Ионометрическое определение цефуроксима и цефуроксим аксетила в биологических и лекарственных средах Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 543.554.6:

ИОНОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕФУРОКСИМА И ЦЕФУРОКСИМ АКСЕТИЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДАХ

О. И. Кулапина1, М. С. Михайлова2, Е. Г. Кулапина2

1Саратовский государственный медицинский университет 2Саратовский государственный университет E-mail: [email protected]

Разработаны потенциометрические сенсоры на основе ионных ассоциатов цефуроксима с катионами тетраалкиламмония. Сенсоры обеспечивают широкий диапазон определяемых содержаний антибиотиков 1-1СТ4 (8-1СТ5) - 1-10-2 М; предел обнаружения антибиотиков составляет п-10-5 (10-6) М, что позволяет использовать сенсоры для определения цефуроксима и цефуроксим ак-сетила в биологических средах (ротовой жидкости) для корректировки и оптимизации курса лечения, а также для определения основного вещества в лекарственных препаратах. Ключевые слова: цефуроксим, цефуроксим аксетил, водные среды, ротовая жидкость, сенсоры.

Ionometric Determination of Cefuroxime and Cefuroxime Axetil in Biological and Medical Treatment

O. I. Kulapina, M. S. Mikhailova, E. G. Kulapina

Potentiometric sensors based on ion associates cefuroxime with tetra-alkylammonium cations were developed. Sensors exhibited linear response toward antibiotics in the range from 110-4 (810-5) to 110-2 M. The detection antibiotic limit was n-10-5 (10-6) M. Therefore sensors may be used for determination of cefuroxime and cefuroxime axetil in biological liquid (oral fluid) to correction and optimize of the medical treatment, as well as to pure identify of drugs. Key words: cefuroxime, cefuroxime axetil, water objects, oral fluid, sensors.

Введение

Беталактамные антибиотики (|3-лактамы) -самая большая группа антимикробных препаратов, которая составляет 25% от общего числа антибактериальных препаратов. Эта группа включает в себя множество наименований, объединенных наличием в их химической структуре в-лактамного кольца, отвечающего за антимикробную активность; при разрушении в-лактамного кольца антимикробная активность препарата теряется. Основные особенности и преимущества перед другими группами лекарственных средств связаны со способностью этих препаратов подавлять рост возбудителей инфекций без серьезного побочного воздействия на организм больного [1].

Большую часть в-лактамных антибиотиков составляют пенициллины и цефалоспорины. В основном это препараты для парентерального применения, которые в настоящее время занимают ведущее место при лечении различных инфекций в стационаре.

В амбулаторной практике широко применяются парентеральные и пероральные цефалоспорины II поколения. Цефуроксим и цефуроксим аксетил в настоящее время рассматриваются как основные препараты для лечения любых внеболь-ничных респираторных инфекций (внебольнич-ной пневмонии, хронического бронхита и других инфекционно-соматических патологий) [1-3]. Авторами работы [4] была показана возможность ступенчатой терапии цефуроксимом больных с внебольничной пневмонией - парентеально, а затем перорально цефуроксим аксетилом. Уровень концентраций цефуроксима в крови при замене цефуроксима на цефуроксим аксетил несколько снижался, но превышал минимально подавляющие концентрации для основных возбудителей.

Высокая эффективность цефуроксим аксети-ла отмечена у детей и взрослых с острым средним отитом, а также при стрептококковом тонзиллите, фарингите и синусите. Цефуроксим аксетил может назначаться при стафилококковых инфекциях кожи и мягких тканей (мастит, фурункулы), а также при внебольничных инфекциях мочевыво-дящих путей, главным образом пиелонефрите [5].

Замена карбоксильной группы в цефуроксиме эфирным радикалом (цефуроксим аксетил) придает устойчивость данному соединению в желудочном соке. Известно, что цефуроксим аксетил разлагается в кишечнике до цефуроксима [2]; рН в кишечнике 5,8-6,5 [6].

В настоящее время для определения цефуроксима используются спектроскопические, хро-матографические, электрохимические методы [7]. Многие из этих методов требуют дорогостоящего оборудования, реактивов, высококвалифицированных операторов, отличаются длительностью и не применимы для экспресс-контроля за содержанием антибиотиков в клинических и биохимических лабораториях.

Для экспрессного определения цефуроксима и цефуроксим аксетила в водных средах и ротовой жидкости (ЖРП) нами разработаны потенцио-метрические сенсоры на основе органических ионообменников антибиотиков с катионами те-траалкиламмония.

