ІНТЕНСИВНіСТЬ ОКИСНИХ ПРОЦЕСіВ У КЛіТИНАХ ГРАНУЛЬОЗИ ПРИ КУЛЬТИВУВАННі Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 661. 185.1: 599. 323.4:612. 35: 57. 015.2

Боднар Ю. В. ©

1нститут бюлогп тварин УААН

ШТЕНСИВШСТЬ ОКИСНИХ ПРОЦЕС1В У КЛ1ТИНАХ ГРАНУЛЬОЗИ ПРИ КУЛЬТИВУВАНН1

Вивчали зв'язки м1ж тривалктю культивування та штенсившстю окисних процеЫв клтин гранульози з ргзних за розм1ром фолгкулгв яечнитв коргв. Встановлено, що дихальна актившсть клтин гранульози в залежност1 в1д д1аметру фолтул1в, з яких вони вилучеш, в межах 4,2 - 6,4 нг-атом О/О,1мл СК/ хв, вгдновна здатшсть - 2,8 - 3,1 мВ/0,1мл СК/ хв. Величини дослгджуваних показниюв залежать в1д часу культивування гранульози та величини фолтул1в, з яких вони отримаш. Дихальна актившсть (?2 = 0,45; F=3,61) та вгдновна здатшсть (г? = 0,17; F=0,91) клтин з малого фолгкула проявляють найвищу залежшсть вгд тривалостг культивування, нижчу (в\дпов\дно, г? = 0,33; F=2,23 та г? = 0,11; F=0,54) з середнього i найнижчу (?2 = 0,15; F=0,82 та г? = 0,01; F=0,04) з великого фолiкулiв.

Ключовi слова: дихальна актившсть, вiдновна здатшсть, гранульоза, культивування, фолжул, яечник, корови.

Доведено, що кл^ини гранульозного шару фолiкулiв яечниюв KopiB для свого кнування отримують енергш за рахунок raÍKonÍ3y i дихання [1, 2]. При цьому, in vivo та in vitro виявлеш особливост енергогенеруючих процеЫв у гранульози Рiзниця у шляхах генераци АТФ кл^инами виявляеться у рiзних фiзiологiчних станах статево! залози та розмiрах фолiкулiв, а вщмшшсть зумовлена штенсившстю кровообку i постачанням кисню до яечника [3], умовами культивування: компонентним складом середовищ, субстратами окиснення i бюлопчно-активними сполуками (гормошв, антиоксиданив, вггаммв), рН [4, 5, 6, 7]. В залежност вщ штенсивност окисних процеЫв у кл^инах гранульози можуть прискорюватись або сповшьнюватись ркт i дозрiвання ооциив, !х заплщнення та розвиток ембрюшв як in vitro, так in vivo що, вщповщно, буде визначати ефектившсть репродуктивно! бютехнологи i перебк статевого циклу в корiв.

Метою дослщжень було вивчити зв'язки мiж тривалiстю культивування та штенсившстю окисних процеЫв клiтин гранульози, яю вилученi з фолiкулiв рiзного дiаметру.

Матер1али i методи. Шсля забою корiв отримували клiтини гранульози з фолiкулiв яечникiв рiзного фiзiологiчного стану [8]. Для дослiджень використовували яечники з фолiкулами розмiром до 4 мм (мал^, 4-7 мм (середш) i понад 7 мм (велию). Антральну рiдину отримували шляхом асшрацп фолiкулiв, центрифугували при 2000 об./хв, супернатант вщдшяли, а осад

© Боднар Ю. В., 2009

11

кл^ин суспендували в середовищi Basal Medium Eagle (BME; Sigma), кшьккть якого вщповщала об'ему фолжулярно! рiдини. Отриману суспензiю кл^ин, з врахуванням розмiру фолiкулiв, вносили у планшети (дiаметр лунок 3 см) i культивували у BME протягом 6 дiб у герметично закритому ексикаторi при 100 % вологост i температурi 38,5°С. Через кожш 48 год вивчали штенсившсть поглинання кисню - полярографiчно (нг-атом 0/0,1 мл суспензи клiтин (СК/ хв), вщновну здатнiсть - потенщометрично (мВ/0,1мл СК/ хв). Аналiз результат дослiджень проведено за М. О. Плохшським (1969)[9].

Результати дослщження. Дихальна активнiсть клiтин гранульози у BME тсля вилучення з малого фолжула становить 6,4±0,65 нг-атом 0/0,1 мл СК/ хв, середнього i великого, вщповщно, 4,2±0,52 i 5,4±0,64 нг-атом 0/0,1 мл СК/ хв (рис. 1).

