скорости роста МСК, а также количества «дочерних» клеток, генерируемых одной КОЕ-Ф [2, 3, 10, 14]. В то же время для достижения клинического эффекта необходимы большие количества МСК (1-2 млн/кг массы тела больного), что может быть достигнуто в результате длительного культивирования МСК in vitro. Однако многократное пассирование МСК чревато изменением их биологических свойств, что связывают с накоплением генетических нарушений [7]. В этой связи наиболее предпочтительным (с точки зрения клинического использования МСК) способом получения достаточных количеств МСК представляется их культивирование в присутствии медиаторов, стимулирующих пролиферативную активность этих клеток. Показано, что подобным действием обладает ряд факторов - фактор роста, полученный из тромбоцитов (PDGF), эпидермаль-ный фактор роста (EGF), основной фактор роста фибробластов (FGF-b), трансформирующий рост фактор в (TGF-в), а также инсулинопо-добный фактор роста 1 (IGF-1) [4, 8, 9, 12, 16]. Учитывая вышесказанное, целью настоящего исследования явилось изучение влияния FGF-b на пролиферативную активность костно-мозго-вых МСК больных гемобластозами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование были включены 7 доноров и 16 пациентов с гемобластозами (в возрасте от 20 до 33 лет), включая 8 больных лимфомами, 2 - острым лимфобластным лейкозом, 6 - ап-ластической анемией. МСК выделяли из аспирата костного мозга при наличии письменного информированного согласия. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли путем центрифугирования клеток аспирата в градиенте плотности фиколла-верографина (1,078 г/л) и инкубировали в культуральных флаконах (75 см2, «Nun-clon», Дания) в количестве (50-100) х 106 клеток/флакон при 37 оС в СО2-инкубаторе Через 72 ч неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а адгезивную фракцию культивировали до получения конфлюэнтного слоя в питательной среде a-MEM («БиолоТ», Санкт-Петербург), дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 20 % сыворотки крови плодов коровы («БиолоТ»), в присутствии либо в отсутствие основного фактора роста фибробластов (FGF-b, в дозе 10 нг/мл). Пассирование МСК осуществляли с использованием раствора 0,25 % трипсина/0,02 % ЭДТА. Количество прекурсоров МСК определяли по числу КОЕ-Ф при культивировании мо-
нонуклеарных клеток (1 х 106) в чашках Петри в течение 14 сут, с последующим окрашиванием колоний по Романовскому-Гимзе.
Клеточный цикл МСК СБ73+ оценивали методом проточной цитометрии. Для этого 25 мкл МСК (1,0 х 106) инкубировали в течение 45 мин при 4 °С в темноте с 5 мкл FГГС-коньюгиро-ванных анти-СБ73 антител (Сорбент, Москва). После однократной отмывки забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,02 % ЭДТА и 1 % азида натрия (раствор «А»), клетки фиксировали в течение 30 мин холодным 0,5 % раствором парафармальдегида, центрифугировали и ресуспендировали в 0,5 мл раствора А, содержащего РНКазу в концентрации 20 мкг/мл, после чего инкубировали в темноте в течение 30 мин при 37 °С. Затем клетки обрабатывали 7-аминоактиномицином Б (7-ААБ, Са1ЫосИет, Германия) в конечной концентрации 2 мкг/мл в темноте в течение 30 мин при 4 °С.
Анализ клеточного цикла проводили по оценке гистограмм ДНК (красная флуоресценция). Относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в фазах клеточного цикла G0/G1) и гипердиплоидным (клетки в фазах клеточного цикла Б, G2/M) набором ДНК определяли в гейте СБ73+ (зеленая флуоресценция). Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик. Результаты выражались в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству СБ73 (не менее 10000).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование клоногенной эффективности МСК показало, что FGF-b не влиял на адге-зивность прекурсоров МСК и количество кло-ногенных предшественников (КОЕ-Ф) в культурах мононуклеарных клеток, выделенных из костного мозга доноров (п = 3) и больных гемобластозами (п = 3). Так, число КОЕ-Ф при 14-дневном культивировании в стандартных условиях составляло в среднем 24,3 ± 6,9 и не изменялось при добавлении в питательную среду FGF-b - 24,0 ± 7,2 (р > 0,05). В то же время колонии фибробластоподобных клеток в присутствии FGF-b отличались большей клеточностью и, следовательно, большими размерами, что, как известно, свидетельствует о более высокой пролиферативной активности клоногенных предшественников [1]. При этом увеличение размеров КОЕ-Ф было в одинаковой степени характерно для культур костно-мозговых моно-нуклеарных клеток доноров и больных.
