CC BY
60
doi: 10.24411/0235-2451-2020-11203 УДК 632.4 + 632.9 + 547.341
инновационные способы подавления микозов растений: подходы, решения, перспективы
п. п. муковоз, с. а. Пешков, т. в. левенец, а. н. сизенцов, а. в. квитко, а. п. глинушкин
Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, ул. Институт, вл. 5, р.п. Большие Вяземы, Одинцовский р-н, Московская обл.,143050, Российская Федерация
резюме. С целью изучения возможности подавления микозов фумигационным способом, разработаны биологически активные композиции на основе соединений, синтезированных по оригинальным методикам, синтетических фунгицидов из группы азолов, а также природных антимикотиков из группы полиенов, полученных путем микробной ферментации бактерий рода Streptomyces, с последующей экстракцией супернатантов и препаративной колоночной хроматографией экстрактов. Разработаны пиротехнические составы фумигационного действия, включающие действующие вещества биологически активных композиций (23...46 %), окислитель (22...56 %), горючие вещества (15...56 %), пламягасители (14...34 %), флегматизаторы (6.20 %) и разрыхлители (4.8 %). Методами компьютерного моделирования в приближении B3LYP/DZP с использованием пакета программ ChemCraft и FireFly изучена устойчивость комплексов синтезированных соединений с предполагаемыми клеточными мишенями: эргостеролом; эргостеролзависимыми мембранными Na+/K+-АТФ-азами; 14-деметилазами, контролирующими превращение ланостерола в эргостерол; сквален-монооксигеназами, катализирующими синтез скваленэпоксидазы - прекурсора ланостерола. Соединения, имеющие нитрогруппы в молекуле, избирательно координируются с участком мембранного фермента Na+/K+-АТФ-азы, отвечающим за фосфорелирование и связывание с АТФ. Атом азота синтезированных бензоксазинов избирательно координируется с железом гемма 14а-деметилазы, а энергия связывания комплекса значительно ниже, энергии координации железа с остатком цистеина белкового матрикса фермента. При концентрации 16.500 мкг/мл синтезированные соединения обладают фунгицидной активностью в отношении тест-культур Fusauium graminearum, Alternarium alternata, Bipolaris soraciniana, сравнимой с активностью препаратов фитолавин и превикур. Образцы пиротехнических зарядов фумигационного действия обладают фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов F. graminearum, A. alternata, B. soraciniana с эффективностью подавления тест-культур 23.69 %. При использовании пиротехнических зарядов на пшенице, пораженной тестируемыми культурами, их гибель находилась в пределах 12.31 %.
ключевые слова: фумигация, молекулярный докинг, биотестирование, клеточная мишень, лиганд, фунгициды. Сведения об авторах: П. П. Муковоз, кандидат химических наук, зав. лабораторией (е-mail: mpp27@mail.ru); С. А. Пешков, кандидат химических наук, научный сотрудник; Т. В. Левенец, кандидат химических наук, младший научный сотрудник; А. Н. Сизенцов, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник; А. В. Квитко, доктор юридических наук, руководитель центра; А. П. Глинушкин, доктор сельскохозяйственных наук, член-корреспондент РАН, директор.
для цитирования: Инновационные способы подавления микозов растений: подходы, решения, перспективы / П. П. Муковоз, С. А. Пешков, Т В. Левенец и др. // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т 34. № 12. С. 19-27. doi: 10.24411/0235-2451-2020-11203.
Innovative ways to suppress plant mycoses: approaches, solutions, prospects
P. P. Mukovoz, S. A. Peshkov, T. V. Levenets, A. N. Sizentsov, A. V. Kvitko, A. P. Glinushkin
All-Russian Research Institute of Phytopathology, ul. Institut, vl. 5, r.p. Bol'shie Vyazemy, Odintsovskii r-n, Moskovskaya obl.,143050, Russian Federation
Abstract. To study the possibility of suppressing mycoses by fumigation we developed biologically active compositions. They are based on compounds synthesized according to original methods, synthetic fungicides from the azole group, as well as natural antimycotics from the group of polyenes obtained by microbial fermentation of bacteria of the genus Streptomyces, followed by extraction of supernatants and preparative column chromatography of extracts. We developed pyrotechnic fumigation compositions including active substances of biologically active compositions (23-46%), an oxidizer (22-56%), combustible substances (15-56%), flame suppressors (14-34%), phlegmatizers (6-20%), and leavening agents (4-8%). The stability of complexes of the synthesized compounds with the putative cellular targets was studied by the methods of computer modelling in the B3LYP/DZP approximation using ChemCraft and FireFly software packages. The targets included ergosterol; ergosterol-dependent membrane Na+/K+-ATPases; 14alpha-demethylases, which control the conversion of lanosterol to ergosterol; and squalene monooxygenases that catalyze the synthesis of squalene epoxidase, a precursor of lanosterol. Compounds with nitro groups in the molecule selectively coordinate with the site of the membrane enzyme of Na+/K+-ATPase, which is responsible for phosphorylation and binding to ATP. The nitrogen atoms of the synthesized benzoxazines selectively coordinate with the gem iron of 14alpha-demethylase; the binding energy of the complex is much lower than the energy of coordination of iron with the cysteine residue of the protein matrix of the enzyme. At the concentration of 16-500 ug/mL, the synthesized compounds exhibit fungicidal activity against test cultures of Fusarium graminearum, Alternaria alternata, and Bipolaris sorokiniana, comparable to the activity of phytolavin and previcur preparations. Samples of pyrotechnic fumigation charges are fungicidally active against phytopathogenic fungi F. graminearum, A. alternata, and B. sorokiniana with an efficiency of suppressing test cultures of 23-69%. Pyrotechnic charges killed 12-31% of the tested cultures on wheat. Keywords: fumigation; molecular docking; biotesting; cellular target; ligand; fungicides.