нг-атом 0/0,1 мл СК/хв

7 531

бшьше 7мм

4-7 менше 4

св1жоотримаш через 48 через 96 через 144 год

Рис. 1. Дихальна актившсть кл^ин гранульози в зв'язку з культивування та розмiром фолжула

тривалiстю

При цьому, кл^ини характеризуються вiдновною здатшстю: з малого фолiкула - 2,8±1,04, середнього - 3,1±0,78 та великого - 3,1±1,38 мВ/0,1мл СК/ хв (рис. 2)

св1жоотримаш через 48 через 96 через 144 год

Рис. 2. Вщновна здатшсть кл^ин гранульози в зв'язку з тривалктю культивування та розмiром фолiкула

12

Отже, дихальна актившсть i вщновна здатшсть гранульози залежать вiд розмiру фолiкулiв яeчникiв, з яких вони вилучеш. Значнi величини похибки середньо! арифметично! дослiджуваних показниюв зумовленi як фiзiологiчним станом статево! залози, так i рiзною дихальною активнiстю та вiдновною здатнiстю, при отриманш клiтин з однакового розмiру фолiкулiв.

Аналiз величин iнтенсивностi споживання кисню та вщновно! здатностi гранульози в процес культивування свiдчить, що через 48 год iнкубування дихальна актившсть знижуеться на 81,3 % (р < 0,001) у клггин з малого фолкула, на 71,5 % (р < 0,001) з середнього та на 60,0 % (р < 0,01) з великого. При цьому, у вказаний перюд вщновна здатшсть гранульози з малого фолкула не змшюеться (2,9±0,59 мВ/0,1мл /хв) i знижуеться на 48,4 % з середнього та на 13,0 % з великого, порiвняно з свiжоотриманими.

Збшьшення тривалоси шкубування до 96 год стимулюе дихальну активнiсть й вiдновну здатнiсть кл^ин. Так, порiвняно до значення при 48 год культивуванш, споживання кисню зростае на 76,0 % (5,0±0,43 нг-атом 0/0,1 мл СК/ хв; р < 0,001) у гранульозi з малого фолкула, на 62,5 % (3,2±0,25 нг-атом 0/0,1 мл СК/ хв; р < 0,001) з середнього та на 44,5 % (3,6±0,31 нг-атом 0/0,1 мл СК/ хв; р < 0,01) з великого. Вщновна здатшсть також пщвищуеться: у кл^ин з малого та середнього фолiкулiв, вщповщно, на 35,6 % (4,5±0,43 мВ/0,1мл СК/ хв) та 27,3 % (2,2±0,90 мВ/0,1мл СК/ хв) i знижуеться на 18,5 % (2,2±0,92 мВ/0,1мл СК/ хв) у вилучених з великого фолкула.

Таким чином, кл^ини з малого фолкула через 96 год шкубування проявляли найвищi величини значень дослщжуваних показниюв, а у гранульози з середнього i великого фолiкулiв iнтенсивнiсть споживання кисню та вщновна здатшсть були нижч^ порiвняно з максимумом.

Збiльшення тривалостi культивування до 144 год характеризуеться тенденщею до зниження дихально! активностi та вщновно! здатностi у клiтин вилучених з малого фолила, рiзниця, вщповщно, 4,0 % та 20,0 %, порiвняно з 96 год шкубуванням. У гранульозi з середнього i великого фолiкулiв у вказаний перюд продовжують пiдвищуватись iнтенсивнiсть дихання, вщповщно, на 37,5 % i 16,6 % та вщновна здатшсть на 22,7 % i 18,2 %. При цьому, абсолютш величини дослщжуваних показниюв майже однаковi (дихальна актившсть 4,2 -4,4 нг-атом 0/0,1мл СК/ хв i вщновна здатшсть - 2,6 - 2,7 мВ/0,1мл СК/ хв), але нижч^ вщповщно, на 8,4 % i 25,0 %, порiвняно зi значеннями у клггин з малого фолкула.

Аналiз кореляцш мiж тривалiстю культивування i дослщжуваними бiохiмiчними показниками у культурi кл^ин свiдчить, що найвища сила впливу на дихальну актившсть (^2 = 0,45; F=3,61) та вiдновну здатшсть (^2 = 0,17; F=0,91) проявляеться при шкубуванш гранульози з малого фолкула, нижча (вщповщно, = 0,33; F=2,23 та = 0,11; F=0,54) з середнього i найнижча (^2 = 0,15; F=0,82 та = 0,01; F=0,04) з великого фолiкулiв.

Отже, протягом 48 год вщ початку шкубування кл^ини адаптуються до умов культивування (компонентного складу, окремих субстраив, рН середовища; лаг-фаза [10]) не залежно вiд розмiру фолiкулiв, з яких вони

13

вилучеш. Протягом наступних 48 год (через 96 год вщ початку культивування) вщбуваеться штенсивне використання субстраив (фаза лшшного росту). Через 144 год вщ початку шкубування, вища iнтенсивнiсть використання субстраив клiтинами з малого фолiкула, на нашу думку, призводить до нагромадження продуктiв обмiну, виснаження ресурсiв середовища культивування, про що свiдчить зниження !х дихально! активностi та вщновно! здатностi, i може супроводжуватись сповшьненням росту або вiдмиранням культури. Кл^ини з середнього та великого фолiкулiв в цей перiод проявляють приркт величин дослiджуваних показникiв, що вказуе на пролонгований час лiнiйного росту й вщмшност метаболiзму, порiвняно з гранульозою малого фолiкула.