Таблица
Сравнительная характеристика первичных культур МСК в зависимости от присутствия в культуральной среде основного фактора роста фибробластов
Группа БОЕ-ЬИ FGF-b(+) Р
Длительность первичного культивирования до 80-90 % субслияния
Доноры (п = 7) 14,6 ± 0,64 13,1 ± 0,33 0,57
Больные гемобластозами (п = 16) 25,4 ± 1,52 18,6 ± 1,21 0,041
Выход клеток (х 104)*
Доноры (п = 7) 3,99 ± 0,37 6,95 ± 0,76 0,023
Больные гемобластозами (п = 16) 3,0 ± 0,32 5,2 ± 0,79 0,009
Лимфома (п = 8) 3,2 ± 0,45 5,5 ± 0,95 0,023
Острый лейкоз (п = 2) 1,2 ± 0,51 9,1 ± 3,7
Апластическая анемия (п = 6) 3,3 ± 0,41 3,8 ± 0,39 0,68
Примечание: * - выход МСК/106 мононуклеарных клеток; р - достоверность различий с группой FGF-b(-) (по критерию Вилкоксона для связанных пар).
Анализ особенностей генерации МСК показал (таблица), что использование БОБ-Ь в процессе культивирования МСК доноров приводило к незначительному снижению длительности первичного культивирования клеток (до первого пассирования на момент достижения 80-90 % субслияния). В то же время в культурах МСК больных гемобластозами, исходно отличавшихся замедленным ростом, добавление БОБ-Ь приводило к статистически значимому укорочению сроков генерации МСК в первичных культурах в среднем с 25,4 до 18,6 сут (р = 0,041).
Анализ количества МСК, полученных при первом пассировании, показал, что в присутствии БОБ-Ь наблюдалось выраженное увеличение выхода МСК, что свидетельствовало о более эффективной пролиферации клеток (см. таблицу). При этом в культурах БОГ-стимулиро-ванных МСК доноров выход клеток повышался в среднем на 74 % (р = 0,023). Увеличение численности популяции МСК в целом по группе больных гемобластозами (п = 16) было таким же значительным (на 73 %) и статистически достоверным (р = 0,009). Однако анализ исследуемых параметров в различных подгруппах больных
показал, что БОБ-опосредованное возрастание выхода МСК наблюдалось преимущественно в культурах МСК больных лимфомами (п = 8) и острыми лейкозами (п = 2). В то же время при апластической анемии выход клеток практически не изменялся. Полученные данные свидетельствуют о различной чувствительности МСК к стимулирующему действию БОБ-Ь при различных онкогематологических заболеваниях.
Дополнительным подтверждением усиления пролиферативного потенциала МСК под влиянием БОБ-Ь послужили результаты исследования параметров клеточного цикла (рисунок). Действительно, из данных рисунка видно, что стимулирующее действие БОБ-Ь проявляется в выраженной тенденции к снижению относительного количества покоящихся (в фазе клеточного цикла О0/О1; с 73,1 ± 8,84 до 59,6 ± 4,35 %) МСК и в трехкратном увеличении доли цикли-рующих клеток (в фазе Б + О2/М; с 3,45 ± 1,19 до 10,01 ± 2,91; р = 0,043).
Полученные нами данные о влиянии БОБ-Ь на пролиферативную активность МСК подтверждают возможность использования данного ростового фактора для оптимизации протоколов
100-1
80-
а
У и 60-
40-
20-
0
т вО/О!
