CC BY
242
УДК 577.15:616.379-008.64
Интенсивность свободнорадикальных процессов в печени крыс при сахарном диабете 2 типа и введении эпифамина
Т. Н. Попова, А. А. Агарков, А. Н. Веревкин*
Воронежский государственный университет, 394006, Воронеж, Университетская пл., 1 *E-mail: wer.all@mail.ru Поступила в редакцию 25.04.2013
РЕФЕРАТ Проведено исследование влияния эпифамина на интенсивность свободнорадикальных процессов, активности каспаз-1 и -3, аконитатгидратазы и на содержание цитрата в печени крыс при экспериментально индуцированном сахарном диабете 2 типа (СД2). Установлено, что под действием эпифамина при СД2 происходит изменение параметров биохемилюминесценции, соответствующее снижению интенсивности свободнорадикальных процессов, а также изменение активности аконитазы и содержания цитрата в сторону значений, характерных для контрольных животных. Активности каспазы-1 и каспазы-3 в печени крыс с СД2, которым вводили эпифамин, были соответственно в 2.4 и 1.6 раза ниже, чем в отсутствие эпифамина. По-видимому, эпифамин-опосредованная коррекция свободнорадикального гомеостаза при СД2 связана с регуляцией уровня мелатонина - гормона, обладающего выраженной антиоксидантной активностью. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА сахарный диабет 2 типа, биохемилюминесценция, аконитатгидратаза, цитрат, каспаза, эпифамин.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ - аконитатгидратаза; АФК - активные формы кислорода; БХЛ - биохемилюми-несценция; СД2 - сахарный диабет 2 типа.
ВВЕДЕНИЕ
Сахарный диабет является одним из социально значимых заболеваний и остается актуальной проблемой как для медицинской науки, так и для здравоохранения. Среди всех случаев данной патологии более 90% приходится на СД2.
В патогенезе осложнений СД2 существенная роль принадлежит свободнорадикальному окислению биомолекул. Скорость образования свободных радикалов при СД2 зависит от скорости гликозилирования белков, а следовательно, и от степени гипергликемии [1]. Одной из причин усиления свободнорадикальных процессов при СД2 может являться активация по-лиолового шунта, функционирование которого связано с превращением глюкозы в сорбитол с участием альдозоредуктазы. В условиях гипергликемии свободные радикалы также образуются в процессе аутоокисления глюкозы при формировании конечных продуктов гликозилирования, которые, в свою очередь, участвуют в патогенезе ангиопатий, способствуют нарастанию ишемии и интенсификации свободнорадикальных процессов в тканях при СД2 [1]. Усиление гликозилирования гемоглобина приводит к вторичной тканевой гипоксии [2].
Нарушение окислительно-восстановительного гомеостаза при СД2 может являться причиной акти-
вации процессов запрограммированной клеточной гибели - апоптоза, характеризующегося активацией каскада внутриклеточных цистеиновых протеаз, известных как каспазы. Каспазы - семейство эво-люционно консервативных протеаз, специфически расщепляющих белки после остатков аспарагиновой кислоты [3]. В частности, с участием каспазы-3 подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственной за фрагментацию ДНК (CAD). Каспазы вызывают также гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану, что ведет к конденсации хроматина. Они участвуют в разрушении белков, поддерживающих структурно-функциональное состояние цитоскелета, а также в инактивации и нарушении регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК и репликации ДНК. При этом ключевой каспазой является каспаза-3 (cpp32), и оценка активности каспазы-3 - один из основных методов определения уровня апоптоза в ткани [4]. Кроме того, важной характеристикой процесса апоп-тоза является активность каспазы-1 (ICE), относящейся к группе каспаз-активаторов цитокинов.
Известно, что одна из чувствительных мишеней действия свободных радикалов - это аконитатгидра-таза (АГ), выполняющая основную роль в регуляции накопления цитрата [5]. Показано, что в условиях
активации свободнорадикального окисления регуляция активности АГ претерпевает существенные изменения, происходит угнетение активности фермента и накопление цитрата, являющегося низкомолекулярным антиоксидантом вследствие хела-тирующих свойств по отношению к ионам Fe2+ [6]. Ионы Fe2+, как известно, обладают прооксидантной активностью, так как, участвуя в реакциях Фентона и Хабера-Вайса, приводят к образованию одной из наиболее агрессивных и опасных активных форм кислорода (АФК) - гидроксильного радикала [7].