Author Details: P. P. Mukovoz, Cand. Sc. (Chem.), head of laboratory (е-mail: mpp27@mail.ru); S. A. Peshkov, Cand. Sc. (Chem.), research fellow; T. V. Levenets, Cand. Sc. (Chem.), junior research fellow; A. N. Sizentsov, Cand. Sc. (Biol.), junior research fellow; A. V. Kvitko, D. Sc. (Jur.), director ot the center; A. P. Glinushkin, D. Sc. (Agr.), Corresponding member of the rAs, director. For citation: Mukovoz PP, Peshkov SA, Levenets TV, et al. [Innovative ways to suppress plant mycoses: approaches, solutions, prospects]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2020;34(12):19-27. Russian. doi: 10.24411/0235-2451-2020-11203.
Микозы - наиболее широко распространенные заболевания растений, на долю которых приходится больше 80 % всех других болезней [1, 2]. В связи с изложенным их следует считать одной из главных проблем защиты сельскохозяйственных культур, представляющих реальную угрозу продовольственной безопасности страны. Этому способствует быстрота распространения,
трудности с диагностикой и лечением, а также такие отличительные особенности грибов, как осмотрофия, наличие клеточной стенки, уникальный химический состав специализированной липидной мембраны [3], наличие протекторных осмолитов [4] и большая гетерогенность, проявляющаяся в искусственности их систематик. Борьбе с микозами посвящены исследования классической микологии, фитопатологии,
биохимии, в том числе с применением молекулярных методов, позволяющих решать проблемы таксономического статуса видов, точной диагностики возбудителей болезней растений, а также проводить молекулярную паспортизацию фитопатогенов [5, 6]. В этой связи, следует особо отметить ключевую роль отечественных научно-исследовательских организаций, сформировавших методологическую основу многих классических методов защиты растений от микозов [7, 8, 9]. Так, концепция интегрированной защиты растений, ранее считавшаяся инновацией, сегодня - общепризнанный раздел, определяющий основы комплексного использования различных приемов, средств и методов, направленных на обеспечение фитосанитарногоблагополучия территории [10]. Созданные в ФГБНУ ВНИИФ композитные препараты, эффективные против резистентных к фунгицидам фитопатогенов, - коммерческий продукт, широко применяемый в агротехнологиях [11].
В то же время, такие современные методы, как молекулярный докинг, дискрипторный подход, виртуальный скрининг, фармакофорный анализ и др. [12, 13, 14], продолжают использовать, в основном, при разработке фармацевтических препаратов в рамках медицинской химии и практически не применяют в аграрном секторе [15, 16]. Это подчеркивает многогранность проблемы микозов при отсутствии универсальных методов борьбы с ними.
В связи с изложенным, ключевое условие разработки способов подавления микозов растений -интегрированный подход, позволяющий выработать основные стратегии, объединяющие наиболее эффективные классические методы защиты растений с современными методами медицинской химии и инновационными решениями в сфере применения различных средств борьбы с фитопатогенами.
Наиболее широко в защите растений от микозов используют химический метод, основанный на применении фунгицидов [17]. При всех его недостатках (повышение резистентности патогенных организмов, накопление остаточных количеств пестицидов в окружающей среде, загрязнение ими продуктов питания и др.), этот подход характеризуется высокой производительностью, биологической и экономической эффективностью, значительной скоростью воздействия и, в целом, на сегодня не имеет эффективной альтернативы [18, 19]. Кроме того, химический метод постоянно совершенствуется: опасные препараты заменяют на малотоксичные, стойкие пестициды -на быстро разлагающиеся, технологии применения химических препаратов улучшаются. В частности, чередование препаратов разных классов и с различным механизмом действия, а также специальная техника для малообъемного использования, позволяют значительно снизить риски возникновения устойчивости к пестицидам и повысить эффективность их применения. Совместная обработка синтетическими препаратами в сочетании с экологически безопасными природными соединениями, выделенными из различных источников (растительного сырья, продуктов ферментации микроорганизмов и др.), позволяет не только снизить риски накопления остаточных количеств пестицидов в окружающей среде, но и выявить новые эффекты взаимного влияния соединений различной природы на патогены или обрабатываемые культуры и, в конечном итоге, на качество сельскохозяйственной продукции [20].
Из современных методов медицинской химии в первую очередь следует отметить молекулярный докинг, в основе которого лежит концепция «мишень/ лиганд/активность». При наличии известной мишени (белка-рецептора, фермента, мембранного канала, ДНК, РНК и некоторых других субклеточных структур) методом докинга выстраивается модель будущего лиганда (молекулы или ее фрагмента), образующего с клеточной мишенью (далее - КМ) комплекс, приводящий к ее нокауту или блокаде какого-либо биохимического пути, критичного для дальнейшей жизнедеятельности клетки. Однако КМ не всегда известна, и ключевой аспект на первоначальном этапе такой работы - идентификация (или валидация) КМ патогена, в основе которой лежит компьютерный прогноз, позволяющий сузить реестр возможных объектов нокаута на основании структурного подобия с известными мишенями, а также прогноз биологического действия предполагаемого лиганда (соединения) на основании структурного подобия с известным препаратом (лекарством).
