CC BY
62
УДК 634.23:631.53
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В РАБОТЕ С КОСТОЧКОВЫМИ КУЛЬТУРАМИ
Т. В. ПЛАКСИНА, старший научный сотрудник НИИ садоводства Сибири имени М. А. Лисавенко E-mail: niilisavenko@hotbox.ru
Резюме. Показана возможность применения методов биотехнологии как для получения новых форм на новой генетической основе, так и для скорейшего размножения сортов и ценных гибридных форм. Ключевые слова: эксплант, культура тканей, питательная среда, регуляторы роста, регенерация.
Вишня — одна из наиболее распространенных косточковых культур в садах на юге Западной Сибири, в том числе на Алтае. Ее саженцы очень востребованы в этом регионе. Однако в последние годы урожайность и площади насаждений вишни в промышленном садоводстве Алтайского края, значительно сократились. Так, в 1996 г. этой культурой было занято более 1200 га [1], а в 2006 г. по данным Главного управления сельского хозяйства Алтайского края — лишь 107 га. Одна из основных причин сложившейся ситуации связана с тем, что генофонд сортов вишни распространенных на Алтае значительно отличается от европейского. В их создании участвовали вишня степная (Cerasus fruticosa Pall.) и вишня обыкновенная (Cerasus vulgaris Mill.). В результате удалось получить сорта, отвечающие главным требованиям для выращивания в сибирском климате (низкорослость, зимостойкость, урожайность, вкус и величина плодов), но с низкой устойчивостью к коккомикозу [4], который в последние годы широко распространился в регионе.
Поэтому сегодня актуально создание новых форм путем скрещивания вишни степной (основной культурный вид вишни в Сибири), с устойчивыми к коккомикозу дикорастущими дальневосточными и американскими видами. Среди доступных источников устойчивости к коккомикозу, кроме широко известной вишни Маака, можно назвать вишню Максимовича, курильскую, сахалинскую, пенсильванскую, остропильчатую [2]. По мнению А.А. Юшева [3], в ближайшем будущем основную роль в создании сортов для регионов с суровыми климатическими условиями будут играть микровишни (песчаная и войлочная). Желательно также получение гибридов при скрещивании вишни с черемухой обыкновенной (источник высокой зимостойкости и устойчивости к коккомикозу). Таким образом, на сегодняшний день основная задача селекции — создание и размножение устойчивых к коккомикозу тетра- и гексаплоид-ной гибридной сибирской вишни, гибридов церапа-дусов (вишня степная х вишня Маака) и гибридов микровишни для формирования принципиально нового сортимента.
В современных условиях дальнейшее развитие науки в области селекционно-генетических исследований тесно связано с внедрением в практику биотехнологических методов.
Для косточковых культур, в частности вишни, применяют такие методы биотехнологии как культура зародышей in vitro для получения уникальных форм отдаленных гибридов и культура апикальной меристемы для быстрого размножения [5].
В научно-исследовательском институте садоводства Сибири им. Лисавенко (НИИСС) использование биотехнологических методов в селекции вишни началось в 1996 г.
Цель наших исследований — усовершенствование технологии ускоренного размножения устойчивых к коккомикозу алтайских генотипов вишни и микровишни in vitro.
Задачи исследований заключались в изучении: влияния сроков изоляции и регуляторов роста на рост и развитие гибридных зародышей вишни и микровишни in vitro',
действия экзогенных регуляторов роста на процессы регенерации в культуре изолированных тканей семядолей;
влияния регуляторов роста на регенерационные процессы на стадиях собственно размножения и окоренения;
морфологических и цитологических признаков сортов, полученных путем микроразмножения;
целесообразности использования растений вишни, выращенных in vitro, при зеленом черенковании.
Материалы и методы. В основу методики были положены общепринятые приемы работы с культурами изолированных тканей и органов растений [6,7].
В качестве основных применяли агаризованные питательные среды (0,7 % агар) по прописям Мура-сига-Скуга и Гамборга. В их состав вводили экзогенные регуляторы роста — бензиламинопурин (БАП), нафтилуксусная ксилота (НУК), индолилмасляная кислота (ИМК), гиббереловая кислота (ГК). До ав-токлавирования pH среды доводили до 5,8...5,9. Автоклавировали питательные среды в течение 20 мин. при 1+0,1 атм.
Зеленое черенкование проводили согласно технологии выращивания посадочного материала вишни, разработанной в НИИСС имени М.А. Лисавенко [8].
Прямой подсчет числа хромосом осуществляли по методике ЦГЛ им. И.В. Мичурина [9]. Фертильность пыльцы определяли по [10].
Результаты. Успех эмбриокультуры in vitro зависит от срока изоляции зародыша и применяемой питательной среды. В наших экспериментах была использована питательная среда Мурасиге-Скуга
(МС), дополненная БАЛ в количестве 1 и 2 мкМ, а также БАЛ (2 мкМ) в сочетании с ГК (5 мкМ).