201612840
2 ' 3
8-Ю2/М
□ роб-ЬН I РОР-Ъ(+)
Рис. Распределение СБ73+МСК по фазам клеточного цикла. Представлены индивидуальные значения относительного количества клеток в различных фазах клеточного цикла, полученные в четырех экспериментах: 1 и 2 — МСК доноров; 3 и 4 — МСК больных лимфомами
генерации МСК и получения их в количествах, необходимых для клинических целей. Действительно, низкая частота МСК в костном мозге и быстрая потеря прогениторных свойств во время экспансии in vitro составляют одно из главных ограничений при проведении МСК-ориентиро-ванной клеточной терапии [5]. Использование ростовых факторов и, в частности, FGF-b позволяет протектировать прогениторные свойства МСК и через усиление их пролиферативной активности достоверно повысить эффективность генерации МСК в культуре in vitro. Считается, что FGF-b оказывает стимулирующий эффект на ранние прекурсоры МСК, избирательно повышая их выживаемость и функциональную активность. Так, например, показано, что при добавлении FGF-b продолжительность жизни МСК увеличивается до 70 удвоений популяции по сравнению с 50 в культурах без фактора [8].
Принципиально новыми и, безусловно, заслуживающими внимания можно считать полученные нами данные о корригирующем влиянии FGF-b на пролиферативный потенциал МСК, выделенных из костного мозга больных гемо-бластозами: впервые показано, что генерация МСК больных лимфомами и острыми лейкозами в присутствии FGF-b сопровождается сокращением сроков первичного культивирования, увеличением выхода клеток, а также возрастанием числа циклирующих МСК. В совокупности эти результаты свидетельствуют о способности FGF-b корригировать исходно сниженную про-лиферативную активность МСК при некоторых онкогематологических заболеваниях. Логично предположить, что в данном случае МСК экс-прессируют функционально активные рецепторы к FGF-b. В то же время очень незначительный стимулирующий эффект FGF-b, выявляемый в культурах МСК больных апластической анемией, указывает на гетерогенность МСК и свидетельствует о различной чувствительности МСК к корригирующему действию FGF-b при разных заболеваниях.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Суммируя полученные данные, можно заключить, что 1) генерация МСК больных лим-фомами и острыми лейкозами в присутствии FGF-b позволяет сократить сроки культивирования и сопровождается увеличением выхода клеток, а также возрастанием числа МСК в фазе клеточного цикла S + G2/M; 2) МСК больных апластической анемией отличаются низкой чувствительностью к стимулирующему действию FGF-b. Полученные данные свиде-
тельствуют о целесообразности использования FGF-b с целью оптимизации протоколов МСК-опосредованной терапии в лечении некоторых гемобластозов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Герасимова Л.П., Дризе Н.И., Лубкова О.Н. и др. Нарушение стромального микроокружения у больных с различными заболеваниями системы крови // Гематол. трансфузиол. 2008. 53. (5). 59-62.
2. Шевела Е.Я., Петровский Я.Л., Курганова Е.В. и др. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных гемобластозами // Гематол. трансфузиол. 2008. (2). 32-38.
3. Bacigalupo A., Valle M., Ройг$1а M. et al. T-cell suppression mediated by mesenchymal stem cells is deficient in patients with severe aplastic anemia // Exp. Hematol. 2005. 33. (7). 819-827.
4. Baddoo D., Hill K., Wilkinson R. et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from bone-marrow by negative selection // J. Cell Bio-chem. 2003. 89. 1235-1249.
5. Banfi A., Muraglia A., Dozin B. et al. Proliferation kinetics and differentiation potential of ex vivo expanded human bone marrow stromal cells: Implications for their use in cell therapy // Exp. Hematol. 2000. (28). 707-715.
6. Battiwalla M., Hematti P. Mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation // Cy-totherapy. 2009. 11. (5). 503-515.
7. Bernardo M.E., Cometa A.M., Pagliara D. et al. Ex vivo expansion of mesenchymal stromal cells // Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2011. 24. (1). 73-81.