Следует отметить, что хотя рынок современных фунгицидов представлен большим разнообразием продукции, основа большинства противогрибковых препаратов - азагетероциклические структуры, в состав которых входит атом азота: замещенные пиримидины, триазолы, бензоимидазолы и др. [21]. Отмеченные структурные особенности фунгицидов указывают и на определенное сходство в КМ грибов, что может быть использовано при установлении строения неизвестных мишеней. Так, азотсодержащие фунгициды действуют, в первую очередь, на клеточные покровы грибов (связывание с эргостеро-лом - основным структурным элементом мембраны или ингибирование ферментов, отвечающих за его синтез; связывание с мембранными АТФ-азами, приводящее к нарушению целостности мембраны; ингибирование ферментов, отвечающих за синтез глюканов, хитина и маннопротеинов - структурных компонентов клеточной стенки), что сужает перечень потенциальных КМ, облегчая работы по определению их пространственной структуры.
При рассмотрении инновационных способов применения средств борьбы с фитопатогенами особо следует отметить метод фумигации. В отличие от традиционных (опрыскивание, опыливание, внесение в почву и др.), он дает возможность химическому агенту находиться длительное время в виде мелкодисперсного аэрозоля, что при определенной температуре и давлении сохраняет его летальную концентрацию для патогена в окружающей среде [22]. Следует также отметить, что при определенных недостатках (термической или окислительной деструкции пестицида, жестких требованиях к его физико-химическим характеристикам - температуре кипения, возгонки и др.) метод фумигации обладает очень важным преимуществом - используемый пестицид не требует разведения и переносится к объекту обработки в неразбавленной форме, что гарантировано приводит к нокауту мишени, снижая риски развития резистентности патогена и значительно повышая эффективность обработки.
Цель исследований - разработка инновационного подхода к подавлению микозов фумигационным способом, интегрированного с химическим методом и современными методами медицинской химии, позволяющего эффективно бороться с грибковыми
заболеваниями сельскохозяйственных растений, составляющих основу продовольственной безопасности страны.
Основные задачи исследования были следующими: 1) синтез азагетероциклических структур, обладающих структурным родством с известными фунгицидами; 2)установление строения полученных соединений; 3) проведение предварительного компьютерного прогноза биологической активности синтезированных соединений (далее - СС); 4) изучение физико-химических характеристик СС; 5) молекулярный компьютерный докинг предполагаемых КМ патогена и СС на предмет устойчивости комплексов мишень/лиганд; 6) биотестирование СС in vitro на наличие фунгицидной активности в отношении тест-культур фитопатогенных грибов; 7) выделение природных фунгицидов и антимикотиков, продуцируемых бактериями различных систематических групп; 8) составление биологически активных композиций (далее - БАК), включающих СС, природные и синтетические фунгициды; 9) разработка пиротехнических составов, позволяющих проводить фумигационную возгонку СС и БАК на их основе; 10) разработка экспериментальных образцов пиротехнических зарядов (далее - ПЗ) фумигационного действия и апробация их эффективности в отношении фитопатогенных грибов.
Условия, материалы и методы. Материалом для исследований служили алкиловые эфиры (2Z)-2-[(2,4-динитрофенил)гидразоно]бутандиовой кислоты 1 а-f (Alk = Me, 1a; Et, 1b; Pr, 1c; i-Pr, 1d; Bu, 1e; t-Bu, 1f), алкиловые эфиры (2^)-2,2'-(2-гидрокси-2Н-1,4-бензоксазин-2-ил-3-илиден)диуксусной кислоты 2а^ (Alk = Me, 2a; Et, 2b; Pr, 2c; Bu, 2d), алкиловые эфиры (2'Z )-2,2'-(2-гидрокси-7-нитро-2Н -1,4-бензоксазин-2-ил-3-илиден)диуксусной кислоты 2e-h (Alk = Me, 2e; Et, 2f; Pr, 2g; Bu, 2h) и алкиловые эфиры (2Z )-(2-оксо-2H-1,4-бензоксазин-3(4H )-илиден)уксусной кислоты За-d (Alk = Me, 3a; Et, 3b; Pr, 3c; Bu, 3d), синтезированные по оригинальным [23, 24, 25] и модифицированным [26, 27, 28] методикам, разработанным в лаборатории органического синтеза ФГБНУ ВНИИФ [29, 30, 31]. Строение соединений 1а-^ 2а-1п, 3а^ было установлено по данным ИК спектроскопии, спектроскопии ЯМР 1H, 13C, 2D-спектроскопии ЯМР 1Н-1Н (NOESY), 1Н-13С (HMBC), масс-спектрометрии высокого разрешения и рент-геноструктурного анализа (РСА). Предварительный прогноз биологической активности синтезированных соединений выполняли с использованием пакета программ PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) Professional software package [32].
