CC BY
71
УДК 66-987: 66-988: 66-963
Инновационные технологии функциональных продуктов с применением высокого давления для сохранения нативной структуры белков
Банникова Анна Владимировна, кандидат технических наук, доцент, учебно-научно-испытательная лаборатория по определению качества пищевой и с.-х. продукции
e-mail:[email protected]
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Cаратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
Евдокимов Иван Алексеевич, доктор технических наук, профессор института живых систем, кафедра прикладной биотехнологии
e-mail: [email protected]
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Кавказский федеральный университет»
Аннотация. Представлено исследование по влиянию высокого давления на вторичную конформацию глобулярных белков. Показано, что благодаря этому методу создается белковая структура с нативной конформацией в конденсированных системах. Исследования способствуют фундаментальному пониманию изменения свойств белковых систем после применения высокого давления, что является основой для развития этого метода для получения функциональных белковых ингредиентов с потенциальным промышленным интересом в технологиях продуктов питания.
Ключевые слова: белки, нативная конформация, денатурация, высокое давление.
За последние два десятилетия обработка высоким давлением была показана в качестве способа сохранения продуктов от микробиологической порчи, однако отмечается и изменение физических и функциональных свойств пищевых систем [1, 2]. Контроль температуры процесса обработки высоким давлением является важным фактором, влияющим на изменение ряда свойств продуктов, включающих стабильность белка, жира, переход в гель или кристаллическое состояние, а также на равномерное распределение давления в целях инактивации нежелательных микробов и ферментов [3].
Конструкция аппарата высокого давления включает в себя сосуд высокого давления, нагнетательную систему - насос гидростатического давления или интен-сификаторы высокого давления, устройство для нагрева/охлаждения и хранения продукта [4, 5]. В аппарате высокого давления происходит изменение физических свойств воды, например, объем воды под действием высокого давления уменьшается до 4 % при 100 МПа или до 15 % при 600 МПа [6].
Для оценки процесса денатурации белков под действием высокого давления была предложена фазовая диаграмма «давление -температура» (Р-Т) [7], которая позволяет определить область давления и температуры, в которой нативная структура белка не меняется (рисунок 1).
Одним из практических применений Р-Т диаграммы является понимание стабилизации пищевых систем, а также денатурации белка под воздействием тепла или высокого давления [6]. Зона I является областью, в которой денатурация белка происходит при более низких давлениях и низких температурах. Зона II - это область ниже максимальной температуры перехода, в которой происходит денатурация белка при низких температурах с использованием более высоких давлений. Зона III характеризует область высоких температур, в которой происходит денатурация при увеличении давления [7]. Таким образом, Р-Т диаграмма иллюстрирует режимы, при которых будет происходить потеря нативной структуры белка или ферментативной активности. Литературные данные свидетельствуют, что обработка под высоким давлением при низкой температуре представляет ин-
I
II
III
Температура, °С
Рисунок 1. Общая схема фазовой диаграммы «давление- температура»
терес для пищевой промышленности в связи с высокой микробной инактивацией и сохранением большей части нативных физико-химических и органолептических свойств продукта [8].
Исследователи подразделяют функциональные свойства пищевых белков на три основные группы [7, 9]: свойства гидратации, адгезии, растворимости, вязкости, дисперсности, водопоглощения; межфазные свойства, включающие поверхностное натяжение, эмульгирование и пенообразующие характеристики; свойства агрегации и гелеобразования. Улучшение функциональных свойств белков, по мнению авторов [10], может быть достигнуто путем модификации структуры белка химическими или ферментативными методами, а также с помощью физической обработки. Исходные свойства обрабатываемой системы, включающие концентрацию белка, рН, активность воды, температуру и высокое давление, влияют на степень модификации белковой молекулы. Увеличение давления и времени, как правило, приводит к большим изменениям в структуре белков [11].
Денатурация белка под действием высокого давления представляет собой сложный процесс, который в первую очередь приводит к образованию водородных и нарушению гидрофобных связей, а также к увеличению электростатического взаимодействия внутри молекулы [7, 10]. Наиболее слабые нековалентные связи между аминокислотными остатками, поддерживающие третичную структуру белка, сначала дестабилизируются при высоком давлении, а затем заменяются на гидрофильные связи [12]. Увеличение гидростатического давления приводит к проникновению молекул воды во внутреннее пространство белка, постепенно заполняя «пустоты», что, в конечном счете, разрушает структуру молекулы белков. Помимо этого, высокое давление влияет на нековалентные взаимодействия внутри белковой молекулы с последующим повторным образованием внутри- и межмолекулярных связей, а также между молекулами белка. Известно, что для разрушения одной дисульфидной группы белковой молекулы требуется около 50,9 ккал/моль, в то время как энергия 81,1 ккал/моль и 98,8 ккал/моль дестабилизирует ^Н- и -СН - группы, соответственно [13]. Отмечено, водородные связи в меньшей степени чувствительны к давлению, что приводит к сохранению вторичной структуры белка.