© Кулапина О. И., Михайлова М. С., Кулапина Е. Г., 2013

Экспериментальная часть ООО «АБОЛмед», г. Новосибирск) и цефу-

В работе использовались цефуроксим в роксим аксетил (фирма производитель Glaxo

виде натриевой соли - порошок для инъекци- Operation UK Limited, UK) фармакопейной чис-

онных растворов - цефурабол (производитель тоты:

O = C—NH

C

N

OCH

CH

/1

-O-C^

O

C

NH

3

OH

Цефуроксим (Cefurl)

O = C—NH

C

N

OCH

CH —O

O

O

O-CH-O

CH3

Цефуроксим аксетил (Cefur2)

NH

C—CH

O

Цефуроксим - антибиотик кислотного типа, полностью диссоциирует при рН = 5 и выше. В водных растворах (рН~6,0), крови человека (рН~7), жидкости ротовой полости (рН ~ 6,8-7,4) антибиотики присутствуют в виде однозарядных ионов [8].

Исходные 110-1 М водные растворы антибиотиков готовили по точным навескам пре-

паратов в дистиллированной воде; учитывалось содержание основного вещества для цефуроксим аксетила. Рабочие растворы (свежеприготовленные) концентраций 110-2 - 110-6 М получали последовательным разбавлением исходных.

В качестве электродноактивных веществ (ЭАВ) применяли ионные ассоциаты цефуроксима с катионами тетраалкиламмония:

Диметилдистеариламмония хлорид

Тетрадециламмония бромид

Образование ионных ассоциатов цефуроксима с катионами тетраалкиламмония происходит по карбоксильной группе исследуемых лекарственных веществ:

[(С10Ы21)4К]+ + СеШг (С10Ы21)4К+СеГиг-.

ДМДСА

n^^ CHq

17 \ V 3 CH,

/

17 35

Cl

ТДА

C10H21 . C10H21 X

P tt / C H

10 21 Mo1^

Br

В делительную воронку помещали раствор ТДА или ДМДСА в хлороформе (С=110-2 М) и водные растворы антибиотика (С=1,5 10-2 М) при соотношении объемов растворов антибиотик: соль тетраалкиламмония = 1:2. Смесь встряхивали в

Химия

41

течение двух часов, хлороформный слой отделяли от водной фазы в предварительно взвешенный бюкс, и испаряли хлороформ на водяной бане при температуре 50-60 °С с целью избежания разложения электродно-активных веществ.

В качестве инертной матрицы для изготовления мембран использовали поливинилхлорид (ПВХ) марки С-70, «ч.д.а», растворитель-пластификатор - дибутилфталат (ДБФ).

Для приготовления пластифицированных мембран навески электродно-активных веществ растворяли в дибутилфталате при непрерывном перемешивании, затем добавляли циклогексанон и поливинилхлорид, смесь тщательно перемешивали до полной гомогенизации. После чего смесь выливали в чашку Петри и оставляли на воздухе до полного удаления циклогексанона. Получали эластичные и прозрачные мембраны толщиной порядка 0,5 мм. Соотношение поливинилхлорид: дибутилфталат = 1:3; СЭАВ варьировали в интервале 2,75-5,35%.

Исследовали жидкоконтактные электроды с пластифицированными мембранами собственного изготовления. К тщательно отшлифованному торцу поливинилхлоридной трубки приклеивали мембранные диски, диаметр которых соответствовал диаметру трубки. Клей получали растворением 0,5 г поливинилхлорида и 0,25 г дибутилфталата в 5 мл циклогексанона. В качестве внутренних растворов сенсоров применяли смесь хлорида натрия 1-10"1 М и антибиотика 110"3 М в соотношении по объему 1:1. ЭДС цепи измеряли на иономере универсальном И-160 (погрешность измерения ±1 мВ), электрод сравнения - хлорид-серебряный.

Контроль рН растворов проводили на иономере рХ-150 М со стеклянным и хлоридсеребряным электродами. Коэффициенты потенциометриче-ской селективности (Ксел) сенсоров определяли методом биионных потенциалов и смешанных растворов [9].

Для спектрофотометрического исследования состояния антибиотиков в водных и биологических средах готовили исходные растворы (1 мг/мл), из которых получали растворы 100 мкг/мл. Спектры поглощения снимали для водных растворов и на фоне ротовой жидкости при концентрациях цефуроксима и цефуроксим аксетила 1-50 мкг/мл.

Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-1800, совмещенным с IBM PC; использовались кюветы из кварцевого стекла 1=1 см.

Для спектрофотометрического исследования поведения антибиотиков в ротовой жидкости пробы ЖРП центрифугировали 10-20 мин при

3500 об/мин, затем проводили осаждение белков сульфатом цинка в среде гидроксида натрия, снова центрифугировали 10-20 мин при 3500 об/мин. В подготовленные пробы ротовой жидкости вносили различные добавки антибиотиков; снимали их спектры поглощения относительно ЖРП без антибиотиков.