Для компьютерного моделирования устойчивости комплексов «мишень/лиганд» в качестве модельных структур были выбраны первые члены гомологического ряда СС - соединения 1a, 2a, 2e, 3a, в качестве предполагаемых КМ следующие структуры:
1) эргостерол, ассоциированный с мембранными ферментами и выполняющий барьерную функцию;
2) связанные с эргостеролом мембранные Na+/K+-АТФ-азы, отвечающие за калий/натриевый баланс клетки; 3) 14а-деметилазы ланостерола (CYP51A1), контролирующие превращение ланостерина в 4,14-диметилэргостатриенол на одной из стадий биосинтеза эргостерола; 4) сквален-монооксигеназы, катализирующие превращение сквалена в сквале-нэпоксидазу - прекурсор ланостерола. Структур-
ные данные геометрических параметров активных центров соответствующих ферментов брали из базы данных белковых молекул Protein Data Bank (PDB) [33]. Построение исследуемых структур СС, их дальнейшую оптимизацию, а также анализ теоретических расчетов осуществляли с использованием программы визуализации ChemCraft версии 1.6 (https://www. chemcraftprog.com/). Квантово-химические расчеты СС проводили в пакете программ FireFly версии 8.1 (http://classic.chem.msu.su/gran/firefly/index.html.). Моделирование устойчивости комплексов мишень/ лиганд, а также оптимизацию геометрических параметров их равновесных состояний выполняли с использованием теории функционала плотности (DFT) в приближении B3LYP/DZP [34]. Соответствие минимумам полученных при оптимизации стационарных точек на поверхности потенциальной энергии проверяли вычислением матрицы Гессе и анализом на отсутствие мнимых частот. Геометрические параметры СС брали из оригинальных библиотек структурно-спектральных данных, созданных на базе лаборатории органического синтеза ФГБНУ ВНИИФ.
Биотестирование СС на наличие фунгицидной активности осуществляли методом серийных разведений in vitro на плотной питательной среде Сабуро с использованием 4-х кратной повторности в отношении тест-культур фитопатогенных грибов Fusauium graminearum, Alternarium alternata, Bipolaris soracini-ana [35, 36, 37]. Исследуемые соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) с последующим разведением стерильным физиологическим раствором в концентрациях от 1000 мкг/мл до 8 мкг/мл. Полученный препарат вносили в пробирки с расплавленной и охлажденной до 56 °C средой, после чего их тщательно перемешивали и заливали в стерильные чашки Петри в объеме 15 мл. Среду засеивали газоном суспензиями тест-культур F. graminearum, A. alternata, B. soraciniana в стерильном физиологическом растворе. Соответствующие тест-культуры получали, внося на стерильную питательную среду Сабуро коллекционные образцы F. graminearum,
A. alternata, B. soraciniana и выращивая их в течение двух недель при температуре 18...22 °С. Для контроля роста культуры использовали питательную среду без препаратов, учет результатов проводили через 48 ч. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы XL 2012. Штаммы фитопатогенных грибов F. graminearum, A. alternata,
B. soraciniana в качестве модельных тест-культур брали из Государственной коллекции патогенных организмов ФГБНУ ВНИИФ. В качестве препаратов сравнения использовали химические фунгициды фитолавин (ООО «Фармбиомедсервис», Россия) и превикур («Bayer», Германия).
Физико-химические характеристики, отвечающие за возможность возгонки СС, изучали на специально изготовленных испытательных стендах, по оригинальным методикам,разработанным в лаборатории органического синтеза ФГБНУ ВНИИФ. Температуру возгонки (Т возг.) измеряли, помещая образец СС массой 2,0 г в термостойкий фарфоровый тигель объемом 10 мл. Затем в тигель, на 2.3 мм глубины исследуемого состава, опускали рабочую часть соответствующего термометра (стальной баллон монометрического биметаллического термометра ТБ 100 или ртутный шарик термометра СП-1А2 из кварцевого термометрического стекла, диапазон
измерений 0...600 °C). Нагрев осуществляли с помощью открытого пламени газовой горелки в трех повторностях, за температуру возгонки принимали среднее арифметическое измерений. Уровень термодеструкции СС при нагревании образца определяли экспериментально путем отбора фиксированных объемов образующегося аэрозоля с последующим осаждением его частиц на аналитическом фильтре. Частицы аэрозоля количественно извлекали путем смыва с фильтра соответствующим растворителем с последующим разделением образовавшейся смеси методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках «Sorbfil» ПТСХ-П-А-УФ, ПТСХ-АФ-А-УФ (сили-кагель, УФ 254/365). Уровень деструкции определяли, как разницу между единицей и отношением площади пятен СС, извлеченных из аэрозоля, к суммарной площади всех пятен на пластинке для ТСХ. Массовую концентрацию р0 (г/м3) СС в воздухе определяли гравиметрическим методом, выделяя частицы аэрозоля с последующим осаждением их на аналитическом фильтре. Образцы СС массой 2,0 г в фарфоровом тигле помещали в испытательную камеру-стенд объемом 1 м3, снабженную пробоотборником с аналитическим фильтром и нагревали тигель на газовой горелке. Отбор пробы объемом 100 см3 из аэрозоль-газового потока производили через пробоотборник с аналитическим фильтром, фильтр взвешивали и по изменению массы определяли массовую концентрацию аэрозоля. Устойчивость аэрозоля СС определяли экспериментально, измеряя его массовые концентрации р0-8 в испытательной камере-стенде каждые 30 минут в течение 4 ч. Аэрозоль считали устойчивым при концентрации последнего измерения р8 не менее 0,005 г/м3. Для определения температуры вспышки (Т всп.) СС образец массой 2,0 г помещали в термостойкий фарфоровый тигель на 5 мл, запрессовывали до прекращения растрескивания образца, быстро нагревали до температуры 250°C и далее продолжали медленный нагрев с постоянной скоростью по мере приближения к температуре вспышки. С интервалами в 2 °C к образцу подносили источник зажигания в виде открытого пламени газовой горелки. За температуру вспышки принимали наименьшую температуру, при которой поднесение источника зажигания вызывало воспламенение образующегося аэрозоля над поверхностью тигля. Температуру воспламенения (Т воспл.) СС определяли, продолжая испытание, пока применение источника зажигания не вызывало воспламенение аэрозоля над образцом и горение в течение не менее 5 с. Определения проводили при стандартном атмосферном давлении.