На протяжении последних лет были проведены исследования по влиянию высокого давления на эмульгирующие и пенообразующие свойства глобулярных белков. Результаты подтверждают, что происходит снижение эффективности эмульгирования р-лактоглобулина после обработки высоким давлением по сравнению с эмульсиями, образованными нативным белком [9]. Ряд авторов считает, что изменение эмульгирующей способности р-лактоглобулина под действием высокого давления зависит от концентрации белка в системе, обосновывая это тем, что образцы с высоким содержанием белка (1,5 мг/мл) не показали изменение функциональных свойств [14].
Исследования влияния высокого давления на свойства эмульгирующей и ге-леобразующей способности показали, что высокое давление до 300 МПа не влияет на эмульгирующую способность белков плазмы крови, в то время как давление выше 400 МПа приводит к изменению рН. Например, при рН 6,5, высокое давление в 400 МПа повышало эмульгирующие свойства белков плазмы крови, не влияя при этом на гелеобразующие свойства. Однако при понижении кислотности до рН 5,5 и повышении давления наблюдалось ухудшение эмульгирующей способности белков крови вместе с существенными изменениями в текстуре.
Влияние высокого давления на пенообразующие свойства молочных белков описано с позиции получения новых текстур путем образования молочных гелей и эмульсий. Пенообразующие свойства сывороточного белка улучшаются при рН (6,0-7,0) в связи с увеличением гидрофобности белка при обработке высоким давлением [10]. Известно, что стабильность пены р-казеина, полученной при давлении 300 МПа, повышается, по сравнению со свойствами пены нативного р-казеина. Однако обработка давлением до 900 МПа в течение 30 мин приводит к существенному изменению структуры р-казеина, что сопровождается ухудшением функциональных свойств данных белков [14]. Некоторые белки претерпевают обратимые изменения при давлении 100—200 МПа, в то время как более высокое давление (> 200 МПа) вызывает необратимые изменения в структуре белковой молекулы. Таким образом, изменения функциональных свойств белков после применения высокого давления зависят от целого ряда факторов, включающих начальный уровень давления, температуру и время обработки, тип белка, концентрацию в системе, рН и ионную силу [7, 10].
Учитывая, что высокое давление является инновационной нетермической технологией, позволяющей получать пищевые продукты с улучшенной функциональностью, нами были проведены исследования по влиянию высокого давления на свойства глобулярных белков в системах с относительно низким содержанием сухих веществ (<10 %). В литературе до настоящего времени отсутствует молекулярное понимание структурных и функциональных свойств конденсированных глобулярных белков под действием высокого давления. Таким образом, цель настоящей работы — оценить влияние высокого давления на вторичную конформа-цию глобулярных белков при более высоких концентрациях. Это, в первую очередь, позволит определить степень изменения вторичной структуры, связанной с
и V V/ ■ ■ и |
частичной или полной денатурацией. На основании анализа априорной информации по применению высокого давления [1-4, 6, 11, 12, 17], параметров обработки аналогичных белковых систем, в т.ч. глобулярных белков [7-10, 13, 14, 16], а также с учетом предварительных исследований высококонцентрированных белковых композиций [15, 18, 19] нами были выбраны следующие технологические параметры: давление (600 ± 0,2) МПа; продолжительность обработки (15±1) мин; температура обработки (22±2) °С.
В качестве функциональной белковой составляющей нами выбраны сывороточные белки, которые содержат биологически активные компоненты — иммуноглобулины, обладающие защитным эффектом против инфекционных заболеваний [15]. По сравнению с синтетическими и полусинтетическими антибиотиками, иммуноглобулины имеют более низкую стоимость, но самое главное, — они обладают высокой эффективностью, основанной на поликлональной конформации и минимальном влиянии на микрофлору кишечника человека.
Поэтому, включение иммуноглобулинов в пищевые продукты и нутрицевтики требует понимания механизмов взаимодействия и устойчивости к различным условиям обработки, которые используются в пищевой промышленности.
