CC BY
7
Doi: 10.24412/2226-0757-2023-13049 Экспериментальная неврология
Использование антидепрессантов с антифлогистической активностью в коррекции паркинсоноподобного синдрома у крыс
А.В. Ставровская, Д.Н. Воронков,
И.А. Потапов, А.С. Ольшанский, А.С. Гущина
Данные экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о том, что существенную роль в повреждении нейронов черной субстанции (ЧС) играет нейровоспаление, способствующее инициации и развитию нейродеге-нерации. Односторонние однократные инъекции липополисахарида (ЛПС) в ЧС используются для моделирования болезни Паркинсона in vivo. Флувоксамин, антидепрессант из группы селективных ингибиторов обратного захвата серо-тонина, является также агонистом ^-рецепторов и обладает противовоспалительной активностью. Такие препараты могут иметь потенциал в качестве дополнения к базовой терапии паркинсонизма. Целью исследования являлось сопоставление характера и степени нейровоспаления и двигательных нарушений, развивающихся в ЛПС-индуцированной модели паркинсонизма, на фоне приема флувоксамина. Две группы животных на фоне инъекции ЛПС в ЧС справа (12 мкг/3 мкл) получали перорально физиологический раствор или флувоксамин в дозе 50 мг/кг (объем введения 0,3 мл) ежедневно в течение 3 нед, ложнооперированные животные получали по 0,3 мл физиологического раствора. Двигательную активность исследовали в тестах "открытое поле" и "сужающаяся дорожка". Морфологически оценивали изменения положительных к тирозингидроксилазе нейронов ЧС, астроцитов и микроглии. Введение ЛПС в компактную часть ЧС мозга крыс приводило к потере значительной части дофаминергических нейронов и выраженной глиальной реакции, характеризующейся увеличением экспрессии маркерных белков микроглии и астроцитов. У животных-биомоделей после введения ЛПС развивались двигательные и неврологические нарушения, характерные для паркинсонического синдрома. Введение флувоксамина препятствовало развитию ЛПС-индуцированного нейровоспаления и ослабляло сопутствующую нейродегенерацию. Терапия флувоксамином редуцировала выраженность двигательных и неврологических симптомов у животных.
Ключевые слова: паркинсонизм, липополисахарид, нейровоспаление, флувоксамин.
Введение
Болезнь Паркинсона (БП) - мультисистемное нейроде-генеративное заболевание, относящееся к протеинопати-ям, характеризующееся накоплением и распространением патологических форм a-синуклеина в центральной и периферической нервной системе и гибелью дофаминовых нейронов в черной субстанции (ЧС) среднего мозга, что определяет основные экстрапирамидные проявления заболевания [1]. Несмотря на значительный прогресс в изучении патогенеза БП, причины повышенной уязвимости дофами-
Институт мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва.
Алла Вадимовна Ставровская - канд. биол. наук, рук. лаборатории экспериментальной патологии нервной системы и нейрофармакологии.
Дмитрий Николаевич Воронков - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории нейроморфологии. Иван Александрович Потапов - мл. науч. сотр. лаборатории экспериментальной патологии нервной системы и нейрофармакологии.
Артем Сергеевич Ольшанский - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории экспериментальной патологии нервной системы и нейрофармакологии. Анастасия Сергеевна Гущина - науч. сотр. лаборатории экспериментальной патологии нервной системы и нейрофармакологии.
Контактная информация: Ставровская Алла Вадимовна, alla stav@mail.ru
новых нейронов остаются неясными. Экспериментальные и клинические исследования демонстрируют, что помимо нарушения деградации клеточных белков и накопления a-синуклеина, митохондриальной дисфункции, окислительного стресса существенную роль в повреждении нейронов ЧС играет нейровоспаление, не только сопутствующее ней-родегенерации, но и способствующее ее инициации и развитию [2]. Описан случай развития паркинсонизма у лабораторного работника в результате случайной аппликации в открытую рану липополисахарида (ЛПС) - эндотоксина бактериальной стенки грамотрицательных бактерий, являющегося мощным индуктором воспалительного ответа [3].
В эксперименте интрацеребральные инъекции ЛПС позволяют получить очаг острого нейровоспаления в выбранной структуре. Односторонние однократные инъекции ЛПС в ЧС или стриатум наиболее распространены при моделировании БП in vivo и вызывают хорошо воспроизводимую прогрессирующую дегенерацию дофаминергических нейронов в ЧС у экспериментальных животных [4, 5]. Введение ЛПС активирует резидентную микроглию и астроглию, что приводит к высвобождению активных форм кислорода и азота и стимуляции выработки провоспалительных цито-кинов (фактора некроза опухоли a, интерлейкина-6 (ИЛ-6), ИЛ-1 b), повышенное содержание которых обнаруживается как в нигростриатных структурах мозга и ликворе у паци-
ентов с БП, так и при моделировании паркинсонизма [6]. Важно, что нейровоспаление вызывает и митохондриаль-ные нарушения, в том числе снижение активности мито-хондриального комплекса I в дофаминовых нейронах ЧС, что согласуется с данными о его пониженной активности у пациентов с БП [7-9]. Липополисахариды могут провоцировать повреждение нейронов при БП, в том числе усиливая синуклеиновую патологию, что привело к созданию концепции "двойного удара" (воспаление и протеинопа-тия как синергично действующие факторы патогенеза БП) [10]. Например, ЛПС могут провоцировать нарушение тканевых барьерных функций, что способствует распространению аберрантных форм a-синуклеина [11]. Кроме того, введение ЛПС прямо провоцирует формирование белковых агрегатов у мышей, экспрессирующих мутантный a-синуклеин человека [12]. Было также показано, что ЛПС вызывают формирование токсичных форм a-синуклеина [13, 14]. Нейрональный a-синуклеин, в свою очередь, при повреждении нейронов выделяется в межклеточную среду и активирует микроглию через Toll-подобные рецепторы, что приводит к усилению провоспалительных реакций и прогрессированию повреждения нейронов [15].
