Интеграция генома ретровируса типа d Мейзона-Пфайзера в хромосомы человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Продукция цитокинов in vitro

Таблица 2.

Концентрация, пкг/мл Показатели интерлейкинов

ИЛ-1 ИЛ-2 ИЛ-6 ИФН-а ФНО

pVM+pYV+, M+m 91,6+10,1 3 1,7±2,1 326,7±39,3 15,7± 1,7 88,4± 10,6

контроль (доноры), А±1П -43,3 11 ±0,4 -1,7+0,1 -321,0 " ±34,7 -3,1 “±0,4 -50,1 а ±5,7

pVM-pYV+, A±m 29,1 а ±0,3 2,4±0,2 36,9 " ±5,9 1,9 " ±0,2 8,4 а +8,6

ЛПС, (5мкг /мл), Д±т 69,7 " ±0,7 1,9±0,1 78,7 а ±9,4 4,5 " ±0,5 46,9 а ±5,2

Примечание: указана среднее разницы (относительно уровня, индуцированного У.р5еис1ои1Ьегси1о515 (82:47)) и ее ошибка, а - Р<0.()5.

к третьей неделе, у ТНФ-а не меняется, а продукция ИЛ-6 еще больше снижается. Достоверных отличий в уровне выработки цитокинов у больных, заболевание которых вызвано разными штаммамивозбудителя, выявить не удалось. Экспериментальные же данные указывают на более низкую стимуляцию продукции ИЛ-1, ИЛ-6,

ФНО-а и ИФН-а двухплазмидным штаммом У. р5еис1о1иЬегси1о5|5 (табл.2). Под действием культур У. р5еис1о1иЬегси1о5|5 продукция ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а и ИФН-а была больше, чем в контроле и меньше, чем стимулированная ЛПС возбудителя.

Таким образом, Y.pseudotuberculosis обладает выраженными иммуносупрессорными свойствами и снижает продукцию цитокинов клетками крови in vitro и in vivo. В первую неделю заболевания псевдотуберкулезом наблюдается выраженное снижение продукции иммуноцитокинов, а к третьей неделе происходит повышение продукции ИЛ-1, ИЛ-2 и ИФН-а, уровень выработки ФНО-а остается таким же низким, а уровень ИЛ-6 еще больше снижается.

О БОЛОРМА В., ЛЕБЕДЕВ Ю.Б., КЖИШКОВСКА Ю.Г., ОСТАШКИН А.С., ИЛЬИН К.В., ИМАМОВА Л.Р., МЯНДИНА Г.И., ИТКЕС А.В., СВЕРДЛОВ Е.Д. -УДК 576.858

ИНТЕГРАЦИЯ ГЕНОМА РЕТРОВИРУСА ТИПА О МЕЙЗОНА-ПФАЙЗЕРА В ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА

В. Болорма, Ю.Б. Лебедев, Ю.Г. Кжишковска, А.С. Осташкин, К.В. Ильин,

А.Р. Имамова, Г.И Мяндина, А.В. Иткес, Е.Д. Свердлов.

(Монгольский государственный медицинский университет, Российский университет дружбы народов, институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Институт канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН)

Экзогенные ретровирусы типа Э - не содержащие онкогенов лимфотропные вирусы, выделенные от нескольких видов обезьян. Антитела к этим вирусам обнаружены у здорового населения Западной Африки, у больных лимфоаденопатия-ми, включая СПИД; также известен случай выделения ретровируса типа Э от больного В-клеточ-ной лимфомой и СПИД.

Ранее авторы настоящего исследования обнаружили нуклеотидные последовательности ретровируса типа Э в лимфоцитах детей, больных В-клеточной Беркитт-подобной лимфомой. ДНК лимфоцитов периферической крови нескольких таких больных была использована как исходный материал для этой работы. Данная ДНК, как ранее было показано при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), содержит элементы генома вируса Мейзона-Пфайзера (МРМУ), относящиеся к области рг1-ро1. Целью данного исследования было, во-первых, выяснение вопроса о том, содержат ли анализируемые человеческие ДНК полную копию генома МРМУ, или его фрагменты. Во-вторых, целью работы было определение и анализ участ-

ков генома человека, в которых произошла интеграция ДНК данного вируса.