Было изучено влияние высокого гидростатического давления на структурные свойства конденсированных образцов иммуноглобулинов (>60 %). Температура денатурации белка контролировалась с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Были подготовлены две аналогичные серии образцов систем иммуноглобулинов. Образцы, не прошедшие обработку высоким давлением, показывали типичные эндотермические пики при нагревании от 35 до 95 °С со скоро-
стью 2 °С/мин [16] (рис. 2). Для сравнения на рисунке 2 показаны термограммы и для образцов систем иммуноглобулинов, обработанных высоким давлением (концентрация от 60 до 80 %), на которых видны четкие эндотермические пики. По нашему мнению, данное явление характеризует сохранение вторичной конформации белковой молекулы, обработанной высоким давлением. Устойчивость к высокому давлению может быть объяснена отсутствием свободных SH-групп, что вероятно инициирует молекулярные перегруппировки [17], а также относительно высокой молекулярной массой иммуноглобулинов.
Рисунок 2. ДСК-термограммы 60 (□■), 70 (❖♦) и 80 % (ДА) образцов иммуноглобулинов при нагревании от 35 до 90 °С со скоростью 2 °С / мин при атмосферном давлении (открытые символы) и при высоком давлении 600 МПа в течение 15 мин (закрытые символы)
Устойчивость к высокому давлению сывороточного альбумина коррелируется с наличием 17 дисульфидных связей, которые стабилизируют его трехмерную структуру [13]. Степень денатурации белка была оценена с учетом измерения температуры денатурации и оценки вторичной конформации методом ИК-спектроскопии
Из рисунка 3 видно, что в обоих случаях имеются четко определенные пики денатурации, но с некоторыми изменениями в размере и диапазоне температур, отражающих основные характеристики эндотермического процесса. В целом, обработка высоким давлением проявляла частичный эффект на морфологию и вторичную структуру сывороточного альбумина.
1.0
-2.0
60 65 70 75 80 85 90 95 Температура (°С)
[18, 19]
0.42
0.12 -,-,-,-,-,-,-
10 20 30 40 50 60 70 80
% концентрации белка
Рисунок 3. Изменение оптической плотности в зависимости от концентрации образцов, испытанных при атмосферном давлении (А), после обработки при 600 МПа в течение 15 мин (▲) и после термической обработки при 85 °С в течение 20 мин (О) в ИК-спектроскопии.
Экспериментальные наблюдения показали, что иммуноглобулины и сывороточный альбумин сохраняют вторичную структуру при воздействии высокого давления. Было высказано предположение, что данное явление связано с отсутствием свободных SH-групп, и относительно высокой молекулярной массой иммуноглобулина, тогда как стабильность к высокому давлению сывороточного альбумина обусловлено наличием 17 дисульфидных групп в молекуле.
Таким образом, проведенные исследования показывают перспективы в создании инновационных функциональных продуктов за счет обработки высоким давлением сывороточных белков, которые потом используются в качестве замены термически обработанных концентратов и изолятов. Сывороточные белки, обработанные высоким давлением, использованы для модификации технологических и сенсорных свойств молочных продуктов (молока питьевого, кисломолочных напитков, десертов), а также при экспериментальных выработках сухих завтраков, каш и батончиков.
Список литературных источников
1. Cheftel, J.C. High-pressure, microbial inactivation and food preservation / J.C. Cheftel // Food Science and Technology International. — 1995. - 1. - P. 75-90.
2. Farkas, D.F. & Hoover, D.G. High pressure processing / D.F. Farkas & D.G. Hoover // Journal of Food Science Supplement: Kinetics of microbial inactivation for alternative food processing technologies. - 2001. - 65. — P. 47-64.
3. Otero, L., & Sanz, P.D. Modelling heat transfer in high pressure food processing: A review / L. Otero & P.D. Sanz // Innovative Food Science and Emerging Technologies. - 2003. - №4. - P. 121-134.
4. San Martin, M.F., Barbosa-Canovas, G.V., & Swanson, B.G. Food processing by high hydrostatic pressure / M.F. San Martin, G.V. Barbosa-Canovas & B.G. Swanson // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. - 2002. — 42(6). - P.627-645.
5. Torres, J.A. & Velazquez, G. Commercial opportunities and research challenges in the high pressure processing of foods / J.A. Torres & G. Velazquez // Journal of Food Engineering. - 2005. - №67. — P. 95-112.