В состав разработанных биологически активные композиций входили действующие вещества (далее -ДВ) на основе соединений 1-3 (8.27 %), природные антимикотики из группы полиенов (2.6 %), синтетические фунгициды из группы азолов (10.14 %), кроме того, были разработаны имитаторы ДВ в качестве компонентов азеотропов (0.18 %).
Природные антимикотики из группы полиенов, продуцируемые бактериями рода Streptomyces, получали путем микробной ферментации культур S. nodosus и S. Natalensis [38, 39, 40]. Культуры S. nodosus и S. Natalensis культивировали на модифицированных жидких питательных средах в ферментерах с рабочим объемом среды 250 л при температуре 27 °C в течение 5 сут. до выхода на стационарную фазу роста и далее при температуре 25 °C в течение 15 сут.
в условиях глубинного культивирования по собственным оригинальным методикам. Выбор оптимальных источников углерода и азота, необходимых для жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов, проводили, модифицируя качественный и количественный состав стандартной крахмало-аммиачной среды: углерод - по содержанию крахмала, пептона, глюкозы, сахарозы, сорбита, маннита, глицерина, экстракта зерна; азот - по содержанию пептона, дрожжевого автолизата, нитрата калия, нитрата натрия, сульфата аммония, нитрата аммония. Оптимизацию оригинального состава питательной среды осуществляли по максимальной концентрации биомассы микроорганизмов в соответствии с рекомендациями [41]. Оптимизацию кислотности среды выполняли с использованием фосфатных буферных систем со значениями pH=7,0 (буфер Серенсена - Na2HPO4/KH2PO4 и фосфатно-щелочной буфер - KH2PO4/NaOH), условий культивирования - методами полного факторного эксперимента и крутого восхождения.
Биологически активные компоненты из супер-натантов культивируемых микроорганизмов выделяли методами многократной экстракции, экспериментально подбирая соответствующие системы органических экстрагентов для наиболее полного извлечения целевых соединений. Первичное разделение обогащенных экстрактов и водного рафината проводили на делительных воронках, дальнейшее -центробежной декантацией органической фазы на центрифуге. Органический растворитель отгоняли на роторном испарителе до образования концентрата в виде масла, который разделяли на фракции и компоненты методом препаративной колоночной распределительной хроматографии (нормально-фазовой и обратно-фазовой) на сорбенте «Силикагель 60» 0,04.0,063 мм (230.400 меш), экспериментально подбирая соответствующие системы органических элюентов. Полноту разделения компонентов контролировали методами ТСХ на пластинках «Sorbfil» ПТСХ-П-А-УФ, ПТСХ-АФ-А-УФ (силикагель, УФ 254/365). Химический состав метаболитов штамма определяли методом хроматомасс-спектрометрии с использованием квадрупольно-времяпролётного масс-спектрометра MaXis Impact HD (Bruker Daltonik GmbH) с диапазоном температур 60.300°C в режиме электрораспылительной ионизации для растворов в ацетонитриле при скорости подачи образца 240 мкл/ч с параметрами по умолчанию в методе инфузионного анализа малых молекул. Калибровка масс - внешняя по улучшенному квадратичному методу с применением калибровочного раствора G1969-85000 (Agilent Technologies). Непосредственные методики экстракции и хроматографии, применяемые для выделения биологически активных компонентов из супернатантов культивируемых микроорганизмов, разработаны в лаборатории органического синтеза ФГБНУ ВНИИФ.
В состав оригинальных пиротехнических составов (далее - ПС) входили ДВ (23.46 %), окислитель (22. 56 %), горючие вещества (15.56 %), пламягасители (14.34 %), флегматизаторы (6.20 %) и разрыхлители (4.8 %), необходимые для фумигационной возгонки ДВ. Оптимизацию ПС проводили на имитаторах ДВ с последующей их заменой на синтезированные соединения 1-3 или разработанные на их основе БАК. В качестве имитаторов ДВ использовали вещества с высокой температурой кипения, позволяющей
осуществить их возгонку без значимой термо- или окислительной деструкции: медицинское вазелиновое масло (ГОСТ 3164-78, температура кипения 300.340 °C); вазелин медицинский (ГОСТ 3582-84, температура кипения 250.300 °C); глицерин (ГОСТ 6824-96, температура кипения 290 °C). Пригодность ПС для термовозгонки ДВ проверяли по собственным оригинальным методикам на испытательных стендах, позволяющих определить такие параметры, как уверенный поджег образца огневым способом, температура горения образца, линейная скорость горения, а также пожаро- и взрывоопасность ПС в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.044-89, ГОСТ 34001-2016, ГОСТ Р 55782-2013, ГОСТ 598499, ГОСТ 4333-2014. Экспериментальные образцы ПЗ, необходимые для фумигационной обработки отобранных тест-культур фитопатогенных грибов in vitro или модельных растений (пшеницы), пораженных указанными культурами, а также методики их применения были разработаны в лаборатории органического синтеза ФГБНУ ВНИИФ. Эффективность фунгицидного действия ПЗ оценивали по жизнеспособности тест-культур фитопатогенных грибов после фумигационной обработки, учитывая долю выросших колоний в экспериментальных образцах по отношению к интактным на плотной питательной среде Са-буро, а также по способности модельных растений, зараженных патогенными культурами и подвергнутых фумигации, к дальнейшему нормальному росту и развитию, сравнивая с контрольным опытом.