Одним из основных регуляторных механизмов иммунного ответа является активация ферментов кинурениново-го пути. При нейровоспалении активированная микроглия усиливает катаболизм триптофана (предшественника се-ротонина) в сторону образования токсичных 3-гидроксики-нуренина и хинолиновой кислоты, что не только приводит к снижению содержания серотонина в мозге, но и провоцирует эксайтотоксическое повреждение нейронов [16, 17]. У пациентов с БП и на экспериментальных моделях паркинсонизма неоднократно показаны изменения активности ферментов кинуренинового пути и увеличение образования хинолиновой кислоты, а дефицит серотонина, возникающий за счет сдвига метаболизма триптофана при нейровос-палении, в свою очередь, считают одной из причин развития клинической депрессии при БП [16-18]. Помимо этого вклад в развитие депрессии вносит и непосредственно повреждение серотонинергических структур при БП, связанное с развитием различных немоторных симптомов БП [19].
Известно, что распространенность депрессии у пациентов с БП высокая - от 40 до 50% [20]. Исследования показали, что антидепрессанты могут обладать противовоспалительным действием, ослабляя экспрессию цитокинов, ингибируя инфильтрацию периферических клеток иммунными и блокируя активацию глии [21, 22]. Флувоксамин является одним из антидепрессантов, обычно используемых в качестве терапии первой линии при больших депрессивных расстройствах [23, 24]. Данные литературы свидетельствуют о том, что флувоксамин, антидепрессант из группы селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, агонист ^-рецепторов (S1R), значительно снижает продукцию ИЛ-6, ИЛ-1 b, ИЛ-12 и ИЛ-8, индуцированную воздействием ЛПС [25]. Кроме того, было отмечено, что флу-
воксамин снижает экспрессию генов COX-2, ICAM1, VCAM1 и iNOS в клеточных линиях макрофагов [26]. Считается также, что активность флувоксамина как агониста S1R способствует его противовоспалительному и антиоксидантно-му действию [27]. В качестве одной из вероятных причин нейропротективного действия агонистов S1R указывают подавление активации микроглии, в том числе ингиби-рование пуринергических рецепторов глиальных клеток, определяющих реактивный ответ микроглии на повреждение нейронов и высвобождение аденозинтрифосфата [2B-3G]. В отдельных исследованиях на токсических моделях БП с введением нейротоксинов б-гидроксидофамина и 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина наблюдалось снижение повреждения дофаминовых нейронов ЧС под действием агонистов S1R [31, 32].
Целью исследования являлась оценка характера, степени нейровоспаления и двигательных нарушений, развивающихся в ЛПС-индуцированной модели паркинсонизма, на фоне приема флувоксамина.
Материал и методы
Все эксперименты проводились с соблюдением надлежащих биоэтических норм по работе с лабораторными животными, в том числе с возможным сокращением числа использованных животных. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ "Научный центр неврологии" (протокол №5-3/22 от G1.G6.2G22 г.).
Животные. Работа была проведена на 2B самцах крыс Вистар (возраст 3,5 мес, масса 3GG-35G г), полученных из питомника ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России, филиал "Столбовая". В иммуномор-фологическом исследовании были использованы образцы мозга от всех крыс.
Манипуляции с животными проводили в соответствии с требованиями European Convention for the Protection of Vertebrai Animais Used for Experimentai and Other Scientific Purposes (CETS No. 17G) (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях), приказом МЗ РФ № 119Н от 1 апреля 2G16 г. "Об утверждении Правил лабораторной практики", а также руководствуясь "Правилами работы с лабораторными грызунами и кроликами" (ГОСТ 33216-2G14). Животные содержались в стандартных условиях вивария, со свободным доступом к пище и воде, в режиме 12-часового чередования свет/тьма. До начала эксперимента животные находились на 14-дневном карантине.
Хирургические процедуры. Для создания нейровоспа-лительной модели паркинсонического синдрома использовали ЛПС из Escherichia coli, серотип G111 :B4 (Sigma-Aidrich, США). Липополисахарид растворяли в физиологическом растворе и вводили крысам во время стереотакси-ческих операций на головном мозге.
Для анестезии использовали золетил 1GG (Vaidepharm, Франция; растворитель Deipharm Tours, Франция) в дозе
3 мг/100 г и ксилу (Interchemie werken "De Adelaar" B.V., Нидерланды) в дозе 3 мг/кг, которые вводились внутримышечно. Для премедикации вводили атропин (ОАО "Даль-химфарм", Россия) в дозе 0,04 мг/кг подкожно за 10-15 мин до введения ксилы.