6. Heremans, K. (2002). Effects of high pressure on biomaterials / K. Heremans //
In: Ultra High Pressure Treatments of Foods, Hendrickx, M.E.G., & Knorr, D. (Eds). -New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002. - Pp. 23-51.
7. Messens, W. The use of high pressure to modify the functionality of food proteins / W. Messens, J. Van Camp & A. Huyghebaert // Trends in Food Science & Technology.
- 1997. - 8. - P. 107-112.
8. Dumay, E.M. High pressure-low temperature processing of food proteins / E.M. Dumay, L. Picart, S. Regnault & M. Thiebaud // Biochimica et Biophysica Acta. — 2006.
- 1764(3). — P. 599-618.
9. Galazka, V. B. Influence of high pressure processing on protein solutions and emulsions / V. B. Galazka, E. Dickinson & D. A. Ledward // Current Opinion in Colloidal and Interface Science. - 2000. - №5. - P. 182-187.
10. Ibanoglu, E., & Karatas, S. High pressure effect on foaming behaviour of whey protein isolate / E. Ibanoglu & S. Karatas // Journal of Food Engineering. - 2001. - 47.
- P. 31-36.
11. Jaenicke, R. & Zavodszky, P. (1990). Proteins under extreme physical conditions // R. Jaenicke & P. Zavodszky // FEBS Letters. - 1990. - 268(2). - P. 344-349.
12. High pressure effects on protein structure and function / V. Mozhaev, K. Heremans, J. Frank, P. Masson & C. Balny // Proteins: Structure, Function and Genetics. - 1996. -24. - P. 81-91.
13. Hayakawa, I. Denaturation of bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin by high pressure, heat and chemicals / I. Hayakawa, J. Kajihara, K. Morikawa, M. Oda & Y. Fujio // Journal of Food Science. - 1992. - 57(2). - P. 288-292.
14. Pittia, P. Functional and structural properties of p-lactoglobulin as affected by high pressure treatment / P. Pittia, P.J. Wilde, F.A. Husband & D.C. Clark // Journal of Food Science. - 1996. - 61(6). - p. 1123-1128.
15. Банникова, А.В. Функционально-технологические свойства сывороточных белковых продуктов: влияние изменений условий среды и вида обработки / А.В. Банникова, И.А. Евдокимов // Молочная промышленность. - 2014. - №11. - С. 100102.
16. George, P. Effect of high hydrostatic pressure on structural properties and bioactivity of immonoglobulins extracted from whey protein / P. George, A. Bannikova, N. Mantri, S. Kasapis, M. Palmer & B. Meurer // Food Hydrocolloids. - 2013. - №32. -Рр. 286-293.
17. Felipe, X. Comparison of the effects of high-pressure treatments and heat pasteurization on the whey proteins in goat's milk / X. Felipe, M. Capellas & A.J.R. Law // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 1997. - №45. - Рр. 627-631.
18.Savadkoohi, S. Structural behavior in condensed bovine serum albumin systems following application of high pressure / S. Savadkoohi, A. Bannikova, S. Kasapis, B. Adhikari // Food Chemistry. - 2014. - 150. - p. 469-476.
19. Банникова, А.В., Евдокимов, И.А. Инновационный подход к созданию обогащенных молочных продуктов с повышенным содержанием белка / А.В. Банникова, И.А. Евдокимов. — М.: ДеЛи Плюс, 2015. - 136 с.
References:
1. Cheftel, J.C. High-pressure, microbial inactivation and food preservation / J.C. Cheftel // Food Science and Technology International. - 1995. - 1. - P. 75-90.
2. Farkas, D.F. & Hoover, D.G. High pressure processing / D.F. Farkas & D.G. Hoover // Journal of Food Science Supplement: Kinetics of microbial inactivation for alternative
food processing technologies. - 2001. - 65. - P. 47-64.
3. Otero, L., & Sanz, P.D. Modelling heat transfer in high pressure food processing: A review / L. Otero & P.D. Sanz // Innovative Food Science and Emerging Technologies.
- 2003. - 4. - P. 121-134.
4. San Martin, M.F., Barbosa-Canovas, G.V., & Swanson, B.G. Food processing by high hydrostatic pressure / M.F. San Martin, G.V. Barbosa-Canovas & B.G. Swanson // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. - 2002. - 42(6). - P.627-645.
5. Torres, J.A. & Velazquez, G. Commercial opportunities and research challenges in the high pressure processing of foods / J.A. Torres & G. Velazquez // Journal of Food Engineering. - 2005. - 67. P. 95-112.