Результаты и обсуждение. Согласно экспериментальным данным, проведенная модификация методик, включающая замену растворителей реакционной среды на более высококипящие, позволила сократить время синтеза целевых соединений 1-3 с 10.15 мин.до 5.7 мин. и повысить выход на 7.14 %. Согласно результатам структурных ис-
мозинов. В прогнозе это предполагает фунгицидное или антимикотическое действие таких соединений с вероятностью 72.93 %.
Результаты компьютерного моделирования возможности связывания эргостерола в качестве КМ с соединениями 1а, 2а, 2е, 3а свидетельствуют, что такие комплексы представляют собой напряженные системы, обладающие значительной энергией образования и недостаточной устойчивостью, поэтому в дальнейшем такие модели не рассматривали. В случае выбора в качестве КМ эргостеролзависимого мембранного фермента Na+/K+-АТФ-азы, расчеты показали, что нитрогруппы соединений 1а и 2е избирательно координируются с участком молекулы фермента, отвечающим за фосфорелирование и связывание с АТФ. Для соединений 2а и 3а, в молекулах которых нитрогруппы отсутствовали, значимой координации каких-либо структурных элементов лиганда с этим участком молекулы фермента не наблюдали. При выборе в качестве КМ 14а-деметилазы, относящейся к надсемейству цитохромов Р450, содержащих гем в качестве кофактора, атом азота гетероцикла соединения 3а избирательно координировался с железом гемма, причем энергия связывания такого комплекса была значительно ниже, чем у связи железа с остатком цистеина белкового матрикса фермента. Для азотсодержащих соединений 1а, 2а и 2е образования аналогичноых комплексов с гемом фермента не наблюдали. В случае выбора в качестве КМ сквален-монооксигеназы, подходящих сайтов связывания соединений 1а, 2а, 2е, 3а с этим ферментом не найдено.
Результаты биотестирования (см. табл.) свидетельствуют, что соединения 1а, 1Ь, 1 проявили фунгицидную активность в отношении тест-культуры F. graminearum, сопоставимую с активностью препарата сравнения фитолавина.
Таблица. Противомикозная активность синтезированных соединений 1-3
Культура МИК, мкг/мл
1a 1b I 1c 1d I 1e 1f 2a \ 2b \ 2c I 2d I 2e I 2f 1 2q 2h I 3a I 3b 3c 4** | 5***
Fusauium sp. Alternarium sp. B. soraciniana 31* н/а 250* 16* 125* н/а н/а 125* н/а 63* 125* н/а н/а 500* н/а 31* н/а 500* н/а 500* н/а н/а н/а н/а 125* н/а 125* н/а н/а 500* н/а н/а н/а 31* н/а н/а 500* 500* 500 63* 500* н/а н/а 500 н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а 16* 8* 63* 8* 63* 31*
* - данные статистически значимы по отношению к контролю (р = 0,001); 4** - препарат сравнения фитофлавин; 5* препарат сравнения превикур; н/а - неактивно
следований соединения 1 а-f представляют собой 2-(2,4-динитрофенил)гидразонзамещенные эфиры бутандиовой кислоты, в которых система внутримолекулярных водородных связей приводит к формированию сопряженного бис-HN-хелатного фрагмента, структурно близкого бис-оксодиазиновому фармако-фору - основе некоторых антивирусных лекарственных препаратов, антисептиков и гербицидов [42, 43, 44]. Соединения 2 и 3 - это 2,3-дизамещенные 1,4-бензоксазины, гетероциклический фрагмент которых подобен фармакофору, отвечающему за фунгицидное, инсектицидное и бактерицидное действие некоторых биологически активных соединений [45, 46].
Результаты предварительного прогноза PASS позволяют предположить наличие у соединений 1-3 различных видов биологической активности, в частности, возможность СС выступать в роли ингибиторов мембраносвязанных ферментов - цитохрома P450, цитохрома C, ферментов синтеза сидерофоров (фу-заринина С), а также внеклеточных пепсинов и хи-
В отношении тест-культуры B. soraciniana соединения 1a, 1b, 1d, 1f проявили умеренную фунгицидную активность, не превышающую активность препаратов сравнения. В отношении тест-культуры A. alternata соединения 1 a-f фунгицидной активностью не обладали. Соединения 2f, 2h обладали фунгицидной активностью в отношении F. graminearum, сопоставимой с активностью фитолавина. Соединения 2a, 2e, 2g проявили умеренную активность в отношении A. Alternate, а соединения 2g, 2h - умеренную активность в отношении B. soraciniana. Соединения 3а и 3d проявили умеренную активность в отношении F. graminearum, а соединение 3d - умеренную активность в отношении A. alternata. В отношении B. soraciniana соединения 3 а-d фунгицидной активностью не обладали.