Введение раствора ЛПС (12 мкг в 3 мкл физиологического раствора) осуществляли в компактную часть ЧС мозга крыс справа (n = 20) в соответствии с координатами атласа мозга крыс (АР = -4,8; L = 2,2; V = 8,0) [33]. С левой стороны вводили физиологический раствор в том же объеме. Ложнооперированным (контрольным) животным (n = 8) билатерально вводили по 3 мкл физиологического раствора.
Введение антидепрессанта. Через 2 дня после хирургических процедур экспериментальные животные с введением ЛПС были разделены на 2 группы по 10 крыс в каждой. Животным одной группы перорально вводили антидепрессант флувоксамина малеат (Эбботт Хелскеа САС, Франция), растворенный в физиологическом растворе, в дозе 50 мг/кг (объем введения 0,3 мл) ежедневно в течение 3 нед, животным другой группы вводили физиологический раствор в том же объеме. Ложнооперированные животные получали по 0,3 мл физиологического раствора.
Морфологическое исследование. Через 60 дней после введения ЛПС животных выводили из эксперимента. Крыс декапитировали с помощью гильотины, извлекали мозг и фиксировали его в 4% растворе формалина в течение 24 ч. Образцы пропитывали 30% раствором сахарозы, затем помещали в среду Tissue-Tek O.C.T., замораживали и готовили фронтальные срезы толщиной 12 мкм с использованием криостата Tissue-Tek Cryo3 Flex (Sakura Finetek, США). Тепловую демаскировку антигенов проводили в цитратном буфере (pH 6,0) в течение 15 мин. Срезы окрашивали имму-нофлуоресцентным методом для выявления тирозингидро-ксилазы, маркерного белка дофаминергических нейронов, а также кислого глиофибриллярного белка (glial fibrillary acidic protein, GFAP) и маркерного белка микроглии - связывающей ионизированный кальций адаптерной молекулы 1 (Ionized calcium-binding adapter molecule 1, IBA1). Ядра клеток докрашивали с использованием 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Из каждого образца мозга на уровне хвостатого ядра и ЧС исследовали серию срезов, взятых на разных уровнях по рострокаудальной оси. Срезы изучали под флуоресцентным микроскопом Eclipse Ni-U (Nikon, Япония). Срезы документировали, используя микроскопы Eclipse Ni-U и SMZ18 (Nikon), оценивали среднюю интенсивность флуоресценции (с коррекцией на фоновое окрашивание) ткани. Оценку фрактальной размерности микроглии (безразмерный показатель, определяющий сложность контура фигуры) [34] проводили при помощи программы ImageJ (США).
Физиологическое исследование. Для комплексной оценки поведенческих эффектов воздействия ЛПС и введения антидепрессанта использовали тесты "открытое поле" (ОП), "сужающаяся дорожка" (СД) и "цилиндр".
Полученные данные анализировали с помощью системы видеонаблюдения ANY-maze (Stoelting Inc., США) и соответствующего программного обеспечения. Перед проведением стереотаксической операции тест ОП использовался для определения исходного уровня двигательной активности крыс.
Обучение животных для выполнения теста СД проводилось в течение 3 дней, по 2 сессии в день с перерывом в 1 ч, перед проведением стереотаксических операций на мозге.
Для выполнения теста "цилиндр" животные индивидуально помещаются в цилиндр из плексигласа с открытым верхом. Высота цилиндра и его ширина были достаточными для того, чтобы животное не могло убежать и пространство позволяло ему развернуться. В нашем исследовании высота цилиндра составляла 40 см, диаметр - 20 см. Продолжительность теста составляла 5 мин. Оценивалось количество контактов со стенкой цилиндра, выполненных правой и левой передними лапами при выполнении крысой стойки с опорой. Полученные численные данные позволяют вычислить показатель асимметрии использования конечностей: использование конечности, контралатеральной стороне повреждения мозга, в процентах от общего числа касаний правой и левой лапами [35].
Статистический анализ. Обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения Statistica 12 (StatSoft, США). Для анализа был применен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), а после этого было выполнено апостериорное сравнение по критерию Фишера. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Для определения статистической значимости различий использовался уровень значимости p < 0,05.
Результаты
Физиологические исследования. В тесте ОП было выявлено, что величина пройденного пути у контрольных крыс во всех экспериментах сохранялась на уровне, определенном до вмешательств и составляющем в среднем 8,54 ± 0,81 м.
Интранигральное введение ЛПС привело к статистически значимому снижению этого показателя в первом тесте -через 10 дней (p = 0,0201). У крыс, леченных феварином, различий в величине пройденной дистанции по сравнению с контрольной группой не выявлялось, статистически значимые различия относились к группе ЛПС + физиологический раствор (р = 0,0041) (рис. 1). В последующих тестах, через 30 и 60 дней после введения ЛПС, различия в величине пройденного пути при сравнении между группами животных отсутствовали. Промежуток времени между введением ЛПС и началом введения феварина составлял 2 дня, всего применена 21 доза феварина.