Актуальным является применение препаратов, способных снижать интенсивность свободнорадикальных процессов в организме. Препарат эпифамин - пептидный биорегулятор, тропный к эпиталамо-эпифизарной области. Он относится к классу цитомединов. Эти пептиды не только оказывают положительное действие на иммунную систему, нормализуют жировой и углеводный обмен, но также способны осуществлять коррекцию уровня эндогенного мелатонина [8, 9]. Один из основных биохимических механизмов действия мелатонина на клетки - антиоксидантный. Мелатонин является активным донором электронов, а также эффективным перехватчиком радикалов: ОН', ООН, O"2-, синглет-ного кислорода, ПО', ОПОО" [10]. В отличие от большинства других внутриклеточных антиоксидантов, локализующихся преимущественно в определенных клеточных структурах, присутствие мелатонина и, следовательно, его антиоксидантная активность определены во всех клеточных структурах, включая ядро [11]. Этот факт свидетельствует об универсальности антиоксидантного действия мелатонина, а также выраженных протективных свойствах, обеспечивающих защиту от свободнорадикального повреждения ДНК, белков и липидов.
В данной работе проведено исследование влияния эпифамина на интенсивность свободнорадикальных процессов, активности каспаз-1 и -3, аконитатгидра-тазы и на содержание цитрата в печени крыс с экспериментальным СД2.
экспериментальная часть
В качестве объекта исследования использовали белых крыс-самцов (Rattus rattus L.) массой 150-200 г. Все экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с правилами гуманного обращения с лабораторными животными и в соответствии с санитарными правилами для вивария. СД2 индуцировали внутримышечным введением протамина сульфата в течение 3 недель в дозе 10 мг/кг массы тела животного в объеме 0.5 мл 0.9% NaCl 3 раза в сутки [12].
В ходе эксперимента животные были разделены на три группы: группу 1 (n = 8) составляли контроль-
ные животные; группу 2 (n = 8) - животные с СД2; в группе 3 (n = 8) животным с СД2 внутрибрюшинно вводили эпифамин в виде раствора в 1 мл 0.9% раствора NaCl трижды в день в дозе 2.5 мг/кг на 15, 17 и 19 день эксперимента. Через 3 недели после начала индуцирования СД2 наркотизированных животных всех экспериментальных групп умерщвляли и использовали для дальнейших исследований. Для извлечения печени крысам под наркозом производили лапаротомию, затем под портальную вену подводили лигатуру, надсекали и канюлировали ее на 10 мм ниже синуса, переднюю полую вену пересекали в диафрагмальной области и перфузировали печень ледяным изотоническим раствором со скоростью 5 мл/мин в течение 5 мин. Навеску ткани гомогенизировали путем растирания ткани в фарфоровой ступке с кварцевым песком в 4-кратном объеме охлажденной среды выделения. Среда имела следующий состав: 0.1 М Трис-НС1-буфер (рН 7.8), содержащий 1 мМ EDTA и 1% Р-меркаптоэтанол. Гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 12 мин. Супернатант использовали для исследования.
Содержание глюкозы в сыворотке крови крыс определяли глюкозооксидазным методом с помощью набора реактивов «ГЛЮКОЗА-12-ВИТАЛ» (производитель ООО «Витал-Диагностикс», СПб., Россия). Пробы крови брали из хвостовой вены на 15, 17 и 19 день эксперимента [13]. Сыворотку получали кратковременным центрифугированием.
Для определения интенсивности свободнорадикальных процессов применяли метод индуцированной биохемилюминесценции (БХЛ) [14]. Кинетическую кривую БХЛ регистрировали на биохемилюминоме-тре БХЛ-07 с программным обеспечением в течение 30 с и определяли следующие параметры: свето-сумму хемилюминесценции (S), соответствующую площади под кривой хемилюминесценции; интенсивность максимальной вспышки (I ) - максимальное
v max'
значение на кривой биохемилюминесценции, характеризующие интенсивность свободнорадикальных процессов, а также величину тангенса угла наклона касательной к кривой хода БХЛ (tga2), характеризующую общую антиоксидантную активность.
Среда для определения интенсивности БХЛ имела следующий состав: 0.4 мл 0.02 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.5), 0.4 мл 0.01 мМ FeSO4 и 0.2 мл 2% раствора пероксида водорода (вносимого непосредственно перед измерением). Исследуемый материал вносили в количестве 0.1 мл непосредственно перед измерением до внесения пероксида водорода.