Первый этап работы заключался в амплификации областей ДНК человека, фланкирующих концевые участки интегрированного вирусного генома, методом селективной ПЦР-супрессии.

Эффект ПЦР-супрессии состоит в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертированными концевыми повторами, в реакции ПЦР с праймером, соответсвующим внешней части инвертированных концевых повторов. Исходную ДНК подвергают исчерпывающему гидролизу рестриктазой (обычно - ЕсоЯI или одной из мелкощепящих рестриктаз) и присоединяют к полученным фрагментам специальный олигонуклеотидный адаптер, содержащий участок самокомплементарности; это подавляет амплификацию ДНК, не содержащей геном вируса (детально этот метод описан ранее).

В данной работе использовали праймеры, комплементарные длинным концевым повторам вируса (ЬТЯ):

А115-443, САССАААСАСАССССААСАС;

АиЗ-94, АСТСССТААТССААТСАССС; 40-нуклеотидные супрессионные адаптеры Т7-Ыои: СТААТАССАСТСАСТАТАССССАСССТССТСС ССССССАССТ;

праймеры, комплементарные адаптерам Т7: СТААТАССАСТСАСТАТАСССС.

Были использованы четыре образца ДНК больных, для каждого из образцов получены два набора амплифицированных фрагментов ДНК (соответствующих первоначальному расщеплению хромосомной ДНК рестрикгазами ЕсоШ и /?.уяI), предположительно содержащих элементы генома МРМУ.

Для увеличения специфичности продукт, полученный при первой ПЦР, был реамплифициро-ван еще в одном раунде реакции с праймером N011 (АСССТССТССССССССАССТ), который соответствует внутренней части супрессионного адаптера, и праймерами А115-420 для 5’ЬТЯ (АТССАСТСССТАСАОСАТСС) и А113-234 для З’ЬТЯ (СТСТТССССТСТСТТТССТС); последние соответствуют последовательностям ЬТЯ, приближенным к ожидаемой точке интеграции.

12 3 4 5 6 7 89 II 13 14 16 1920

*

—♦

1 kb

—*

Рис.!. Гибридизационный анализ продуктов селективной амплификации, содержащих фрагменты ДНК человека и вируса Мейзона-11файзера (MPMV).

I -4, 5'-LTR (EcoRI-(фрагменты), 5-8, З'-LTR (EcoR 1 -фрагменты), 1.5- больной 1; 2. 6 - больной 2; 3, 7 — больной 3; 4. 8 - больной 4. 9. маркер длины ДЫК "I kb DNA Ladder". 10-13 - положительная контроль LTR-зон-ла. 14 - маркер 100 bp DNA ladder . 15-16, 5* LTR (Rsal-фрагмепты). 17-18. 3* LTR (Rsal-фрагменты, 19-20, положительная контроль назмида-зопда.

В качестве зондов использовали |oc-321dATP- меченные 5’ - и 3’ - LTR вируса MPMV.

Таким образом, в результате последовательно проведенных двух реакций амплификации была получена смесь фрагментов геномной ДНК с существенным обогащением продуктами, содержащими LTR MPMV и фланкирующие их участки генома человека. Результаты гибридизации по Саузерну (в качестве зондов использовали полноразмерные LTR MPMV) этих продуктов амплификации показали, что размеры LTR-содержащих фрагментов по всем четырем образцам ДНК соответствовал 300-600 пар оснований (п.о.) для 3’-

LTR, £со/?1-фрагментов и 100-400 п. о. для 5’ и 3’-LTR, ИхаI -фрагментов (рис.1). Таким образом, результаты гибридизационного анализа показали присутствие в анализируемой ДНК обоих LTR МРМУ и позволили определить примерные размеры LTR-coдepжaщиx продуктов амплификации.