Висновки.

1. Дихальна активнiсть клiтин гранульози тсля вилучення з фолiкулiв 4,2 - 6,4 нг-атом О/О,1мл СК/ хв, вщновна здатнiсть - 2,8 - 3,1 мВ/0,1мл СК/ хв.

2. 1нтенсившсть споживання кисню та вщновна здатшсть клiтин залежить вiд тривалост культивування та величини фолiкулiв, з яких вони отримаш.

3. Найвища сила впливу тривалостi культивування на дихальну активнiсть (ц2 = 0,45; F=3,61) та вiдновну здатнiсть (ц2 = 0,17; F=0,91) проявляеться у гранульозi з малого фолiкула, нижча (вщповщно, ц2 = 0,33; F=2,23 та ц2 = 0,11; F=0,54) з середнього i найнижча (ц2 = 0,15; F=0,82 та ц2 = 0,01; F=0,04) з великого фолiкулiв.

Л1тература

1. Roberts R., Stark J., Iatropoulou A., Becker D. L., Franks S., Hardy K. Energy Substrate Metabolism of Mouse Cumulus-Oocyte Complexes: Response to Follicle-Stimulating Hormone Is Mediated by the Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway and Is Associated with Oocyte Maturation //Biol. Reprod. - 2004. -V. 71. -P. 199-209

2. Clark A. R., Stokes Y. M., M Lane J. G. Thompson Mathematical modelling of oxygen concentration in bovine and murine cumulus-oocyte complexes //Reproduction - 2006. -V.131. -P. 999-1006

3. Смирнова Т.А., Галиева Л.Д. Состояние ядерного материала ооцитов коров в зависимости от развития микроцеркулярного русла фолликулов //Бюл. ВНИИ разведения и генетики с.-х. животных. - 1998. - Вып.109. - С. 21-22.

4. Rroberts A.J. , Echternkamp S.E. In Vitro Production of Estradiol by Bovine Granulosa Cells: Evaluation of Culture Condition, Stage of Follicular Development, and Location of Cells Within Follicles //Biol. Reprod. -1994. -V. 51. -P. 273-282

5. Takehiro Itoh, Masayuki Kacchi, Hiroyuki Abe, Yutaka Sendai, and Hiroyoshi Hoshi Growth, Antrum Formation, and Estradiol Production of Bovine Preantral Follicles Cultured in a Serum-Free Medium //Biol. Reprod. - 2002. -V 67. -P. 1099-1105

6. Sutton-McDowall M. L., Gilchrist R. B., Thompson J. G. Cumulus expansion and glucose utilisation by bovine cumulus-oocyte complexes during in vitro maturation: the influence of glucosamine and follicle-stimulating hormone //Reproduction - 2004. -V. 128(3). -P. 313 - 319.

14

7. FitzHarris G., Siyanov V., Baltz J. M. Granulosa cells regulate oocyte intracellular pH against acidosis in preantral follicles by multiple mechanisms //Development - 2007. -V. 134. -P. 4283-4295

8. Оцшка функщонального стану ооцит-кумулюсних комплекЫв KopiB залежно вщ типу яечника /Гузеватий O.G., Ясшський В.В, Смулка Л.В. та ш. // Вiсник аграрно! науки. - 1995. - № 11. - С. 94-98.

9. Плохинский Н.А. Руководство по биометрии для зоотехников. М.: Колос., 1969. - 255с.

10. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология: кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высш. шк., 1990 - 296 с.

Summary Yu. V. Bodnar

INTENSITY OF OXIDIZING PROCESSES IN THE CELLS OF GRANULOSE

AT CULTIVATION

The connections between duration of cultivation and intensity of oxidizing processes of granulose cells from the different by size follicles of cows' ovaries were studied. It is set, that respiratory activity of granulose cells depends on the diameter of follicles which they are withdrawn from, within the limits of 4 ng - atom 0/0,1 ml SC/ min, redox ability 2,8 - 3,1 m V/0,1ml SC/ min. The values of the explored indexes rely on time of cultivation of granulose cells and size of follicles which they are got from. Respiratory activity (h2 = 0,45; F=3,61) that restoration power (h2 = 0,17; F=0,91) of cells from a small follicle show the greatest dependence on duration of cultivation, below (accordingly, h2 = 0,33; F=2,23 and h2 = 0,11; F=0,54) from middle and below (h2 = 0,15; F=0,82 and h2 = 0,01; F=0,04) only from large follicles.

Стаття надшшла до редакцИ 21.09.2009

15