Тест СД показал выраженные изменения в работе передних конечностей у крыс группы ЛПС + физиологический раствор по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Число соскальзываний правой передней лапой статистически
X
г
о S
et
14 12 10 8 6 4 2 0
10 дней IФР + ФР
30 дней ЛПС + ФР
60 дней ЛПС + феварин
Рис. 1. Дистанция, пройденная в ОП, на разных сроках после введения ЛПС. Здесь и на рис. 2-4, 6, 8, 10: различия статистически значимы (р < 0,05): * - по сравнению с контрольной группой; ** - по сравнению с группой ЛПС + ФР (физиологический раствор).
значимо увеличивалось (последовательно в тестах: через 10 дней - р = 0,0264, через 30 дней - р = 0,0495, через 60 дней - р = 0,0495), а левой - уменьшалось (последова-
тельно
(а) 60
^ 50
IS
S
X се 40
с
?
о о 30
о
ш
Б CD 20
5
С
2. 10
0
p = 0,0232, через 60 дней - p = 0,0443). У группы крыс, получавших феварин, различий с контрольной группой не выявлено (см. рис. 2). Статистически значимые различия в числе соскальзываний правой передней лапы относились к группе ЛПС + физиологический раствор при p = 0,0105 и p = 0,0420 в тестах через 10 и 30 дней, соответственно, и левой - при р = 0,0308, р = 0,0418, р = 0,0211 в тестах через 10, 30 и 60 дней соответственно (ANOVA post-hoc Fisher). При этом отчетливых нарушений движений задних конечностей у крыс опытных групп по сравнению с контрольными животными ни в одном из 3 тестов СД выявлено не было. Такие двигательные особенности сохранялись во всех проведенных тестах СД.
Уровень невротизации, т.е. развития неврозоподоб-ного состояния, у животных оценивали в баллах (балл невротизации). Были получены следующие результаты: через 10 дней после операции балл невротизации значимо повысился у крыс на фоне действия ЛПС (p = 0,0388 при сравнении с контрольной группой), введение феварина эффекта не оказало (p = 0,9754 при сравнении с группой ЛПС + физиологический раствор), различия в уровне балла невроти-
(б) 60
50
>s~
X л 40
1
о о 30
о
m
Б CD 20
5
1 10
0
10 дней 30 дней 60 дней 10 дней
■ ФР + ФР ЛПС + ФР I ЛПС + феварин
30 дней
60 дней
Рис. 2. Количество соскальзываний (оступаний) передними конечностями у экспериментальных крыс в тесте СД (относительно общего количества шагов) на разных сроках после введения ЛПС: а - слева; б - справа.
о о
Ii
О 5
о
о в
Sf
й X О аз и со о
а. >
55 г
10 дней I ФР + ФР
30 дней ЛПС + ФР
60 дней ЛПС + феварин
Рис. 3. Изменение неврозоподобного состояния экспериментальных крыс на фоне действия ЛПС и терапии фева-рином.
ФР + ФР
ЛПС + ФР ЛПС + феварин
Рис. 4. Количество касаний стенки цилиндра передней конечностью, контралатеральной стороне повреждения (относительно общего количества касаний обеими лапами).
зации в сравнении с контрольными крысами сохранялись (p = 0,0448). Через 30 дней после операции у контрольных крыс не выявлялось неврозоподобного состояния (0 баллов); соответственно, различия при сравнении с группами ЛПС + физиологический раствор и ЛПС + феварин оставались значительными (рис. 3). Достоверные различия появились и между самими этими группами (p = 0,0444); подобная ситуация наблюдалась и через 60 дней (при парном сравнении групп: физиологический раствор + физиологический раствор vs ЛПС + физиологический раствор - p = 0,00151; физиологический раствор + физиологический раствор vs ЛПС + феварин - p = 0,0245; ЛПС + + физиологический раствор vs ЛПС + феварин - p = 0,0398).
Тест "цилиндр" проводили через 30 дней после введения ЛПС. Было выявлено, что крысы группы ЛПС + физиологический раствор значительно реже использовали левую переднюю лапу, контралатеральную стороне повреждения, чем правую, при опоре на стенку цилиндра во время выполнения стоек по сравнению как с контрольными животными (p = 0,0169), так и с группой ЛПС + феварин (p = 0,0472) (рис. 4). У крыс группы ЛПС + феварин, как и у контрольных животных, не наблюдалось преимущественного использования какой-либо из передних конечностей.
Морфологическое исследование. Через 60 дней после введения ЛПС в группе ЛПС + физиологический раствор было выявлено повреждение дофаминовых нейронов и значимое (p = 0,0024) снижение интенсивности их иммуно-гистохимического окрашивания на тирозингидроксилазу (рис. 5, 6).
Введение феварина позволило сохранить значительное количество дофаминовых нейронов, что выразилось в том числе в более высокой интенсивности окрашивания (см. рис. 6).
Интенсивность окрашивания на тирозингидроксилазу в ЧС по сравнению с контралатеральной стороной составила у животных группы ЛПС + физиологический раствор 60,6%, а в группе ЛПС + феварин - 80,87%. Различия между группой ЛПС + физиологический раствор и контролем были статистически значимыми при p = 0,002, между группами ЛПС + физиологический раствор и ЛПС + феварин -при p = 0,0421. В то же время различий между группами ЛПС + феварин и контрольной не выявлено.
