CC BY
84
УДК 631.871
ИННОВАЦИОННЫЙ ПОДХОД к ПРИМЕНЕНИЮ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ В БИОТЕХНОЛОГИИ
И.Н. Гагарина, к.с.-х.н. (ФГОУ ВПО Орел ГАУ) Н.Е. Павловская, д.б.н. (ФГОУ ВПО Орел ГАУ)
Одной из приоритетных задач биотехнологии является о беспечение сельскохозяйственного производства дешевыми, экологически чистыми и эффективными препаратами для о бработки посевного материала, гарантирующие формирование высоких и стабильных урожаев.
Использование белковых компонентов в биотехнологии открывает большие перспективы. Современное производство лекарственных препаратов, продуктов питания, растениеводство и животноводство невозможно представить без разноо бразных биотехнологических продуктов. Именно развивая биотехнологические производства, можно до биться серьезного технологического прорыва во многих отраслях народного хозяйства. Это давно поняли во развитых странах, где развитие биотехнологии стало одним из главных приоритетов в политике государств [4].
С целью выявления дополнительного источника биологически активных веществ многие ученые мира занимаются биоскринингом растений. Фасоль является одним из таких о бъектов. По химическому составу семена фасоли уникальны и включены в группу важных продуктов, о беспечивающих население полноценным белком. Однако белковый комплекс фасоли содержит ряд токсичных и антиали-ментарных факторов питания, блокирующих активность пищеварительных ферментов, которые, возможно, принимают участие в защитных механизмах растения. Наличие антипитательных веществ (ингибиторов гидролаз, лектинов и цианогенных глико-зидов) с высокой активностью в семенах фасоли делает ее перспективной с точки зрения биотехнологической переработки и получения фитопрепаратов [5].
Уникальные свойства лектинов обуславливают их успешное и широкое применение в качестве аффинных адсор бентов различных гликоконьюгатов для выделения клеток и органелл, а также в качестве специфических зондов, сыгравших значительную роль в установлении топографии мембранных углеводов. О бнаружено также, что лектины могут о бла-дать гормональным действием, вызывать пролифи-рацию клеток и оказывать другие физиологические эффекты [9].
Лектины и ферменты, вернее их доменные центры, выступают в качестве чувствительных биосен-серов, детектирующих определение углеводной последовательности в олигосахаридах, которые являются специфическими лигандами в углеводнобелковом взаимодействии. В настоящее время большое внимание о бращено не на специфические
функции лектинов, а на их неспецифическую роль в устойчивости растений к патогенам [4].
Лектины могут стать ценными биохимическими реагентами, использование которых получает свое развитие в экспериментальной цитохимии, диагностике некоторых заболеваний и в биотехнологических процессах выделения сложных углеводсодержащих веществ. В последние годы делаются попытки использования лектинов в качестве лекарственных препаратов [7].
Лектины функционируют как антитела и противостоят почвенным бактериям; они играют ключевую роль в развитии и дифференциации эм брио-нальных клеток, могут быть медиаторами в определенных отношениях между азотфиксирующими бактериями и растением - хозяином [3]
Лектины играют роль не только в самом растении, но и связываться с гликоконьюгатами других организмов, внося вклад, в частности, в функционирование сим биозов. По мнению Л.П. Антонюк и В.В Игнатова [1], агглютинин зародышей пшеницы (АЗП), обнаруживаемый в том числе и в корнях, инфицированных бактериями А.Ьга8Йеше 8р 245, является сигнальной молекулой, изменяющей метаболизм микроорганизма в направлении, благоприятном для роста и развития растений [1,10].
Лектин гороха в концентрации 50 мкг/мг стимулирует рост бактерий, а на высоком азотном фоне теряет такую способность. Л.В. Косенко и др. [6] связывают это с нарушением лектин - углеводной системы узнавания бобово-ризобиальных симбио-нов из-за синтеза бактериями на высоком азотном фоне модифицированного комплекса клеточных и внеклеточных полисахаридов.
Генная инженерия использует растительные ингибиторы протеиназ для получения устойчивых к насекомым трансгенных растений: вигна, батат, картофель, соя, рис.
В настоящее время белковые ингибиторы различного происхождения находят все более широкое применение в медицине. Их используют для лечения патологических процессов, связанных с чрезмерной активацией протеолитических ферментов организма. Положительный эффект дает применение ингибиторов при различных воспалительных процессах, оперативных вмешательствах, травмах. Наибольшее признание получило использование ингибиторов протеиназ в терапии острых панкреатитов, а также при нарушении процессов гемоста-за[3].