Изучаемые соединения (1-3) обладают следующими физико-химическими характеристиками: Т возг. в пределах 263.437 °C (2c и 2d разлагаются при 217 и 185 °C соответственно); уровень термодеструкции (за исключением соединений 2c,
d) - 7.28 %, р0 - 0,064.0,1 13 г/м3, устойчивость аэрозоля по последнему измерению р8 (за исключением соединений 1e, 1c, 2b, 3d) - 0,005.0,031 г/м3, Т всп. - 182.391 °C, Т воспл. - 271.497 °C.
Результаты экспериментов по возгонке биологически активных композиций свидетельствуют, что наиболее эффективно возгонялись БАК, включающие соединения 1a, 1b (8.10 %), природные антимикотики (5.6 %), синтетические фунгициды из группы азолов (10.11 %), а также имитаторы ДВ (10.12 %); БАК, включающие соединение 2a (15.18 %), природные антимикотики (2 %), синтетические фунгициды из группы азолов (13.14 %), а также имитаторы ДВ (16.18 %); БАК, включающие соединения 2e, 2f (22.27 %), природные антимикотики (6 %), синтетические фунгициды из группы азолов (10 %), а также имитаторы ДВ (2.6 %); БАК, включающие соединения 3a-3c (15.20 %), природные антимикотики (2.4 %), синтетические фунгициды из группы азолов (14 %), а также имитаторы ДВ (0.8 %). Представленные результаты свидетельствуют о низком уровне термо- или окислительной деструкции компонентов БАК в процессе возгонки и указывают на возможность практического применения разработанных составов в качестве фунгицидных препаратов, распыляемых путем фумигационной обработки сельскохозяйственных растений. Наиболее перспективными представляются БАК на основе соединений 1a, 1b, 2f, показавшие максимальную эффективность в отношении тест-культуры F. graminearum (см. табл.), что может быть использовано для борьбы с фузариозами злаковых - основы растениеводства.
Культивирование бактерий рода Streptomyces показало, что максимальное в опытах накопление биомассы (2,47±0,18 г/л для S. nodosus и 2,14±0,11 г/л для S. natalensis) достигалось на крахмало-аммиачной среде с фосфатно-щелочным буфером (K2HPO4/NaOH) и сульфатом аммония, в качестве источника азотного питания. В результате работ по микробной ферментации, из культур S. nodosus и S. natalensis, было выделено 34,8 г амфотерицина В (выход 0,0035 %, Т пл. 168.172 °C) и 58,8 г на-тамицина (выход 0,0059 %, Т пл. 275.277 °C), соответственно.
Наибольшую эффективность по возгонке ДВ показали ПС, включающие в качестве низкотемпературного окислителя хлорат калия, горючего вещества - тиомочевину, пламегасителя - хлорид аммония, флегматизатора - гидрокарбонат натрия и в качестве разрыхлителя - кизельгур. Возгонка ДВ под действием разработанных ПС осуществлялась при температуре горения образца в пределах 390.490°C и линейной скорости горения - 0,7.3 мм/секунду. Эффективность фунгицидного действия экспериментальных образцов ПЗ в отношении отобранных тест-культур фитопатогенных грибов in vitro находилась в пределах 23.69 %, в отношении пшеницы, пораженной указанными культурами, - 12.31 %.
Анализ полученных результатов свидетельствует, что соединения 1 -3 были удачно выбраны в качестве прекурсоров для создания фунгицидных средств в соответствии с предварительным прогнозом PASS. Несмотря на то, что большинство предложенных СС проявило умеренную фунгицидную активность в отношении всех испытанных тест-культур фитопатогенных грибов, соединения 1a, 1b, 1f, 2f, 2h, в составе молекул которых входят нитрогуппы, связанные с
ароматическим фрагментом, проявили в отношении F. graminearum фунгицидную активность, сопоставимую с активностью азотсодержащих препаратов сравнения. Компьютерное моделирование показало, что соединения 1a или 2e (ближайший гомолог 2f) блокируют такую КМ, как эргостеролзависимая Na+/K+-АТФ-аза, путем необратимого связывания нитрогрупп лиганда с активным центром фермента, отвечающего за процесс фосфорелирования. Это должно приводить к нокауту фермента, нарушению целостности клеточной мембраны и гибели клетки, что хорошо согласуется с данными эксперимента in vitro. Близким механизмом действия обладает контактный и системный фунгицид флуазинам (основной компонент коммерческого препарата зуммер), применяемый против фитопатогенного гриба Botrytis cinerea - возбудителя серой гили. Как и в соединениях 1 а-f, 2e-h, в молекуле флуазина-ма присутствует нитроароматический фрагмент, разобщающий окислительной фосфорилирование. Аналогично указанным соединениям он нарушает систему сопряжения процессов окисления в цепи фосфорилирования, что делает энергосопрягающую мембрану полностью проницаемой для ионов Н+ и приводит к гибели клетки.
Компьютерное моделирование взаимодействия соединения 3a с 14а-деметилазой продемонстрировало возможность связывания атома азота гетеро-цикла лиганда с железом гемма фермента, однако результаты эксперимента in vitro свидетельствуют о невысокой фунгицидной активности соединений 3 к тест-культурам F. graminearum и A. alternata. Это характеризует их как не самые удачные лиганды к предложенной КМ. Тем не менее, наличие пусть и невысокой фунгицидной активности у соединений 3 позволяет использовать их в качестве исходной модели для синтеза больших гомологических рядов, проводя дальнейшую оптимизацию комплексов мишень/ли-ганд в процессе высокопродуктивного скрининга.