Непосредственно в очаге введения ЛПС обнаруживалось значительное количество 1ВА1-положительных макрофагов, лишенных отростков, а вокруг области введения -гипертрофированная микроглия (рис. 7).
Интенсивность окрашивания микроглии была значимо выше (p = 0,0001) через 60 дней после введения ЛПС. Различия между группами носили статистически значимый характер: ЛПС + физиологический раствор vs физиологический раствор + физиологический раствор - р < 0,0001; ЛПС + феварин vs физиологический раствор + физиологический раствор - р = 0,0046; ЛПС + физиологический раствор vs ЛПС + + феварин - р = 0,0336 (ANOVA post-hoc Tukey) (рис. 8а).
ш V • ..
■Щу -J' "* * * \ л *
Рис. 5. Различия в степени выраженности повреждения дофаминовых нейронов ЧС мозга крыс при одностороннем интранигральном введении ЛПС: а - физиологический раствор + физиологический раствор; б - ЛПС + физиологический раствор; в - ЛПС + феварин. х4.
120 г
ФР + ФР
ЛПС + ФР ЛПС + феварин
Рис. 6. Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на тирозингидроксилазу в ЧС мозга крыс (относительно контралатерального полушария).
Рис. 7. Активация микроглии (1ВА1, зеленый цвет) и реакция астроцитов (вРАР, красный цвет) в ЧС под действием ЛПС: а - физиологический раствор + физиологический раствор; б - ЛПС + физиологический раствор; в - ЛПС + + феварин. х10.
Астроциты в области введения ЛПС также характеризовались гипертрофией, деформацией отростков и формировали глиальный вал вокруг очага. Однако изменения интенсивности окрашивания на вРАР на стороне введения ЛПС не были статистически значимыми (р = 0,0637) (рис. 8б). По сравнению с контролем, где реакция астро-глии была вызвана только механической травмой, ЛПС вызывал более выраженное усиление глиального ответа.
На расстоянии от места введения активированная 1ВА1-положительная микроглия была гипертрофирована и имела кустистую форму (рис. 9). Фрактальная размерность микроглии в ЧС на расстоянии от места введения
(а)
250 г
£
о
X
0)
200
150
100
50
I
ФР + ФР
ЛПС + ФР ЛПС + феварин
ФР + ФР
ЛПС + ФР ЛПС + феварин
Рис. 8. Интенсивность иммуногистохимического окрашивания на 1ВА1 (а) и вРАР (б) в ЧС мозга крыс (относительно контрала-терального полушария).
ЛПС была статистически значимо выше по сравнению с контролем (р < 0,001) (рис. 10). В группе ЛПС + феварин фенотипические характеристики микроглии изменялись и по показателю фрактальной размерности статистически значимо не отличались от контроля (р = 0,0927), при этом фрактальная размерность оказалась статистически значимо ниже в сравнении с группой, получавшей только ЛПС (р = 0,04). Вместе с тем снижение фрактальной размерности в группе, получавшей феварин, скорее отражает
а (б^^ШЖИ (В) I
Рис. 9. Характерные типы формы микроглии (1ВА1, зеленый цвет), ядра клеток докрашены ОДР! (синий цвет): а -физиологический раствор + физиологический раствор; б -ЛПС + физиологический раствор; в - ЛПС + феварин. х40.
ФР + ФР
ЛПС + ФР ЛПС + феварин
Рис. 10. Фрактальная размерность микроглии в ЧС на удалении от очага воспаления после введения ЛПС.
не столько уменьшение активации глии, сколько переход между ее активированными формами.
Обсуждение
Основными проявлениями БП в первую очередь являются двигательные симптомы - гипокинезия, тремор покоя (нередко асимметричный), мышечная ригидность, пост-уральная неустойчивость [1]. В нашем эксперименте введение ЛПС в ЧС приводило к гибели нигральных нейронов и вызывало снижение двигательной активности модельных животных, что отразилось в укорочении пройденной дистанции в тесте ОП, нарушении координации движений при прохождении теста СД и снижении использования передней конечности, контралатеральной стороне повреждения, в тесте "цилиндр". Увеличение доли соскальзываний передней конечности ипсилатеральной стороны поврежденного полушария связано с ослаблением функции контра-латеральной конечности - частичной утратой ею опорной функции и, соответственно, способности сохранять равномерное распределение массы тела.
Тест СД выявил также наличие "нестандартной" поведенческой активности крыс с моделью БП. Во время тестирования у них наблюдались стереотипные движения головой, интенсивное обнюхивание и лизание установки, стереотипные жевательные движения, длительные замирания и др. Животные либо вовсе отказывались от движения по дорожке, либо преодолевали расстояние до укрытия за значительно более длительное время, чем контрольные. Такие формы поведенческой активности свидетельствуют о нарушении эмоционального статуса животных и развитии у них неврозоподобного состояния [36-38]. Следует отметить, что формирование синдрома паркинсонизма тесно связано с нарушениями эмоционального состояния [39]. Недвигательные (в том числе аффективные и когнитивные) нарушения сопровождают все стадии БП и могут опережать манифестацию двигательных нарушений на 5-10 лет [40]. Возникновение этих нарушений объясняется тем, что наря-
ду с дегенеративными изменениями нигростриатной системы мозга при БП имеет место также вовлечение мезолим-бической дофаминергической системы [20, 41]. Таким образом, интранигральное введение ЛПС представляет собой ценную методику для моделирования паркинсонического синдрома и воспроизводит у животных помимо двигательных симптомов и нарушения эмоционального состояния.