Некоторые из ингибиторов о бладают высокой устойчивостью к нагреванию и к действию пепсина. Инактивация наблюдается только при автоклавиро-вании муки. Неактивированные ингибиторы практически полностью тормозят активность трипсина, в то же время инактивация ингибиторов приводит к сильному увеличению протеолиза белков.
Ингибиторы трипсина и химотрипсина, присутствующие в семенах растений, спосо бны подавлять активность экзогенных протеиназ фитопатогенных
микроорганизмов (2). Однако они могут действовать и на другие протеиназы, выполняющие регуляторные функции в растительном организме. Это позволяет предположить, что ингибиторы протеолитиче-ских ферментов играют активную роль в защите растений от поражения фитопатогенными микроорганизмами. Подтверждение этому служит подавление роста мицелия гри бов рода Fusarium и B. cinerea при внесении в среду препаратом инги итора трипсина из фасоли. Некоторые из ингибиторов отличаются осо бенно высокой специфичностью. Так, из семян фасоли выделен инги итор, действующий на сериновую протеиназу фитопатогенного гри а Colletotrichum tindemuthianum, воз будителя антрактоза. Ингибитор был не активен не только по отношению к трипсину и химотрипсину, но и не действовал на се-риновую протеиназу гриба Asp. Oryzae [7].
Описанные свойства лектинов и инги иторов делают перспективным использование их в различных отраслях иотехнологического производства.
Поэтому задачей наших исследований является выделение елков и испытание их иологической активности, с целью создания иопрепаратов нового поколения, действие которых основано на иммунокоррекции антиоксидантной системы растений, в частности гороха.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служил горох сортов Норд и Вега. Выделение лектинов из семян фасоли проводили по методу Г.Я. Алексидзе и др. [8] с изменениями, адаптированными для семян фасоли. В основе метода выделения и очистки инги иторов протеиназ лежит методика, разра отанная И.О. Мельниковой [8], адаптированная к фасоли. Испытания биологической активности: катаклазы - метод в модификации А.И. Ермакова [8] основан на измерении о ъема выделевшегося кислорода после при-авления к водному экстракту каталазы перекиси водорода; пероксидазы - спектрофотомктрический метод [8] основан на измерении оптической плотности продуктов реакции, о разовавшихся при окислении гваякола за определенный промежуток времени.
Семена гороха замачивали перед посевом на 4 часа в летиносодержащих и инги иторосодержащих препаратах, котроль вода и промышленные препараты Эпин и Нарцисс.
Результаты и их обсуждение
По результатам наших испытаний на иологиче-скую активность елковых компонентов, в частности лектинов, из семян фасоли выявлено, что лекти-ны стимулировали ростовые процессы гороха и повышали ферментативную активность клеток, отвечающую за иммунитет.
На протяжении роста проростков гороха отмечалось увеличение активности пероксидазы, и снижение активности каталазы. При этом наиболее высокая активность пероксидазы в тканях растений от-
мечена при обработке раствором лектина фасоли более высокой степени разведения - 10-7% (рис. 1,2).
30 и А усл.ед.
2520-
4 сутки 5 сутки 6 сутки 7 сутки
□ необработанные Ш Эпин
□ Пектин фасоли 10-2%
□ Пектин фасоли 10-7%
Рисунок 1- Активность пероксидазы в проростках гороха
35
30
25
20
15
10
5
0
Каталазное т- число
4 сутки 5 сутки 6 сутки 7 сутки
□ необработанные ШЭпин
ЫЛектин фасоли 10-2%
□ Пектин фасоли 10-7%
Рисунок 2 - Активность каталазы в проростках гороха
На горохе сорта Норд в полевых условиях проводились испытания комплексных препаратов, созданных на основе лектинов фасоли. Обработка семян гороха препаратами повышает устойчивость растений гороха к аскохитозу на 16 %, снижает развитие корневых гнилей на 10 %,повышает урожайность на 16...23 %. Механизм действия предлагаемого препарата заключается в том, что он вызывает экспрессию генов, ответственных за иммунитет и активизирует ферменты и реакции нео ходимые для синтеза хлорофилла в световой реакции фотосинтеза.
Предлагаемый препарат для предпосевной о б-работки семян гороха, названный нами «ЛЕЛЬ» (заявка на изобретение №2006111695 от 10.04.06) увеличивает энергию прорастания, всхожесть семян, уменьшает зараженность семян олезнями и вредителями, вследствии чего повышается урожайность гороха до 12% (та бл.1).
Изучение влияния препарата, созданного на основе инги иторов повышает олезнеустойчи-вость гороха к воз удителю корневых гнилей Fusarium oxysporum, определяемого по пероксида-зозависимому иммунитету в 1,5____1,8 раз по срав-
нению с контролем (та бл 2).