8. Bianchi G., Banfi A., Mastrogiacomo M. et al. Ex vivo enrichment of mesenchymal stem cell progenitors by fibroblast growth factor 2 // Exp. Cell Res. 2003. 287. 98-105.
9. Di Maggio N. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Niches and Regenerative Medicine: abstract of thesis doctor of philosophy. Basel, 2010.
10. Fouillard L., Bensidhoum M., Bories D. et al. Engraftment of allogeneic mesenchymal stem cells in the bone marrow of a patient with severe idiopathic aplastic anemia improves stroma // Leukemia. 2003. 17. 474-476.
11. Koc O.N., Gerson S.L., Cooper B.W. et al. Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy // J. Clin. Oncol. 2000. 18. 307-316.
12. Kuznetsov S.A., Friedenstein A.J., Robey P.G. Factors required for bone marrow fibroblast colony
formation in vitro // Br. J. Haematol. 1997. 97. 561570.
13. Le Blanc K., Samuelsson H., Gustafsson B. et al. Transplantation of mesenchymal stem cells to enhance engraftment of hematopoietic stem cells // Leukemia. 2007. 21. (8). 1733-1738.
14. Li B., Fu J., Chen P., Zhuang W. Impairment in immunomodulatory function of mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients // Arch. Med. Res. 2010. 41. (8). 623-633.
15. Sergeevicheva V.V., Shevela E.Y., Siziko-va S.A. et al. Autologous mesenchymal stromal cells of hemoblastoses patients efficiently support hematopoietic recovery stem cell transplantation // Cell Ther. Transplant. 2010. 1. (4). 98-105.
16. Wang Q.R., Yan Z.J., Wolf N.S. Dissecting the hematopoietic microenvironment VI. The effects of several growth factors on the growth of murine bone marrow CFU-F // Exp. Hematol. 1990. 18. 341-347.
THE USE OF FIBROBLAST GROWTH FACTOR FOR MESENCHYMAL STROMAL CELL GENERATION IN HEMATOLOGICAL MALIGNANCIES
Ekaterina Yakovlevna SHEVELA1, Egor Vasil'yevich BATOROV1, Dar'ya Sergeevna BATOROVA1, Marina Aleksandrovna TIKHONOVA1, Irina Valentinovna KRYUCHKOVA1, Aleksandr Anatol'yevich OSTANIN1, Elena Removna CHERNYKH1
1 Research Institute of Clinical Immunology SB RAMS 630099, Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., 14
2 Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasnyi av., 52
The impact of basic fibroblast growth factor (FGF-b) on the proliferative activity of mesenchymal stromal cells (MSCs) generated from bone marrow of patients with hematological malignancies (n = 16) was investigated. It has been shown that in patients with acute leukemia and lymphoma MSC generation in the presence of FGF-b accompanied by a decrease of cultivation until confluence, increase in cell yield and the number of cycling MSCs. At the same time, the MSCs of patients with aplastic anemia are characterized by low sensitivity to the FGF-b stimulatory effects. These data indicate the feasibility of FGF-b using to optimize MSC-based protocols in the treatment of some hematological malignancies.
Key words: mesenchymal stromal cells, growth factors, proliferation, hematological malignancies.
Shevela E.Ya. - candidate of medical sciences, senior researcher of laboratory of cell immunotherapy, e-mail: shevelak@mail.ru
Batorov E.V. - postgraduate student of laboratory of cell immunotherapy, e-mail: ebatorov@mail.ru Batorova D.S. - hematologist of department of hematology and bone marrow transplantation, e-mail: bmt-novosibirsk@mail.ru
Tikhonova M.A. - candidate of biological sciences, leading researcher of laboratory of cell immunotherapy, e-mail: martix-59@mail.ru
Kryuchkova I.V. - candidate of medical sciences, head of the department of hematology and bone marrow transplantation, e-mail: bmt-novosibirsk@mail.ru
Ostanin A.A. - doctor of medical sciences, professor, chief researcher of laboratory of cell immunotherapy, e-mail: ct_lab@mail.ru
Chernykh E.R. - corresponding member of RAMS, doctor of medical sciences, professor, e-mail: ct_lab@mail.ru