У животных, получавших флувоксамин, при физиологическом тестировании было выявлено снижение проявлений паркинсонизма и уменьшение выраженности поведенческих нарушений. Ранее нами было отмечено отсутствие значимого влияния флувоксамина в дозе 25 мг/кг на поведение животных с интранигральным введением ЛПС (не опубликовано). Это согласуется с данными ряда других исследований и обусловило увеличение дозы препарата до 50 мг/кг. Терапия флувоксамином позволила сохранить общую двигательную активность животных-биомоделей на уровне контрольных крыс. Кроме того, функции передних конечностей (как показано в тестах СД и "цилиндр"), устойчивость позы и координация движений у этих животных значимо улучшились по сравнению с группой ЛПС + физиологический раствор. Введение антидепрессанта также предотвращало развитие у животных неврозоподобного состояния, вызываемого ЛПС.
В результате введения ЛПС в ЧС наблюдалось повреждение дофаминовых нейронов, активация микроглии и астроцитов. Гипертрофия и усиление ветвления микро-глии, увеличение экспресии GFAP в ЧС даже на удалении от места введения свидетельствуют о высокой интенсивности воспалительного процесса, вызываемого ЛПС. Ранее при тех же условиях эксперимента мы наблюдали, что к 60 дням после введения ЛПС отмечается выраженный глиальный ответ, тогда как через 90 дней провоспалительная реакция снижается, но изменения в нервной ткани сохраняются до 12 мес и дольше [42, 43]. Флувоксамин в проведенном эксперименте ослаблял ЛПС-индуцированное нейровос-паление, способствовал сохранению дофаминергических нейронов и снижал количество микроглии, но значимо не влиял на экспрессию GFAP астроцитами в ЧС.
Снижение же интенсивности окрашивания на маркерный белок микроглии IBA1 и уменьшение ветвления клеток микроглии в группе, получавшей флувоксамин, согласуются с данными о его противовоспалительной активности [25]. Изменение фенотипических показателей реактивной микроглии у животных, получавших флувоксамин, может быть связано с усилением дендропротекции согласно гипотезе, изложенной в работе H. Morrison et al. [34]. Это наблюдение согласуется со стимуляцией олигодендроге-неза, характерной для действия флувоксамина [44]. Снижение реактивности микроглии приводит к изменению экспресии цитокинов и может быть причиной наблюдавшегося при действии флувоксамина уменьшения гибели дофаминовых нейронов. Кроме того, продукция цитокинов микро-глией и другие провоспалительные изменения связаны с развитием депрессии [18, 45], а изменение состояния
микроглии в результате противовоспалительного действия флувоксамина могло вносить свой вклад в улучшение эмоциональных показателей животных в нашем эксперименте.
Таким образом, проведенное нами исследование свидетельствует о снижении неврологического дефицита, ослаблении повреждения нейронов ЧС и снижении активации микроглии в результате применения флувоксамина на разных сроках развития экспериментального паркинсонизма при нейровоспалительном процессе в ЧС, вызванном введением ЛПС. Полученные данные позволяют обсуждать целесообразность применения изученного антидепрессанта с противовоспалительными свойствами в дополнение к базисной терапии паркинсонизма.
Список литературы
1. Иллариошкин С.Н., Левин О.С., Федотова Е.Ю., Колоколов О.В. Паркинсонизм и черная субстанция. М.: Атмосфера; 2019. 304 с.
2. Dutta G, Zhang P, Liu B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology 2008 Oct;22(5):453-64.
3. Niehaus I, Lange JH. Endotoxin: is it an environmental factor in the cause of Parkinson's disease? Occupational and Environmental Medicine 2003 May;60(5):378-8.
4. Hunter RL, Cheng B,ChoiDY Liu M, Liu S, Cass WA, Bing G. Intrastriatal lipopolysaccharide injection induces parkinsonism in C57/B6 mice. Journal of Neuroscience Research 2009;87(8):1913-21.
5. Bao LH, Zhang YN, Zhang JN, Gu L, Yang HM, Huang YY Xia N, Zhang H. Urate inhibits microglia activation to protect neurons in an LPS-induced model of Parkinson's disease. Journal of Neuroinflammation 2018 May;15(1):131.
6. Nagatsu T, Sawada M. Inflammatory process in Parkinsons disease: role for cytokines. Current Pharmaceutical Design 2005;11(8):999-1016.
7. Hunter R, Ojha U, Bhurtel S, Bing G, Choi DY Lipopolysaccharide-in-duced functional and structural injury of the mitochondria in the nig-rostriatal pathway. Neuroscience Research 2017 Jan;114:62-9.
8. Esteves AR, Silva DF, Banha D, Candeias E, Guedes B, Cardoso SM. LPS-induced mitochondrial dysfunction regulates innate immunity activation and a-synuclein oligomerization in Parkinson's disease. Redox Biology 2023 Jul;63:102714.
9. Subrahmanian N, LaVoie MJ. Is there a special relationship between complex I activity and nigral neuronal loss in Parkinson's disease? A critical reappraisal. Brain Research 2021 Sep;1767:147434.
