CC BY
16Довженко Н. В. и др. Использование биомаркеров для оценки ... DOI: 10.24412/cl-34446-2023 -4-105-108
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОМАРКЕРОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОГО ВЛИЯНИЯ ПЛАСТИКА НА МОРСКИЕ ОРГАНИЗМЫ
Н. В. Довженко, В. В. Слободскова, А. А. Мазур, С. П. Кукла, А. А. Истомина
Тихоокеанский океанологический институт им. В. И. Ильичева ДВО РАН,
г. Владивосток doremeO [email protected]
На долю пластиковых фрагментов и микрочастиц приходится около 60-90 % океанического мусора на планете, что значительно отражается на качестве водной среды и населяющих ее гидробионтах, а пластик, попадающий в среду, становится неотъемлемым компонентом глобального загрязнения. В результате воздействия пластика у морских организмов наблюдаются негативные изменения отдельных процессов на клеточном, тканевом и организменном уровне - активная генерация свободных радикалов в клетках, изменение метаболических процессов, накопление токсичных соединений, выделяемых полимерами. Для диагностики подобных изменений на разных стадиях используются молекулярные маркеры (биомаркеры) - наиболее ранние индикаторы загрязнения окружающей среды. Как правило, это маркеры окислительного стресса, применение которых в экотоксикологическом мониторинге предполагает достоверную корреляцию между активностью метаболических процессов и уровнем загрязнения среды [1].
В данной работе дана оценка токсических эффектов двух видов разноразмерного пластика на двустворчатого моллюска мидию тихоокеанскую Mytilus trossulus Gould, 1850 c помощью биохимических и цитохимических методов, отражающих их деструктивное действие на клеточном уровне.
Материалы и методы исследования
Взрослые особи M. trossulus равного возраста и размера (6,1±0,9 см) были аккли-мированы в течении 7 сут. при температуре +16 °С, солености воды - 32,2-32,6 %о. Проведено 2 серии экспериментов. Эксперимент 1 - с крупными фрагментами (10^10 см) полиэтилена низкого давления (ПНД) и эксперимент 2 - с микросферами (диаметр 0,9 мкм) полистирола (МПС). Контрольные группы для каждого эксперимента ставились отдельно. Общая длительность экспериментов составляла 72 ч, в процессе которого моллюсков не кормили. На одну особь приходилось 0,5 л. В эксперименте 1 в аквариум с моллюсками поместили фрагменты пленки ПНД, (ГОСТ на
пленку ПНД (16338-85)). Общая площадь фрагментов ПНД на один аквариум составляла 0,04 м2/л. Во время экспозиции вода в аквариумах с фрагментами ПНД и контролем 1 не менялась. В эксперименте 2 в аквариум с моллюсками добавили раствор МПС в концентрации 105 шт./л. Для приготовления рабочего раствора «микропластика» использован стандартный раствор МПС (Tianjin BCTRC (Китай)). Смена воды в контрольном аквариуме и с МПС проводилась каждые 24 ч.
Цитохимические методы. Для количественной оценки повреждения ДНК в клетках пищеварительной железы и жабр применен щелочной вариант кометного анализа, адаптированного для морских организмов [2]. Оценку стабильности мембран ли-зосом (СМЛ) в гемолимфе моллюсков проводили цитохимическим методом, основанным на захвате лизосомами красителя, время удерживания которого показывает степень повреждения мембран органеллы. [7].
Биохимические методы. Для определения показателя интегральной антиокси-дантной (АО) активности (ИАА) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) использовали ткани пищеварительной железы и жабр. Определение ИАА в тканях животных проводилось по методу, основанному на способности антиоксидантной системы клеток восстанавливать радикал-катиона ABTS+ [4]. Определение содержания продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в клетках проводили по колорометрическому методу [5].
Результаты всех экспериментов обрабатывали с помощью пакетов программ Excel и Statistica. Достоверность различий между выборками определяли по непараметрическому критерию Манна - Уитни. Различия считали статистически достоверными приp < 0,05.
Результаты и обсуждение
При краткосрочном воздействии разных видов полимеров на M. trossulus мы выявили изменения биохимических параметров в тканях моллюсков, свидетельствующих о развитии окислительного стресса и деструктивных процессах в клеточном аппарате клетки. Показана цито- и генотоксичность фрагментов ПНД и МПС в клетках пищеварительной железы и жабр и гемоцитах M. trossulus (табл. 1).
Механизм действия выбранных нами полимеров различаются по своему характеру. МПС активно взаимодействовали с мидиями, которые с водой проникали внутрь моллюска-фильтратора и наблюдался прямой контакт с жабрами, пищеварительной системой мидий. В результате этого установлено снижение СМЛ в гемоцитах моллюсков - биомаркера прямого действия токсикантов на клетку. Также было показано генотоксичное воздействие МПС - увеличение доли поврежденной ДНК в клетках пищеварительной железы и жабр (табл. 1). В разных экспериментах [6; 8] было показано, что даже при краткосрочных экспозициях МПС вызывали у гидробионтов развитие
Довженко Н. В. и др. Использование биомаркеров для оценки ...