В ходе исследований было установлено, что на безгормональной питательной среде 30-дневные зародыши не прорастают и погибают. Добавление регуляторов роста способствовало их нормальному развитию. Доля проросших зародышей зависела от генотипа и концентрации регуляторов роста. При использовании БАП в количестве 1 мкМ она составляла 12,5...40 %, 2 мкМ - 33,3...80 %.
Доля проросших 45-дневных зародышей всех комбинаций скрещивания на различных по составам питательных средах варьировала от 33,3 до 100 %. В некоторых комбинациях на среде с добавлением 2 мкМ БАП у зародышей наблюдалось образование дополнительных побегов (1...5 шт.) из-за развития пазушных почек.
Больше всего нормально развившихся 60-дневных зародышей (75... 100 %) было получено на питательной среде с 2 мкМ БАП и 5 мкМ ГК.
Еще одним типом экспланта при микроразмножении служили изолированные ткани семядолей. У многих видов растений они обладают высоким морфогенетическим потенциалом.
В качестве контроля использовали питательную среду без регуляторов роста. В таких условиях отмечалось незначительное увеличение размеров изолированных тканей семядолей, которые к концу пассажа темнели и погибали (100 %). Регенерация почек происходила при использовании БАП и НУК в концентрации соответственно 2... 10 мкМ и 0,5...2 мкМ.
Коэффициент размножения на этапе собственно размножения оценивается по количеству образовавшихся почек.
БАП. При добавлении с 8... 10 мкМ БАП отмечена гипергидротация тканей.
Окоренение побегов церападусов проводили на питательных средах Мурасиге-Скуга и Гамборга, разбавленных вдвое по минеральному составу и дополненных 3...10 мкМ ИМК. Минеральный состав питательных сред не влиял на количество образующихся корней, но общая их длина при использовании среды Мурасиге-Скуга была в 2-15 раз больше. При добавлении 5 мкМ ИМК окоренялось 80... 100 % побегов, увеличение концентрации регулятора роста до 10 мкМ у большинства форм приводило к сильному разрастанию каллуса на базальной части побега.
Побеги гибридов микровишни легко окоренялись без регуляторов роста (87 %). Для окоренения других гибридов требовалось обязательное добавление в питательную среду стимуляторов ризогенеза. Наиболее результативным оказалось использование 2 мкМ ИМК. В этом случае окоренялось 50...70 % всех изученных гибридов вишни. Для сорта Кристина оптимальной концентрацией ИМК было 4 мкМ, для сорта Селиверстовская — 1 мкМ.
Этап адаптации растений-регенерантов к выращиванию in vivo — завершающий и ключевой в микроразмножении. Мы изучили 3 варианта условий этого процесса (на субстратах из речного песка и керамзита, а также на гидропонной установке «Минивит».
Наилучший результат был получен на гидропонной установке «Минивит». В среднем при ее использовании через 4 недели д лина побегов достигала 130 мм, что в 5 раз больше, чем до начала адаптации (табл. 1). Число корней, по сравнению с исходным, во всех вариантах увеличивалось в 1,4... 1,6 раза.
Таблица 1. Характеристика растений — регенерантов вишни и микровишни на разных субстратах до и после адаптации
Вариант Число корней, шт., х ±tsx Средняя длина корня, мм, x±tSx Средняя высота побега, мм х ± tSx
до после до после до после
Песок, п=42 2.9+0.7 5,1 ±0,7 23,7±3,1 96,2+8,5 19,8+1,1 76,9+6,2
Керамзит, п=25 2,9±0,4 4,5+0,5 25,4±4,7 65,3±10,5 27,8±2,7 52,9±4,2
Гидропоника без
субстрата, п=65 2,9±0,3 4,6±0,5 24,6±4,3 94,2±10,6 25,8±1,7 130,4±10,1
Наибольшее число пазушных почек развилось на среде с 5 мкМ БАП у гибридов 3-66-9(6х) х вишня пенсильванская, 3-66-9(6х) х вишня Максимовича и сорта Кристина из почек, изолированных с нижней части побега, а у потомства от скрещивания 3-66-9(6х) х черемуха обыкновенная — из почек со средней части побега. У гибридов микровишни и у сорта Селиверстовская больше всего пазушных почек и побегов развилось на среде с добавлением БАП соответственно 1 и 2 мкМ независимо от расположения почек на побеге.
При размножении церападусов для большинства изученных генотипов лучшие показатели отмечены при использовании питательной среды с 4...6 мкМ
При микроразмножении часто возникает вопрос о сохранении генетической и фенотипической стабильности получаемых растений. Согласно результатам наших исследований вишня, размноженная с помощью изолированных апикальных меристем, полностью сохранила форму плодов и листьев, окраску, число хромосом (4х=32), присущие материнскому растению. Отмечено небольшое повышение средней массы ягод. Величина показателей качества пыльцы (фертильность и жизнеспособность) у сорта Селиверстовская не отличалась от контроля, а у сорта Кристина — была выше в 2 раза. Сравнительная оценка способности этих сортов к размножению зелеными черенками свидетельствует о возможнос-
Таблица 2. Характеристики окоренения зеленых черенков сортов вишни (2005-2006 гг.)