10. Brown GC, Camacho M, Williams-Gray CH. The endotoxin hypothesis of Parkinson's disease. Movement Disorders 2023 Jul;38(7):1143-55.
11. Sui YT, Bullock KM, Erickson MA, Zhang J, Banks WA. Alpha syn-uclein is transported into and out of the brain by the blood-brain barrier. Peptides 2014 Dec;62:197-202.
12. Rutherford NJ, Sacino AN, Brooks M, Ceballos-Diaz C, Ladd TB, Howard JK, Golde TE, Giasson BI. Studies of lipopolysaccharide effects on the induction of a-synuclein pathology by exogenous fibrils in transgenic mice. Molecular Neurodegeneration 2015 Jul;10(1):32.
13. Koopman H, Jackson S, Anichtchik O, Carroll C. LPS induces aggregation of a-synuclein in monocytes. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry 2015;86(11):e4.188-e4.
14. Kim C, Lv G, Lee JS, Jung BC, Masuda-Suzukake M, Hong CS, Valera E, Lee HJ, Paik SR, Hasegawa M, Masliah E, Eliezer D, Lee S. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of a-synuclein fibril. Scienetific Reports 2016 Aug;6(1):30891.
15. Zhang QS, Heng X Yuan YH, Chen NH. Pathological a-synuclein exacerbates the progression of Parkinson's disease through microglial activation. Toxicology Letters 2017 Jan;265:30-7.
16. Lim CK, Fernandez-Gomez FJ, Braidy N, Estrada C, Costa C, Costa S, Bessede A, Fernandez-Villalba E, Zinger A, Herrero MT, Guillemin GJ. Involvement of the kynurenine pathway in the patho-
genesis of Parkinson's disease. Progress in Neurobiology 2017 Aug;155:76-95.
17. Troubat R, Barone P, Leman S, Desmidt T, Cressant A, Atanasova B, Brizard B, El Hage W, Surget A, Belzung C, Camus V. Neuroinflammation and depression: a review. The European Journal of Neuroscience 2021 Jan;53(1):151-71.
18. Santiago RM, Vital MABF, Sato MDO, Adam JP. Depression in Parkinson's disease is associated with a serotoninergic system change secondary to neuroinflammation. International Journal of Neurology and Neurotherapy 2016;3(6):1-4.
19. Politis M, Niccolini F. Serotonin in Parkinson's disease. Behavioral Brain Research 2015 Jan;277:136-45.
20. Hemmerle AM, Herman JP, Seroogy KB. Stress, depression and Parkinson's disease. Experimental Neurology 2012 Jan;233(1):79-86.
21. Путилина М.В. Современные представления о терапии тревожно-депрессивных расстройств при хронической ишемии головного мозга. Русский медицинский журнал 2011;19(9):569-73.
22. Chung YC, Kim SR, Jin BK. Paroxetine prevents loss of nigrostriatal dopaminergic neurons by inhibiting brain inflammation and oxidative stress in an experimental model of Parkinson's disease. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1990) 2010 Jul;185(2):1230-7.
23. Muck-Seler D, Pivac N, Diksic M. Acute treatment with fluvoxam-ine elevates rat brain serotonin synthesis in some terminal regions: an autoradiographic study. Nuclear Medicine and Biology 2012 0ct;39(7):1053-7.
24. Omori IM, Watanabe N, Nakagawa A, Cipriani A, Barbui C, McGuire H, Churchill R, Furukawa TA. Fluvoxamine versus other anti-depressive agents for depression. The Cochrane Database of Systematic Review 2010 Mar;(3):CD006114.
25. Rosen DA, Seki SM, Fernández-Castañeda A, Beiter RM, Eccles JD, Woodfolk JA, Gaultier A. Modulation of the sigma-1 receptor-IRE1 pathway is beneficial in preclinical models of inflammation and sepsis. Science Translational Medicine 2019 Feb;11(478):eaau5266.
26. Rafiee L, Hajhashemi V, Javanmard SH. Fluvoxamine inhibits some inflammatory genes expression in LPS/stimulated human endothelial cells, U937 macrophages, and carrageenan-induced paw edema in rat. Iranian Journal of Basic Medicinal Sciences 2016 Sep;19(9):977-84.
27. Khani E, Entezari-Maleki T. Fluvoxamine and long COVID-19; a new role for sigma-1 receptor (S1R) agonists. Molecular Psychiatry 2022 Sep;27(9):3562-2.
28. Hall AA, Herrera X Ajmo CT Jr, Cuevas J, Pennypacker KR. Sigma receptors suppress multiple aspects of microglial activation. Glia 2009 May;57(7):744-54.
29. Siddiqui T, Bhatt LK. Targeting sigma-1 receptor: a promising strategy in the treatment of Parkinson's disease. Neurochemical Research 2023 0ct;48(10):2925-35.
30. Calovi S, Mut-Arbona P, Sperlágh B. Microglia and the purinergic signaling system. Neuroscience 2019 May;405:137-47.
31. Francardo V, Bez F, Wieloch T, Nissbrandt H, Ruscher K, Cen-ci MA. Pharmacological stimulation of sigma-1 receptors has neurorestorative effects in experimental parkinsonism. Brain 2014 Jul;137(Pt 7):1998-2014.
