CC BY
148
о §
8.
а
I
1 «
с
§
I
с
§
к
<8
8.
I !?
Л
8.
Й Л
ж
¡5
а,
£
ИНТЕНСИВНОСТЬ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ БЕРИДОНА И БЕРЕНИЛА В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ
Н.А.Костромитинов, Е.А.Суменкова
ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, г. Москва
Хемилюминесценция - свечение, возникающее при физико-химических процессах, связанных с поглощением энергии, переходом вещества в возбужденное состояние и последующим возвращением в основное состояние с излучением кванта энергии в ультрафиолетовой, видимой, инфракрасной областях. Такое свечение продолжается от миллисекунд до нескольких часов. Люминесцентные методы исследования в настоящее время широко используются для изучения физических, химических, биохимических и биологических процессов. «Биохемилюми-несценция» - это излучение света растениями, живыми организмами, органами, тканями, клетками, субклеточными структурами, биологическими жидкостями и т.д.
Самая простая химическая реакция, сопровождающаяся излучением кванта света - это разложение перекиси водорода. Оно может происходить спонтанно, например, в слабо щелочной среде, при нагревании раствора, под действием ультрафиолетового облучения или каталитически - в присутствии металлов переменной валентности, в частности, солей железа. В последнем случае процесс разложения перекиси водорода представляет собой цепную реакцию, протекающую с образованием свободных радикалов кислорода.
Свободные радикалы обладают собственным магнитным моментом, высокой химической активностью, способностью инициировать цепные реакции окисления и сравнительно малым временем жизни, что затрудняет их обнаружение.
Исследование сверхслабого свечения биологического материала: клеток, внутриклеточных структур, органов, тканей, крови и т.д. в практике имеет информационное и диагностическое значение.
Хемилюминесценция в определенной степени тесно связана со свободно-радикальным окислением липидов.
Доказательством этого служит прямо пропорциональная корреляционная зависимость между интенсивностью свечения, потреблением кислорода и накоплением продуктов перекисного окисления липидов, в частности, диеновых конъюгатов, малонового диальдегида.
Переход свечения из одной фазы в другую зависит от стадий окисления. Люминесцентное свечение начинается с медленной вспышки, которая совпадает с моментом, когда в среде инкубации начинают накапливаться гидроперекиси липидов. Затем появляются активные формы кислорода, это обычно происходит через 1-2 минуты после воздействия чужеродного материала на мембраны фагоцитов. Свечение достигает своего максимума за 5-6 минут и длится в течение 20-30 минут. Этот процесс сопровождается свечением, интенсивность которого резко увеличивается в присутствии люминола.
Выравнивание скорости образования и распада гидроперекисей становится причиной перехода медленной вспышки в стационарное свечение. Она характеризуется латентным периодом, крутизной нарастания и временем достижения максимума свечения, величиной максимальной интенсивности и светосуммой хемилюминесценции, которую измеряют в течение условленного времени. Перечисленные показатели зависят от количества фагоцитирующих клеток, их активности, характера чужеродного материала, механизма его взаимодействия с фагоцитом, наличия в среде инкубации опсонизирующего фактора, состава среды, ее температуры и т.д. Установлено, что величина пика хемилюминесценции зависит от фагоцитарной активности клеток. Оп-сонизирующая способность крови определяется временем достижения максимума хемилюминесценции и ее амплитудой. Светосумма свечения за время измерения является интегральным показателем генерации активных форм кислорода, а крутизна нарастания свечения отражает скорость активации кислородзависимого метаболизма фагоцитов. Интенсивность хемилюминесценции коррелирует с потреблением клетками кислорода и степенью завершенности фагоцитоза.
Спонтанная хемолюминесценция крови может быть использована для обнаружения иммунных комплексов, выявления повышенной чувствительности организма к различным аллергенам. При этом испытуемый материал добавляется в кровь, взятую от животного, и по изменению характера хемилюминесценции выявляется реакция антиген-антитело.