Исследования проводили для групп практически здоровых лиц (п = 10, средний возраст 20±2 года) и больных с инфекцией верхних дыхательных путей, принимающих цефуроксим аксетил (препарат «Зиннат») 250 мг 2 раза в сутки.

Результаты и их обсуждение

Спектрофотометрически были исследованы водные растворы антибиотиков. Спектры поглощения цефуроксима и цефуроксим аксетила идентичны (^шах=281 нм), молярные коэффициенты светопоглощения (ем) составляют 1,76 •Ю4 и 1,55• 104 соответственно. Кислотность свежеприготовленных водных растворов антибиотиков с изменением их концентрации не меняется. Молярные коэффициенты светопоглощения це-фуроксима и цефуроксим аксетила в ротовой жидкости равны и составляют 1,25 • 104 (^шах = 275 нм) (рис. 1).

Известно [10], что Хшах и ем характеризуют природу вещества (длину связи, подвижность п-электронов и вероятность их перехода в возбужденное состояние). Чем больше длина п-системы и выше вероятность, тем больше ем. Величина ем исследуемых нами антибиотиков (п^104) показывает, что их спектры поглощения обусловлены п ^ п* переходами в заместителе Р-лактамного кольца как цефуроксима, так и цефуроксим аксе-тила. Возможные п ^ п* и п ^ п* электронные переходы остальных фрагментов молекул антибиотиков, по-видимому, находятся в той же области длин волн и включены в спектры заместителя Р-лактамного кольца, поскольку интенсивности их поглощения в 10-100 раз меньше.

Диапазон линейной зависимости оптической плотности от концентрации антибиотиков составляет 1-50 мкг/мл как в водных средах, так и в ротовой жидкости (при осаждении белков).

Рассмотрим основные электрохимические характеристики исследуемых в настоящей работе сенсоров. Зависимости ЭДС от концентрации антибиотиков идентичны и выполняются в интервале концентраций 110-4 (8 10-5) - 110-2 М для различных ЭАВ; угловые коэффициенты электродных функций составляют 52-56 мВ/рС. Для сенсоров на основе СеГиг-ДМДСА характерен более широкий интервал линейности, угловой коэффициент практически приближен к теоретическому значению.

1,4

240

260

280 б

300

320

1, нм

Рис. 1. Спектры поглощения свежеприготовленных водных растворов цефуроксим аксетила (а) и на фоне ротовой жидкости (б) при различных концентрациях, мкг/мл: а - 42,4 (1); 33,9 (2); 27,1 (3); 16,9 (4); 10(5); б - 10,2 (1); 17 (2); 42,4 (3)

Исследовано влияние содержания электро-дно-активных веществ (2,75-5,35%) на электрохимические характеристики сенсоров. Результаты показали, что во всех случаях электродные функции выполняются в интервале концентраций антибиотиков 110-4 (5 10-5) - 110-2 М; угловые коэффициенты составляют 52-56 мВ/рС; предел обнаружения - п 10-5 (10-6) М.

Потенциалопределяющей является реакция ионного обмена на границе мембрана/раствор, с предварительно происходящей диссоциацией ионообменников в фазе мембраны:

СеШг- • ТАА+ ^ СеГиг- + ТАА+.

Затем происходят ионообменные реакции анионов антибиотиков на границе раздела мембрана-раствор:

СеГиг-м ^ СеГиг-р ,

м р '

Е = Ео - 0,059 • 1ЕССеГиг .

По зависимости Е=Г(-1§ССегиг) определены пределы обнаружения антибиотиков (5 10-5 М).

Дрейф потенциала составил 2-4 мВ/сут. Как правило, дрейф потенциала сенсоров обусловлен изменением в структуре поверхности

мембраны и растворением ионообменника в исследуемом растворе. Электроды на основе различных ЭАВ обладают стабильными электрохимическими и операционными характеристиками в течение 3 месяцев.

Коэффициенты потенциометрической селективности сенсоров к другим цефалоспориновым антибиотикам - цефазолину (Cef), цефалексину (Cefl), цефриаксону (Ceftr) определяли методом биионных потенциалов, к неорганическим ионам

- методом смешанных растворов (рис. 2, таблица). Выбор мешающих неорганических ионов обусловлен составом ротовой жидкости.

Полученные коэффициенты потенциометрической селективности свидетельствуют о возможности определения индивидуальных цефа-лоспориновых антибиотиков или их суммарного содержания в присутствии значительных избытков неорганических ионов, что делает возможным применение сенсоров в анализе биологических сред.