Сорт Способ размножения маточных растений Год Окоренение, % Число растений в опыте, uim. Число корней, шт. Общая длина корней, см Критерий Стью- дента
Кристина традиционный 2005 54±9,1 30 7,0±1,6 33,8±8,5 Іф<І0,05
in vitro 60+8,9 30 8,6±1,8 36,5±1,6
традиционный 2006 65±6,8 50 6,2+0,8 61,7+5,3 ІфСЇо.ОБ
in vitro 75±7,9 30 10,3±0,9 84,2±9
Селивер- традиционный 2005 10+2,5 150 2,8±0,3 18,5+1,7 t0>tö,O5
стовская in vitro 41 ±9 30 5,3±0,9 44,6+5,4
традиционный 2006 14±3,9 80 1.7±0,2 9,4±2,1 t0>t<),O5
in vitro 31 ±5,2 80 7,8±0,7 36,8+3,2
ти использования растений, полученных in vitro, в На стадии размножения вишни и микровишни in
качестве маточных (табл.2). vitro хорошие результаты обеспечивает использова-
Окореняемость зеленых черенков сорта Селивер- ние 1... 5 мкМ БАЛ.
стовская в этом случае увеличивается в 2...4 раза, Для окоренения побегов вишни необходимо до-
число корней — в 1,6...3,2 раза. бавлять в питательную среду 1...5 мкМ ИМК.
Выводы. Для сохранения наиболее ценных гибри- Маточные насаждения вишни трудно окореняе-
дов вишни и микровишни в культуру in vitro можно вво- мых сортов, целесообразно закладывать растениями,
дить 30-дневные зародыши, используя питательную сре- размноженными in vitro.
ду Мурасиге-Скуга с 2 мкМ БАЛ (достигается получе- Вишня, выращенная с помощью изолированных
ние 16,7...40 % нормально развивающихся зародышей), апикальных меристем, полностью сохраняет форму
Однако лучшие результаты дает культивирование на та- плодов и листьев, окраску, число хромосом (4х), при-
кой же среде 45-дневных зародышей (50...90 %). сущие материнскому растению.
Литература.
1. Субботин Г.И. Вишня в южной Сибири/ Г.И. Субботин — Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2002. — 145с.
2. Симагин В. С. Направления и перспективы использования отдаленной гибридизации в селекции вишни в Сибири / B.C. Симагин // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. — 2001. — № 1-2. — С. 71-76.
3. Юшев АА. Генофонд родов Cerasus, Microcerasus и Padellus и его ценность для селекции/ АЛ. Юшев // Совершенствование сортимента и технологии возделывания косточковых культур: тез. докл. и выступл. на науч.- метод, конф. (Орел, 14-17 июля 1998г.). — Орел: ВНИ-ИСПК, 1998. - С. 293-296.
4. Субботин Г.И. Новые сорта вишни для Сибири / Г.И. Субботин // Основные направления научного обеспечения отрасли садоводства Сибири: сб. науч. mp./РАСХНСиб. отд-ние. НИИССим. MA. Лисавенко. — Новосибирск, 1991. — С.71-77.
5. Джигадло Е.Н. Использование метода микроклональногоразмножения для создания и сохранения коллекции сортов вишни рода Cerasus vulgaris/ Е.Н. Джигадло, А. Ф. Колесникова, Л.В. Фролова // Селекция и сортовая агротехника плодовых культур: сб. науч. тр. — Орел: Изд-во ГНУ ВНИИСПК, 2004. - С. 135-142.
6. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений/Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. — Киев.: Наукова думка, 1980. — 488 с.
7. Методические указания по выращиванию сеянцев вишни из зародышей изолированных на ранних стадиях развития / В А. Высоцкий, Г.А. Плотникова. — М., 1988. -14 с.
8. Технология выращивания посадочного материала вишни в Сибири: рекомендации / ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние; НИИСС им. М.А. Лисавенко. — Новосибирск, 1989. — 72 с.
9. Методические рекомендации: Цитологические исследования плодовых и ягодных культур: метод, рек. / под ред. ГА. Курсакова. — Мичуринск: ЦГЛ, 1976. — 104 с.
10. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений: учебник для с-х вузов/З.П. Паушева. — М.: Агропромиздат, 1988. — 271 с.
THE USING OF BIOTECHNOLOGICAL METHODS IN THE WORK WITH STONE FRUITS T.V. Plaksina
Summary. The possibility of applying the methods of biotechnology both for obtaining the new forms on the new genetic basis and for the fastest multiplication of new cultivars and valuable hybrid forms was shown.
Keywords: explant, tissue culture, nutrient medium, growth regulators, regeneration.
ВНИМАНИЮ СОИСКАТЕЛЕЙ УЧЕНЫХ СТЕПЕНЕЙ И ДРУГИХ ЗАИНТЕРЕСОВАННЫХ ЛИЦ!
Редакция журнала «Достижения науки и техники АПК» издает монографии и другую книжную продукцию с редактированием и всеми выходными данными.
Цены договорные.
Заявки отправлять по адресу: 101000, г. Москва, Моспочтамт, а/я 166.
Тел.: (495) 557-13-01, (916) 241-63-43 E-mail: agroapk@mail.ru