Известно, что многие патологические процессы сопровождаются нарушением механизмов свободно-радикального окисления и антиоксидантной защиты, что значительно ухудшает течение и прогноз заболевания. Исследование ХЛ находит применение для оценки влияния на свободно-радикальное окисление (СРО) лекарственных средств. Антиоксиданты начинают широко использоваться при лечении и профилактике многих заболеваний, различных видов стресса.
ЗАДАЧА
Изучить антиокислительной активности (АОА) беридона (состоящего из беренила и антиоксиданта) в сравнении с беренилом в модельной системе прекисного окисления липидов (ПОЛ).
Материалы и методы исследования.
Антиокислительную активность препаратов оценивали по угнетению хемилюминесценции (ХЛ) модельных систем, в которых вызывали генерацию активных форм кислорода и процессов перекисного окисления липидов. Регистрацию сверхслабого свечения проводили на приборе ХЛМ-003. Проверку стабильности работы установки проводили перед каждым измерением по
Таблица 1
Показатели хемилюминесценции в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода (АФК)
Исследуемы препарат Светосумма у,е> Спонтанная светимость у,е> Световспышка у,е> Максимальная светимость у,е> Тангенс угла наклона кривой у.е.
Контроль 1,19 0,34 1,21 0,98 0,09
Беридон 0,24 0,42 0,26 1,12 0,04
Беренил 1,17 0,96 1,2 1,24 0,74
эталону ЖС-19 (ГОСТ 9411-81), интенсивность свечения которого составляет 5,1х105 квантов в секунду. Эта величина была принята за относительную единицу. Основными и наиболее информативными характеристиками хе-милюминесценции служили светосум-ма свечения, определявшаяся по интенсивности излучения, и амплитуда максимального свечения. ХЛ модельных систем характеризовалась спонтанным свечением, быстрой вспышкой, возникающей при введении солей железа, и развивающейся затем медленной вспышкой. Интегральным и наиболее информативным показателем является величина светосуммы свечения. Ее изменения в модельных системах при добавлении беридона и беренила в исследованиях in vitro в процентах от контроля приведены в таблице 1. Запись хемилюминесценции в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода (АФК) в концентрации 0,1 мг/ мл.
Результаты исследований.
Как видно из таблицы 1, добавление препаратов беридона и беренила в модельную систему, в которой вызы-
вается образование активных форм кислорода, критерием оценки является уменьшение I max и светосуммы ХЛ (S). Установлено, что чем длиннее латентный период, тем в большей степени проявляется антиоксидантный эффект в сравнении с контролем и тем самым объясняется наличие высокого анти-оксидантного эффекта беридона в сравнении беренилом. Препараты сравнивались автономно с контролем и этанолом (выбор растворителей основывался исходя из физико-химических свойств исследуемых препаратов, нами было использовано ДМСО). Наибольший антиоксидантный эффект в системе проявил беридон, снижая свечение в 5 раз по сравнению с беренилом.
Из приведенных в таблице результатов исследований мы видим, что све-тосумма в контроле составляет 1,19 у. е., а после добавления в модельную систему беридона она равна 0,24, что в 5 раз ниже. После добавления беренила показатель светосуммы равен 1,17 у.е., что примерно равно показателю в контроле и выше показателя светосуммы беридона 4,87 раза.
Таким образом, нами впервые была использована в исследованиях модельная система по изучению антиоксидантной активности беридона и беренила. Результаты показали, что беридон обладает антиоксидантной способностью, которая в 5 раз превосходит свойства беренила, следовательно, беридон способен взаимодействовать с различными типами радикалов и тушить хемилюминесценцию модельных систем, связанных с перекисным окислением липидов и генерацией активных форм кислорода.
ВЫВОДЫ
1. Показана преимущественная способность беридона в сравнении с беренилом взаимодействовать с различными типами радикалов и тушить хемилюминесценцию модельных систем, связанных с перекисным окислением липидов и генерацией активных форм кислорода.
2. Установлено, что наибольший антиоксидантный эффект в модельной системе, где генерировались активные формы кислорода (АФК), проявил беридон, снижая хемилюминесценцию в 5 раз по сравнению с беренилом.
5
s-я <и а.
-е-
к
Si
«
а о,
I
о
к £
к
к
О
к £