32. Voronin MV, Kadnikov IA, Voronkov DN, Seredenin SB. Chaperone SigmaIR mediates the neuroprotective action of afobazole in the 6-OHDA model of Parkinson's disease. Scientific Reports 2019 Nov;9(1):17020.
33. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 7th ed. Amsterdam, New York: Academic Press; 2013. 480 p.
34. Morrison H,Young K, Qureshi M, Rowe RK, Lifshitz J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Scientific Reports 2017 Oct;7(1):13211.
35. Cobos E, Portillo-Salido E. "Bedside-to-bench" behavioral outcomes in animal models of pain: beyond the evaluation of reflexes. Current Neuropharmacology 2013 Dec;11(6):560-91.
36. Болотова В.Ц., Крауз В.А., Шустов Е.Б. Биологическая модель экспериментального невроза у лабораторных животных. Биомедицина 2015;1:66-80.
37. Ставровская А.В., Ольшанский А.С., Ямщикова Н.Г., Гущина А.С. Выявление немоторных нарушений на классической модели болезни Паркинсона. Вестник Российской военно-медицинской академии 2018;3(63):104-6.
38. Ставровская А.В., Воронков Д.Н., Ольшанский А.С., Гущина А.С., Ямщикова Н.Г. Взаимосвязь локализации повреждений дофаминовой иннервации стриатума и их поведенческих проявлений на 6-гидроксидофамин-индуцированной модели паркинсонизма у крыс. Анналы клинической и экспериментальной неврологии 2021;15(2):42-9.
39. Stein MB, Heuser IJ, Juncos JL, Uhde TW. Anxiety disorders in patients with Parkinson's disease. American Journal of Psychiatry 1990 Feb;147(2):217-20.
40. Chaudhuri KR, Healy DG, Schapira AH. Non-motor symptoms of Parkinson's disease: diagnosis and management. The Lancet. Neurology 2006 Mar;5(3):235-45.
41. Santiago RM, Barbieiro J, Lima MMS, Dombrowski PA, Andreati-ni R, Vital MABF. Depressive-like behaviors alterations induced by intranigral MPTP, 6-OHDA, LPS and rotenone models of Parkinson's disease are predominantly associated with serotonin and dopamine. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry 2010 Aug;34(6):1104-14.
42. Voronkov DN, Stavrovskaya AV, Potapov IA, Guschina AS, Olshan-skiy AS. Glial reaction in a neuroinflammatory model of Parkinson's disease. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2023 Mar;174(5):693-8.
43. Herrera AJ, Castaño A, Venero JL, Cano J, Machado A. The single intranigral injection of LPS as a new model for studying the selective effects of inflammatory reactions on dopaminergic system. Neurobiology of Disease 2000 Aug;7(4):429-47.
44. Ghareghani M, Zibara K, Sadeghi H, Dokoohaki S, Sadeghi H, Aryanpour R, Ghanbari A. Fluvoxamine stimulates oligodendrogen-esis of cultured neural stem cells and attenuates inflammation and demyelination in an animal model of multiple sclerosis. Scientific Reports 2017 Jul;7(1):4923.
45. Wang Q, Liu X Zhou J. Neuroinflammation in Parkinson's disease and its potential as therapeutic target. Translational Neurodegeneration 2015 0ct;4(1):19. j
Use of Antidepressants with Antiphlogistic Activity in the Correction of Parkinson-like Syndrome in Rats
A.V. Stavrovskaya, D.N. Voronkov, I.A. Potapov, A.S. Olshansky, and A.S. Gushchina
Experimental and clinical studies demonstrate that neuroinflammation plays a significant role in the damage of neurons in substantia nigra (SN), contributing to the initiation and development of neurodegeneration. Single unilateral injections of lipopolysaccharide (LPS) into the SN are used to model Parkinson's disease in vivo. Fluvoxamine, an antidepressant from the group of selective serotonin reuptake inhibitors, is also a receptor agonist with anti-inflammatory activity. Such drugs can serve as an addition to the baseline therapy of parkinsonism. The purpose of this study was to compare the nature and degree of neuroinflammation and motor disorders developing in the LPS-induced model of parkinsonism with the background of fluvoxamine administration. Two groups of Wistar rats after LPS injection into the right SN (12 |g/3 |L) orally received saline solution or fluvoxamine at a dose of 50 mg/kg (injection volume 0.3 mL) daily for 3 weeks. Sham-operated animals received 0.3 mL of saline solution. Motor activity was evaluated in the open field and narrow beam tests. Morphological changes of tyrosine hydroxylase-positive SN neurons, astrocytes, and microglia were analyzed. Lipopolysaccharide injection into SN pars compacta led to the loss of dopaminergic neurons and expressed glial reaction characterized by increased expression of marker proteins of microglia and astrocytes. After LPS injection model animals developed motor and neurological impairments typical for parkinsonism syndrome. Administration of fluvoxamine prevented the development of LPS-induced neuroinflammation and attenuated the associated neurodegeneration. Fluvoxamine treatment significantly reduced the severity of motor and neurological symptoms in animals. Key words: parkinsonism, lipopolysaccharide, neuroinflammation, fluvoxamine.