Определение активности каспаз-1 и -3 проводили с помощью набора реактивов Caspase 1 Assay Kit, Colorimetric и Caspase 3 Assay Kit, Colorimetric соответственно (Sigmа) на спектрофотометре Hitachi
л
Группа животных
Группа животных
Группа животных
Рис. 1. Параметры биохемилюминесценции: светосумма медленной вспышки (5) (А), интенсивность максимальной вспышки (/ ) (Б), тангенс угла наклона касательной к кинетической кривой хода биохемилюминесценции
(+да2) (б) в печени крыс контрольной группы (1), животных с сахарным диабетом 2 типа, СД2 (2) и при введении эпифамина животным с СД2 (3). Различия статистически достоверны при р < 0.05: * - по сравнению с контрольной группой, ** - по сравнению с группой с СД2
Б
В
и1900 с программным обеспечением. Колориметрический анализ активности каспаз основан на гидролизе пептидного субстрата ацетил-Туг^а1-А1а-А$р-п-нитроанилида (Ac-YVAD-pNA) (в случае каспа-зы-1) и ацетил-А$р^1и^а1-А$р-п-нитроанилида (Ac-DEVD-pNA) (в случае каспазы-3) с образованием п-нитроанилина, имеющего максимум поглощения при 405 нм (молярный коэффициент поглощения = 10.5). Активность каспаз выражали в пикомолях продукта, образующегося в 1 мин, в расчете на 1 мг белка.
Активность АГ определяли на спектрофотометре ННасЫ и1900 при длине волны 233 нм. О скорости дегидратации цитрата в ходе АГ-реакции судили по возрастанию оптической плотности в результате образования двойной связи в молекуле цис-аконитата. Определение активности АГ проводили в 50 мМ Трис-НС1-буфере, pH 7.8, содержащем
0.15 мМ цитрат. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль продукта реакции за 1 мин при температуре 25°С.
Количество цитрата определяли по методу Нательсона [15]. В основе метода лежит реакция бромирования цитрата в присутствии перманганата калия с образованием пентабромацетона, который образует окрашенный комплекс с тиомочеви-ной. Интенсивность окраски этого соединения измеряли спектрофотометрически при длине волны 430 нм на спектрофотометре ННасЫ Ш900. Расчет производили по калибровочной кривой.
Общий белок определяли биуретовым методом. Статистическую достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Статистически достоверными считали различия при р < 0.05.
результаты и обсуждение
Установлено, что введение протамина сульфата экспериментальным животным приводило к увеличению содержания глюкозы в сыворотке крови. Использование эпифамина в качестве протектора способствовало снижению уровня гипергликемии у крыс с экспериментально индуцированным СД2: на 19 сут после начала эксперимента содержание глюкозы в крови у животных с СД2, получавших эпифамин, было в 1.8 раза ниже, чем у больных животных, не получавших эпифамин (таблица). Это может быть связано со способностью эпифамина увеличивать уровень мелатонина в организме. Как известно, мелатонин способен стимулировать транспорт глюкозы в скелетные мышцы, активируя IRS-1/PI-3-киназный путь, в результате чего снижается содержание глюкозы в крови [16].
Согласно полученным данным, значения светосум-мы БХЛ (S) и интенсивности максимальной вспышки БХЛ (I ) в печени крыс с СД2 в 2.6 и 2.1 раза превышали соответствующие показатели у контрольных животных (рис. 1А, Б), что свидетельствует о возрастании интенсивности свободнорадикального окисления. Согласно данным литературы, при СД2 имеет место активация полиолового пути, в котором глюкоза превращается в сорбитол с участием альдозо-
Концентрация глюкозы в сыворотке крови крыс экспериментальных групп животных на 15, 17 и 19 день эксперимента
Группа животных Концентрация глюкозы, мМ
15 день 17 день 19 день
1 (контроль) 5.00 ± 0.24 5.26 ± 0.23 5.5 ± 0.26
2 9.02 ± 0.41 9.72 ± 0.43 13.74 ± 0.64
3 8.18 ± 0.38 7.92 ± 0.36 7.71 ± 0.34
редуктазы. Под действием сорбитолдегидрогеназы сорбитол превращается во фруктозу, что сопровождается увеличением соотношения NADН/NAD+, как и при развитии тканевой гипоксии. Данное состояние получило название «редуктивный стресс», или «гипергликемическая псевдогипоксия» [2]. Следствием данного состояния может быть изменение степени восстановленности компонентов электрон-транспортной цепи, приводящее к повышению вероятности образования АФК.