Эти продукты амплификации разделяли электрофорезом в легкоплавком (ЕМТ) агарозном геле, после чего элюировали материал из областей, соответствующих примерным размерам LTR-содержащих ДНК. Полученные таким образом фрагменты ДНК реамплифицировали с помощью РЛ|-полимеразы для получения "тупых” концов и клонировали в плазмиде рСЕМ-32/19 по сайту БтаХ.

Полученную библиотеку фрагментов ДНК анализировали гибридизацией по стандартной методике [7], в качестве зонда использовали [а-32]с!АТР - меченные 5’- и 3’ - LTR вируса МРМУ.

Были отобраны 115 положительных клонов (из 1100) и реамплифицированы с одним универсальным п одним LTR-гoмoлoгичным праймерами; в результате данной процедуры был обнаружен только один клон (№51), содержащий последовательность LTR МРМУ н прилежащий фрагмент ДНК человека (от больного №1. 5’-LTR, ЛЧя1 -фрагмент).

В результате определения нуклеотидной последовательности клона 51 обнаружена вставка длиной 78 иуклеотидов (рис.2), содержащая 50-нуклеотидный фрагмент, идентичный участку между нуклеотидами 112487 и 112438 клона НС1Т542В22 17-ой хромосомы человека (асс.

№ genebanc: gb|AC004253.1|AC004253). Этот уча сток 17-ой хромосомы находится между семействами повторов А1и8х (112077-112376) и ЫМА4А (112897-112952) и в данное время с функциональной точки зрения еще не охарактеризован.

Для того, чтобы подтвердить наличие элемента МРМУ в 17-ой хромосоме больного №1, была проведена пе51ес1-амплификация соответствующей исходной ДНК с праймерами, гомологичными прилежащим участкам данной хромосомы и 5’-LTR МРМУ, не совпадающими с праймерами для селективной ПЦР (рис.2). Результаты электрофоретического анализа показали, что при этом получен ожидаемый продукт длиной 85 п.о.; при его расщеплении рестриктазой БреI образуются продукты длиной 57 и 32 п.о., что также соответствует ожидаемому.

Приведенные результаты прямо доказывают, что ДНК вируса МРМУ интегрирована в 17-й хромосоме у одного из четырех обследованных больных В-клеточной лимфомой. Можно предполагать, что интегрирована полная копия вирусного генома, поскольку гибридизационный анализ выявил наличие обоих LTR МРМУ. В инфицированных клетках могут существовать и другие области интеграции МРМУ, выявление которых требует дальнейших исследований.

>* __> ОТААААСОАСООССАаТОААТТОТААТАСОАГТСАСТАТАОООСОААТСОАОСП'СООТАССС

З * <- COAOCCATOOO

пр<-<янрус.________ —— ____

ATCCA3TCOOTA OCTACAOOCACTACTAACAACTATCAACOTCTOTOAGTAC СТСО-Х'

ТАООТСАОССАТ ГС АТСГГСС СТОАТСАТ ТОТГСЇАТАГТГОСА«ACTАСТСАТО«АОСОО

адаптур

СОСО АССЛ^ОСТООООАТССТСТАОАОТСОАССТОС АСЮ С АТОСАЛОСТТОАО ТАТТСТ AT /SO ТО .>

ОСОСТООТОСОАССССТ АОО АО АТСТС АОСТОО АСОТССОТ ЛСОТТСОААСТС АТ АЛО АТ АТС ACT АО ТО

/*« /

О АТТТ АСТО ААССОС ATT ЛОТААССАОТАТСО

Рис.2. Нуклеот идная последовательность участка интеграции 5’- ЬТЯ вируса Меюона-Пфайзера (МРМ\') в 17-ой хромосоме: Показаны курсивом - последовательности генома вируса, прямым шрифтом - последовательности 17-хромосомы, жирным шрифтом - перекрывающиеся последовательности.