6. Heremans, K. (2002). Effects of high pressure on biomaterials / K. Heremans // In: Ultra High Pressure Treatments of Foods, Hendrickx, M.E.G., & Knorr, D. (Eds). -New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002. - pp. 23-51.
7. Messens, W., Van Camp, J., & Huyghebaert, A. The use of high pressure to modify the functionality of food proteins / W. Messens, J. Van Camp & A. Huyghebaert // Trends in Food Science & Technology. - 1997. - 8. - P. 107-112.
8. Dumay, E.M. High pressure-low temperature processing of food proteins / E.M. Dumay, L. Picart, S. Regnault & M. Thiebaud // Biochimica et Biophysica Acta. - 2006.
- 1764(3). - P. 599-618.
9. Galazka, V. B., Dickinson, E. & Ledward, D. A. Influence of high pressure processing on protein solutions and emulsions / V. B. Galazka, E. Dickinson & D. A. Ledward // Current Opinion in Colloidal and Interface Science. - 2000. - 5. - P. 182-187.
10.Ibanoglu, E., & Karatas, S. High pressure effect on foaming behaviour of whey protein isolate / E. Ibanoglu & S. Karatas // Journal of Food Engineering. - 2001. - 47.
- P. 31-36.
11.Jaenicke, R. & Zavodszky, P. (1990). Proteins under extreme physical conditions // R. Jaenicke & P. Zavodszky // FEBS Letters. - 1990. - 268(2). - P. 344-349.
12.Mozhaev, V. High pressure effects on protein structure and function / V. Mozhaev, K. Heremans, J. Frank, P. Masson & C. Balny // Proteins: Structure, Function and Genetics. - 1996. - 24. - P. 81-91.
13.Hayakawa, I. Denaturation of bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin by high pressure, heat and chemicals / I. Hayakawa, J. Kajihara, K. Morikawa, M. Oda & Y. Fujio // Journal of Food Science. - 1992. - 57(2). - P. 288-292.
14.Pittia, P. Functional and structural properties of p-lactoglobulin as affected by high pressure treatment / P. Pittia, P.J. Wilde, F.A. Husband & D.C. Clark // Journal of Food Science. - 1996. - 61(6). - p. 1123-1128.
15.Bannikova, A.V., Evdokimov, I.A. Functional and technological properties of whey protein products: influence of changes in environmental conditions and kind of treatment. Molochnaya promyshlennost' [Dairy Industry], 2014, no.11, pp. 100-102 (in Russian).
16.George, P. Effect of high hydrostatic pressure on structural properties and bioactivity of immonoglobulins extracted from whey protein / P. George, A. Bannikova, N. Mantri, S. Kasapis, M. Palmer & B. Meurer // Food Hydrocolloids. - 2013. - 32. - p. 286-293.
17.Felipe, X., Capellas, M., & Law, A.J.R. Comparison of the effects of high-pressure treatments and heat pasteurization on the whey proteins in goat's milk / X. Felipe, M. Capellas & A.J.R. Law // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 1997. - 45. - p. 627-631.
18.Savadkoohi, S. Structural behavior in condensed bovine serum albumin systems following application of high pressure / S. Savadkoohi, A. Bannikova, S. Kasapis, B. Adhikari // Food Chemistry. - 2014. - 150. - p. 469-476.
19.Bannikova, A.V., Evdokimov, I.A. Innovatsionnyy podkhod k sozdaniyu obogashchennykh molochnykh produktov s povyshennym soderzhaniem belka [Innovative approach to producing enriched dairy products with a higher protein content]. Moscow, DeLi Plyus Publ., 2015.136p.
Innovation technologies of functional products with high pressure application for preserving native protein structure
Bannikova Anna Vladimirovna, Candidate of Science (Technics), Associate Professor of the Science-Training-Research Laboratory of Food and Agricultural Quality Determination
e-mail:[email protected]
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Vavilov State Agrarian University of Saratov
Evdokimov Ivan Alekseevich, Doctor of Science (Technics), Professor of the of the Living System Institute, Applied Biotechnology Chair
e-mail: [email protected]
Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Professional Education the North-Caucasus Federal University
Abstract: The article presents the research dealing with the high pressure effect on the secondary conformation of globular proteins. It is shown that this method allows obtaining a protein structure with native conformation in condensed systems. The research contributes to the fundamental understanding of the changes in the protein system properties due to high pressure application, which serves as the basis for this method development intended at getting functional protein ingredients with potential industrial interest in food technology.
Keywords: proteins, native conformation, denaturation, high pressure