В печени животных с СД2 выявлено также увеличение в 2.1 раза по сравнению с контрольными животными значения tga2 - параметра БХЛ, характеризующего общую антиоксидантную активность (рис. 1В). Введение эпифамина крысам с СД2 приводило к снижению значений S и I в печени в 1.9
max
и 1.7 раза соответственно (рис. 1А,Б). Регистрируемое снижение уровня свободнорадикального окисления может быть результатом проявления антиоксидант-ных свойств мелатонина, уровень которого способен регулировать эпифамин. Согласно литературным данным, мелатонин может взаимодействовать с рядом активных кислородных метаболитов, в частно-
сти, нейтрализовать гидроксильный радикал - одну из самых реакционноспособных АФК [10, 17].
Кроме того, у животных с СД2, получавших эпифамин, значения tga2 были в 1.5 раза ниже, чем у больных животных, не получавших эпифамин. Это, очевидно, связано с уменьшением степени мобилизации антиоксидантной системы вследствие торможения свободнорадикальных процессов.
Установлено, что в печени животных с экспериментальным СД2 происходит увеличение удельной активности каспазы-1 в 6.0 раза, каспазы-3 - в 2.7 раза (рис. 2). Это свидетельствует об усилении апоп-тотических процессов в клетках печени. Повышение активности каспазы-3 в печени крыс также отмечено при действии четыреххлористого углерода [18].
При введении эпифамина животным с СД2 наблюдалось уменьшение активности каспазы-1 в печени в 2.4 раза, каспазы-3 - в 1.6 раза по сравнению с соответствующими значениями у животных с СД2, не получавших эпифамин (рис. 2).
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о снижении уровня апоптотических процессов в печени крыс с СД2 при действии эпифамина,
А
га 2 ^ фЮ
I S
е I
0 -х
1 < I о. < £
□
60
50
40
30
20
10
2
Группа животных
35
30
25
20
15
10
5
0
2 3
Группа животных
Рис. 2. Активность каспазы-1 (А) и ка-спазы-3 (Б) в печени крыс контрольной группы (1), животных с сахарным диабетом 2 типа, СД2 (2) и при введении эпифа-мина животным с СД2 (3). Различия статистически достоверны при р < 0.05:
* - по сравнению с контрольной группой, ** - по сравнению с группой с СД2
Б
0
3
га
О.
н
х
3
о;
X
3
га
О.
н
I
Ш
3
I
О
1.5
1.6 1.4 1.2 1.0 0.S 0.6 0.4 0.2
0
А
2
Группа животных
Рис. 3. Содержание цитрата в печени крыс контрольной группы (1), животных с сахарным диабетом 2 типа, СД2 (2) и при введении эпифамина животным с СД2 (3). Различия статистически достоверны при р < 0.05:
* - по сравнению с контрольной группой, ** - по сравнению с группой с СД2
что, возможно, связано со снижением скорости свободнорадикальных процессов при введении эпифа-мина.
Результаты проведенных исследований показали, что при СД2 в печени крыс происходит увеличение содержания цитрата в 2.3 раза (рис. 3) по сравнению с контрольными значениями. Также наблюдалось снижение удельной активности аконитазы в печени животных с СД2 в 1.9 раза и активности, выраженной в виде Е/г сырой массы, в 1.5 раза относительно контроля (рис. 4). Известно, что активность АГ может служить маркером окислительного стресса, так как под действием АФК фермент теряет активность вследствие окислительной модификации активного центра и высвобождения атома железа из железосерного кластера [5]. Полученные данные об изменении активности АГ и уровня цитрата при СД2 согласуются с результатами измерения параметров БХЛ, подтверждающими, что в условиях развития СД2 наблюдается интенсификация свободнорадикального окисления.