Т а блица 1 - Влияние б иопрепаратов на посевные
Установлено, что данный препарат повышает устойчивость гороха к леднопятнистому аскохитозу на 16 %, снижают поражение семян гороховой плодожоркой на 12%, увеличивают урожай семян на 20 %.
Выводы
Лектины фасоли стимулируют повышение иммунной системы растений гороха. Показателем этого является повышение напряженности ферментативных реакций в организме растений.
О ра отка семян гороха лектинсодержащими препаратами повышает устойчивость растений гороха к аскохитозу на 16 %, снижает развитие корневых гнилей на 10 %,повышает урожайность на 16...23 %.
Предлагаемый препарат «Лель» для предпосевной о ра отки семян увеличивает энергию прорастания, всхожесть семян, уменьшает зараженность семян олезнями и вредителями.
О ра отка препаратом, созданным на основе инги иторов протеиназ повышает олезнеустойчи-вость гороха к воз удителю корневых гнилей Fusarium oxysporum в 1,5.. .1,8.
Таким о разом, нео ходимость дальнейших испытаний компонентов елкового комплекса семян фасоли для создания фитоиммуномодуляторов диктуется тем, что имеющийся ольшой перечень препаратов подо ного действия не распространяется на бо бовые культуры, в частности горох. Вместе с тем, созданные нами препараты на основе природных компонентов, экологически езопасны и могут заменить химические средства защиты.
Литература
1. Аваль баев, А.М. Множественная и гормо-
нальная регуляция содержания лектина в корнях проростков пшеницы / А.М.Авальбаев,
М.В .Безрукова, Ф.М.Шакирова //Физиология растений.- 2001 .-Т. 48, № 5.- С.118-122.
2. Антонюк, Л.П. Экзогенная функция лектина пшеницы (АЗП) / Л.П. Антонюк, В.В .Игнатов // Гипотеза и экспериментальные данные в ее поддержку: тез. докл. на VI съезде о бщества физиол. раст., Москва,4-9 окт .-1999. -Т.18, № 5.- С.435-441.
3. Бенкен, И.И. Антипитательные вещества белковой природы в семенах сои / И.И.Бенкен, Т.Б.Томилина // Бюллетень ВИР - 1989.- Т.149. -С.3-10.
4. Иващенко, А.А. Высокопроизводительный иоскрининг как инновационная технология для
ускоренного развития фармацевтической и агрохимической индустрии / А.А.Иващенко // Тезисы докладов и выступления участников круглого стола «Законодательное обеспечение развития биотехнологической отрасли промышленности».- М.,2005.-С.27-39.
5. Косенко, Л.В. Воздействие лектина гороха на клу еньковые актерии гороха при их росте на различном азотном фоне / Л.В .Косенко, Л.Д.Вабанец, Н.В.Мандровская // Тезисы докладов на VI съезде о бщества физиол. раст., Москва, 4-9 окт. 1999 г. - М., 1999.
6. Косенко, Л.В. Воздействие лектина гороха на клу еньковые актерии гороха при их росте на различном азотном фоне / Л.В .Косенко, Л.Д.Вабанец, Н.В.Мандровская // Тезисы докладов на VI съезде о бщества физиол. раст., Москва, 4-9 окт. 1999 г. - М., 1999.
7. Кнорре, А.Г. Биологическая химия / А.Г.Кнорре, С.Д.Мызина. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Высшая школа. - 1998.- 479 с.
8. Методы иохимического исследования растений / А.И.Ермаков [и др.]. - 3-е изд., перера б. и доп. - Л.: Агропромиздат, 1987. - 430с
9. Lis, H. Lectins as molecules and as tools / H.Lis, N.Sharon // Ann. Rev. Biochem. - 1986.-V.55. - P.35-42.
10. Sharon, N. How protein bind carbohydrates: lessons from legume lectins / N.Sharon, H.Lis // J. agr. Food Chem. - 2002. - Vol. 50, № 22. - P.6691-6886.
качества семян и зараженность гороха сорта Вега
Препарат Энер гия про- рас- тания Всхожесть,% Зара- жен- ность семян
Лабо- ратор- ная По- левая
Контроль (вода) 86,6 84,8 85,8 33,3
Контроль (Нацисс,1л/т) 87,5 91,3 91,5 9,6
Лель,10-4% 88,5 84,1 84,8 34,9
Лель. 10-5% 87,0 93,2 91,1 29,0
Т а блица 2 - Активность пероксидазы в проростках ______________ гороха, (у. е.)____________________
Варианты Здоровые Инфици- рованные (Fusfrium oxyspo- rum)
Через сутки Через сутки Через 7 суток
Контроль 74,5 71,3 100,3
Ингибиторы 10-3 % 93,5 100,0 187,0
Ингибиторы 10-4 % 81,7 75,0 150,0