E

250

200

150

100

50

—I

0

pC

E

150

100

50

-50

-100

-150

б

Рис. 2. Зависимость электродных потенциалов сенсоров в растворах некоторых цефалоспоринов от их концентрации: цефуроксим аксетил (1), цефазолин (2), цефтриаксон (5), цефалексин (4). ЭАВ: Се&г-ТДА (а), Се&г-ДМДСА (б)

а

Коэффициенты потенциометрической селективности цефуроксим аксетила к ряду мешающих ионов (п = 3, р = 0.95)

ЭАВ Мешающий ион Ксел

СГ (6,61±0,25)-10-2

Вг- (8,91±0,10)10-2

нсо3- (6,31±0,15)10-2

Н2РО4- (7,94±0,21)-10-2

СеШг-ДМДСА (6,31±0,20)-10-2

НРО42-

г (8,32±0,15)-10-2

СеГ (1,78±0,10)10-1

СеА (6,63±0,20)-10-1

Се&г-ТБА СеГ СеА (4,31±0,21)-10-1 5,38±0,15

Электроаналитические характеристики сенсоров на фоне ротовой жидкости

В качестве объекта исследования нами была выбрана ротовая жидкость. Из литературных данных известно, что в каждый данный момент времени плазма крови превращается в некоторое количество ЖРП, поэтому можно считать, что концентрация лекарственного препарата в ЖРП соответствует концентрации его в плазме крови [11-13].

Установлено уменьшение интервала линейности и углового коэффициента электродной функции в ЖРП вследствие высокой ионной силы раствора и «белкового отравления» поверхности мембран. Интервал линейности электродной функции составляет 1 • 10-3 - 5 • 10-5 М, предел обнаружения цефуроксима и цефуроксим аксетила 5 10-5 М. Полученные градуировочные характеристики являются воспроизводимыми и увеличение времени кондиционирования не влияет на них. Для ионометрических определений антибиотиков нет необходимости проводить осаждение белков.

Методика ионометрического определения цефуроксима и цефуроксим аксетила в ротовой жидкости

• Пробоподготовка ЖРП. Отбор проб смешанной слюны осуществляли путем сплевывания ротовой жидкости в чистые сухие полиэтиленовые пробирки. Пробу отбирали спустя 1-2 ч после приема пищи, перед сбором ротовую полость ополаскивали водой. Пробу ЖРП центрифугировали в течение 15 мин при 3500 об/мин. Перед измерениями индикаторный электрод кондиционировали в ЖРП практически здорового человека в течение 20-30 мин.

• Для приготовления 10-1 М растворов цефуроксима и цефуроксим аксетила соответствующие навески антибиотиков растворяли в дистиллированной воде в мерной колбе на 25 мл. Последовательным разбавлением готовили растворы 1 • 10-2, 110-3, 5-10-4, 110-4 М.

• Для приготовления серии растворов цефуроксима и цефуроксим аксетила на фоне ЖРП с внесенными добавками антибиотиков, отбирали

0.3.мл водных растворов антибиотиков соответствующей концентрации (внесенные добавки) и до 3 мл добавляли надосадочной жидкости ЖРП, перемешивали и проводили измерения ЭДС. Строили зависимость ЭДС, мВ - -1§ СсеГиг. Измеряли ЭДС в пробах ротовой жидкости больных и по градуировочному графику определяли содержание цефуроксима и цефуроксим аксетила. Для исследуемой группы больных показано, что максимальное содержание цефуроксим аксетила составляет 77 мкг/3 мл при индивидуальных колебаниях от 30 до 60 мкг/3 мл ротовой жидкости.

С учетом сложности анализируемых объектов и самого определяемого вещества достоверность полученных результатов оценивалась следующим образом. В пробы ЖРП здорового человека вводили определенные добавки стандартных растворов цефуроксима и цефуроксим аксетила, далее пробы проводили через все операции пробоподготовки, измеряли величины ЭДС и по градуировочному графику определяли содержание антибиотиков. Погрешность определения не превышала 10%.

Таким образом, разработанные сенсоры позволяют проводить определение цефуроксима и цефуроксим аксетила в водных и биологических средах и могут быть использованы для определения основного вещества в лекарственных препаратах и контроля за содержанием антибиотиков в ротовой жидкости для корректировки и оптимизации курса лечения.

Список литературы

1. Яковлев В. П., Яковлев С. В. Антибактериальные препараты : современное состояние и перспективы // Антибиотики и химиотерапия. 2001. Т. 46, № 11. С. 19-22.

2. МашковскийМ. Д. Лекарственные средства. М. : Нов. волна, 2006. 1206 с.

3. Сорокина Е. В. Рациональное использование антибиотиков на основе их фармакокинетики при пневмонии у детей раннего возраста // Пульмонология. 2002. № 1. С. 42-47.

4. Яковлев С. В., Суворова М. П., Дворецкий Л. И., Власенко Н. А., Шахова Т. В. Ступенчатая терапия внебольничной пневмонии. Результаты исследования цефуроксима и цефуроксим аксетила // Антибиотики и химиотерапия. 1998. № 6. С. 7-11.