окислительного стресса - образование оксирадикалов и стресс-белков, изменение активности АО ферментов и АО системы, накопление продуктов ПОЛ, дестабилизация мембран лизосом, повреждение молекулы ДНК. Причинами проявлений токсичности пластика можно считать воздействие химических соединений самого полимера. По результатам биохимических показателей также показано, что в присутствии исследуемого действия полимеров, моллюски испытывали окислительный стресс (табл. 1).
Таблица 1
Изменение цитохимических и биохимических параметров в тканях М. ^оътЫъ под воздействием разных видов пластика
% поврежденной ДНК в хвосте СМЛ, мин ИАА, нмоль ед. тролокса / г сыр. веса МДА, нмоль / г сыр. веса
Ткань Жабры Пищ. железа Гемолимфа Жабры Пищ. железа Жабры Пищ. железа
Контроль 1 ПНД Контроль 2 МПс 3,4±0,73 7,89±2,02 2,17±0,39 5,6±0,85 4,95±2,05 8,23±1,67 1,43±0,52 3,29±0,37 58 21,5 77,14 65 15,76±0,91 11,11±0,65 3,34±1,05 2,9±0,09 61,13±1,9 80,61±1,22 22,87±1,24 19,55±0,2 2,39±0,09 3,25±0,05 19,2±1,32 26,34±2,22 3,5±0,07 4,34±0,09 38,94±1,69 47,01±1,97
В отличие от МПС, в наших экспериментах ПНД на прямую не контактировал с моллюсками, но наблюдался выраженный токсический эффект этого полимера. Долгое время считали, что биодоступность полимеров сведена к нулю, так как они являются химически инертным материалом по отношению к живому организму. Однако в состав полимеров входит около 300 составляющих компонентов, и, находясь в открытой морской системе, пластиковые изделия подвергаются различным воздействиям (волновое перемешивание, фотодегадация, механическое действие, выветривание), в результате чего свойства и структура пластика претерпевают значительные изменения [3]. Добавки, входящие в его состав (ПХБФ, фталаты, бисфенол А, красители, пластификаторы), начинают активно вымываться в воду и напрямую воздействовать на гидробионтов. Таким образом, мы наблюдаем биодоступность пластика для живых организмов путем токсичного действия вымытых в воду этих компонентов. В свою очередь эти соединения запускают механизмы генерации оксирадикалов в клетках, что ведет к развитию окислительного стресса, повреждению молекулы ДНК и необратимым патологическим процессам [6]. Развитие этих процессов в эксперименте также показаны нами с помощью биомаркера окислительного стресса (см. табл. 1).
Таким образом, показано, что исследованные нами полимеры представляют серьезную угрозу для биологической системы моллюсков-фильтраторов вне зависимости от размера и вида. Токсическое действие полимеров проявляется на генетическом и биохимическом уровне, в связи с чем анализ воздействия разных видов пластика от
макро- до микроразмеров имеет важное значение в оценке риска для окружающей среды и состояния организма.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 23-27-00361.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Довженко Н. В., Бельчева Н. Н., Челомин В. П. Реакция антиоксидантной системы мидии Грея Crenomytilus grayanus как индикатор загрязнения прибрежных акваторий (залив Петра Великого в Японском море) // Вестник МГОУ. Серия: Естественные науки. 2014. № 4. С. 57-66.
2. Слободскова В. В., Кукла С. П., Челомин В. П. Анализ качества морской среды на основе определения генотоксичности ДНК клеток жабр приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay, 1856) // Биология моря. 2015. Т. 41, № 6. С. 457-460.
3. Andrady A. L. Microplastics in the marine environment // Marine Pollution Bulletin. 2011. Vol. 62. P. 1596-1605.
4. Bartosz G., Janaszewska A., Ertel D., Bartosz M. Simple determination of peroxyl radical-trapping capacity // Biochemistry and Molecular Biology International. 1998. Vol. 46. P. 519-528.
5. Buege J. A., Aust S. D. Microsomal lipid peroxidation // Methods in Enzymology. 1978. P. 302-310.
6. New insights into the aging behavior of microplastics accelerated by advanced oxidation processes / P. Liu, L. Qian, H. Wang, X. Zhan, K. Lu, C. Gu, S. Gao // Environmental Science and Technology. 2019. Vol. 53. P. 3579-3588.
7. Martinez-Gomez C., Bignell J., Lowe D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Technique in Marine Environmental Science. 2015. N 56. 41 p.
8. Exposure of marine mussels Mytilus spp. to polystyrene microplastics: toxicity and influence on fluoranthene bioaccumulation / I. Paul-Pont, C. Lacroix, C. G. Fernandez, H. Hegaret, C. Lambert, N. Le Goic, L. Frere, A. L. Cassone, R. Sussarellu, C. Fabioux, J. Guyomarch // Environmental Pollution. 2016. Vol. 216. P. 724-737.