Введение эпифамина крысам с СД2 приводило к снижению уровня цитрата в печени в 1.9 раза (рис. 3) и увеличению в 1.6 раза удельной активности АГ (рис. 4А) по сравнению с соответствующими показателями у животных с СД2, не получавших эпифа-мин. Активность АГ, выраженная в Е/г сырой массы печени, также увеличилась в 1.4 раза по сравнению со
1 2
Группа животных
га
т
н
е м р е ф П О
с
о
н
в
и
т
к
А
2.5
1.5
0.5
1 2 3
Группа животных
Рис. 4. Активность аконитатгидратазы, выраженная в Е/мг белка (А) и в Е/г сырой массы (Б), в печени крыс контрольной группы (1), животных с сахарным диабетом 2 типа, СД2 (2) и при введении эпифамина животным с СД2 (3). Различия статистически достоверны при р < 0.05: * - по сравнению с контрольной группой, ** - по сравнению с группой с СД2
второй экспериментальной группой (рис. 4Б). Изменение исследуемых параметров в сторону контрольных значений при введении эпифамина животным с СД2, очевидно, свидетельствует о снижении уровня окислительного стресса, что ведет к реконструкции активного центра АГ и утилизации цитрата в катализируемой АГ реакции.
заключение
Полученные данные указывают на способность эпи-фамина оказывать позитивное регулирующее воздействие на свободнорадикальный гомеостаз путем снижения степени выраженности окислительного
З
З
Б
2
0
стресса при экспериментальном СД2 у крыс. Об этом свидетельствует изменение в сторону нормы показателей БХЛ - I и £, характеризующих интенсивность свободнорадикальных процессов, значений tga2, отражающих общую антиоксидантную актив-
ность; активностей каспазы-1 и каспазы-3, свидетельствующих о скорости апоптотических процессов, а также активности АГ и уровня цитрата в печени крыс с СД2. •
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. // Проблемы эндокринологии. 2000. № 6. С. 29-34.
2. Baynes J.W., Thorpe J.W. // Diabetes. 1999. V. 48. Р. 1-9.
3. Куцый М.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И. // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 149-163.
4. Woo M., Hakem R., Soengas M.S., Duncan G.S., Shahinian A., Kagi D., Hakem A., McCurrach M., Khoo W., Kaufman S.A., et al. // Genes Dev. 1998. V. 12. P 806-819.
5. Gardner PR., Nguyen D.M., White C.W. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 25. P. 12248-12252.
6. Cadet E., Gadenne M., Capron D., Rochette J. // Rev. Med. Interne. 2005. V. 26. P. 315-324.
7. Кухтина Е.Н., Глущенко Н.Н. // Биохимия. 1996. Т. 61. № 6. С. 993-997.
8. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Южаков В.В., Попучиев В.В., Коновалов С.С. Пептидергическая регуляция гомеостаза. СПб.: Наука, 2003. 194 с.
9. Anisimov V.N., Khavinson V.Kh. // Aging interventions and therapies / Ed. Suresh I.S. Rattan. Singapore: World Scientific, 2005. P. 127-146.
10. Reiter R.J., Tan D.X., Osuna C., Gitto E. // J. Biomed. Sci. 2000. V. 7. № 6. P. 444-458.
11. Reiter R.J., Acuna-Castroviejo D., Tan D.X., Burkhardt S. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001. V. 939. P 200-215.
12. Ульянов А.М., Тарасов Ю.А. // Вопросы мед. химии. 2000. Т. 46. № 2. С. 149-154.
13. Богомолов А.Ф., Лукьянов И.Ю., Горбачева Л.Р Методические рекомендации по курсу экспериментальной физиологии для студентов биологического отделения биологохимического факультета. Иваново: Ивановский гос. ун-т, 2005. 43 с.
14. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. // Биохимия и биофизика микроорганизмов: Межвузовский сб. Горький, 1983. С. 179-183.
15. Афанасьев В.Г., Зайцев В.С., Вольфсон Т.И. // Лаб. дело. 1973. № 4. С. 115-116.
16. Ha E., Yim S.V., Chung J.H., Yoon K.S., Kang I., Cho Y.H.,
Baik H.H. // J. Pineal Res. 2006. V. 41. № 1. P. 67-72.
17. Peschke E. // J. Pineal Res. 2008. V. 44. № 1. P. 26-40.
18. Лемза С.В., Ажунова Т.А., Мондодоев А.Г., Николаев С.М., Разуваева Я.Г., Занданов А.О. // Бюл. ВСнЦ СО РАМН. 2010. Т. 72. № 2. C. 181-184.