Таким образом, МРМУ непосредственно инфицирует клетки периферической крови у больн-больных В-клеточной лимфомой и интегрирует в хромосомную ДНК. Это дает веские основания считать, что зарегистрированные ранее (см. выше) положительные результаты при иммунохимиче-ском определении белков МРМУ у больных с лимфопролиферативными заболеваниями не яв-

ляются результатом неспецифических, перекрестных и т. д. реакций, а действительно показывают наличие инфекции МРМУ. Кроме того, поскольку МРМУ обнаружен только в крови больных и их родственников, по не здоровых доноров [8], данный вирус может быть вовлечен в процесс канцерогенеза, по крайней мере - для данной группы опухолей.

© ЦЭЦЭГЭЭ Ж., АМАРТУВШИН Б., БИРА Н. -УДК 616.345-073.48

УЛЬТРАЗВУКОВАЯ КОЛОНОГРАФИЯ С ПЕРОРАЛЬНЫМ КОНТРАСТИРОВАНИЕМ

Ж. Цэцэгээ, Б. Амартувшин, Н. Бира.

(Монгольский государственный медицинский университет)

Разработан метод ультразвукового сканирования для определения структурного и функционального состояния толстой кишки с перораль-ным её контрастированием. Применение данного метода позволяет оценить использование ультразвуковой колонографии с пероральным промыванием и контрастированием желудочно-кишечного тракта, без предварительной очистительной клизмы. Толстая кишка контрастируется после промывания желудочно-кишечного тракта физиологическим раствором 3000-4000 мл. Этот способ физиологичен и более удобен для больного. Исследование проводилось в режиме В ультразвукового аппарата линейным и конвексным датчиками с частотой 3,5-7,5 Мгц.

В последнее время ультразвуковое исследование (УЗИ) широко применяется для изучения полых органов. Опубликовано, много, материалов ультразвуковой ирригографии. При этом больные нуждаются в предварительной подготовке: применение специальной диеты, при необходимости использование препаратов устранения газов в кишечнике и 3-4 очистительных клизм, также перед УЗИ делают клизмы для введения контрастной жидкости.

Цель исследования. Обработать новый физиологичный, удобный ультразвуковой метод исследования толстой кишки и определить их нормальные ультразвуковые размеры у Монголов.

Материалы п методы

При медицинском профилактическом осмотре из 4000 обследованных нами выбраны 1000 здо-

ровых лиц от 18 до 68 лет. Средний возрасту 38,6± 1,8 лет. Мы проводили УЗИ в эхографическом кабинете диагностического отделения Центральной клинической больницы им. П.Н. Шасти-на г.Улан-Батора и в городах Эрдэнэт, Ховд, Цэ-цэрлэг, а также в 8 селах. Из 1000 обследованных 600 (60%) были женщины и 400 (40%) мужчин. Ультразвуковая колонография с пероральным контрастированием (УЗКПОК) выполнена аппаратами Aloka SSD-256 и 500, Hitachi EUB-300, 305, SonoAce 600, Picker CS-9000 линейным и конвексным датчиками с частотой 3,5-7,5 МГц.

Исследование проводилось натощак после обзорного УЗИ органов брюшной полости. За 35-40 минут до исследования больным давали выпить 3000-4000 мл физиологического раствора при температуре 35-36°С, фракционным методом. Между перерывами больным сделали специальные упражнения для ускорения перистальтики и промывания желудочно-кишечного тракта. После промывания желудочно-кишечного тракта, больному давали выпить, 600-800 мл кипяченной воды при температуре 35-36°С. После чего проводили УЗИ-осмотр (визуализацию) желудка, для оценки морфологического состояния и его функции. Затем исследовали толстую кишку, начиная со слепой и кончая сигмовидной (количественный и качественный анализ) толстой кишки.

Результаты II обсуждение

Анализ результатов использования ультразвуковой колонографии свидетельствует о возможности исследования без длительных и мучительных