Изученные физико-химические характеристики СС соответствуют требованиям, предъявляемым к возможности их возгонки, что позволяет опробовать их в качестве фумигантов фунгицидного действия, в том числе при совместном использовании с природными антимикотиками и синтетическими фунгицидами в составе биологически активных композиций. Эффективность предложенного способа внесения фунгицидов в процессе фумигации подтверждают представленные данные эксперимента in vitro в отношении тест-культур фитопатогенных грибов, а также удовлетворительные результаты на модельных растениях, пораженных этими культурами.
выводы. В результате исследований разработаны оригинальные биологически активные композиции, проявляющие фунгицидное действие в отношении фитопатогенных грибов, а также пиротехнические составы фумигационного действия, позволяющие эффективно распылять действующие вещества при низком уровне деструкции. Синтезированы новые азагетероцикличе-ские и гетерофункциональные ациклические структуры, проявляющие фунгицидное действие в отношении фитопатогенных грибов F. graminearum, A. alternata, B. soraciniana. Методами компьютерного моделирования изучена устойчивость комплексов синтезированных соединений с предполагаемыми клеточными мишенями - эргостеролом, эргостеролзависимыми мембранными Na+/K+-АТФ-азами, 14а-деметилазами и
сквален-монооксигеназами. Показано, что синтезированные соединения, имеющие нитрогруппы в молекуле, избирательно координируются с участком мембранного фермента Na+/K+-АТФ-азы, отвечающим за фосфорели-рование или с железом гемма 14а-деметилазы, приводя к блокаде фермента и нокауту клеточной мишени.
Представленный в работе инновационный подход подавления микозов фумигационным способом позволяет эффективно бороться с грибковыми заболеваниями сельскохозяйственных растений и может быть использован в различных областях аграрного сектора.
Литература.
1. Fungal wilt diseases of plants / ed. M. Mace. Elsevier, 2012. 654 p.
2. Ellis S. D., Boehm M. J., Mitchell T. K. Fungal and fungal-like diseases of plants [Электронный ресурс]. Ohio: The Ohio State University, 2008. 4 p. URL: https://ohioline.osu.edu/factsheet/plpath-gen-7 (дата обращения: 01.12.2020).
3. Weete J. D. Lipid biochemistry of fungi and other organisms. Springer Science and Business Media, 2012. 388 p. doi: 10.1007/978-1-4757-0064-0.
4. Burg M. B., Ferraris J. D. Intracellular organic osmolytes: function and regulation // Journal of Biological Chemistry. 2008. Vol. 283. No. 12. P. 7309-7313. doi: 10.1074/jbc.R700042200.
5. Molecular taxonomy of phytopathogenic fungi: a case study in Peronospora / M. Goker, G. Garcia-Blazquez, H. Voglmayr, et al. // PloS one. 2009. Vol. 4. No. 7. Article e6319. [Электронный ресурс]. URL: https://journals.plos.org/ plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0006319 (дата обращения: 07.12.2020). doi: 10.1371/journal.pone.0006319.
6. Blaxter M. Molecular taxonomics for biodiversity surveys: already a reality // Trends Ecol. Evol. 2003. Vol. 18. P. 268-269.
7. Здоровая почва - условие устойчивости и развития агро- и социосфер (проблемно-аналитический обзор) / М. С. Соколов, А. М. Семенов, Ю. Я. Спиридонов и др. //Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2020. № 1. С. 12-21. doi: 10.31857/S0002332920010142.
8. Технологические особенности почвозащитного ресурсосберегающего земледелия (в развитие концепции ФАО) / М. С. Соколов, А. П. Глинушкин, Ю. Я. Спиридонов и др. // Агрохимия. 2019. № 5. С. 3-20. doi: 10.1134/ S000218811905003X.
9. Управляемая коэволюция педосферы - реальная биосферная стратегия XXI века (вклад в развитие ноос-ферных идей В. И. Вернадского) / М. С. Соколов, Ю. Я. Спиридонов, В. П. Калиниченко и др. // Агрохимия. 2018. № 11. С. 3-18. doi: 10.1134/S0002188118110091.
10. Семенов А. М., Глинушкин А. П., Соколов М. С. Здоровье почвенной экосистемы: от фундаментальной постановки к практическим решениям // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2019. № 1. С. 5-18.
11. Экологические и фитосанитарные функции почвенного органического вещества (проблемно-аналитический обзор) / М. С. Соколов, Ю. Я. Спиридонов, Е. Ю. Торопова и др. // Агрохимия. 2018. № 5. С. 79-96. doi: 10.7868/ S0002188118050113.
12. Huang N., Shoichet B. K., Irwin J. J. Benchmarking sets for molecular docking // Journal of medicinal chemistry. 2006. Vol. 49. No. 23. P. 6789-6801. doi: 10.1021/jm0608356.
13. Shoichet B. K. Virtual screening of chemical libraries // Nature. 2004. Vol. 432. No. 7019. P. 862-865. doi:10.1038/ nature03197.
14. Comparative analysis of pharmacophore screening tools / M. P. A. Sanders, A. J. M. Barbosa, B. Zarzycka, et al. // Journal of chemical information and modeling. 2012. Vol. 52. No. 6. P. 1607-1620. doi: 10.1021/ci2005274.
15. Recent developments in nanotechnology transforming the agricultural sector: a transition replete with opportunities / D. Y. Kim, A. Kadam, S. Shinde, et al. // Journal of the Science of Food and Agriculture. 2018. Vol. 98. No. 3. P. 849-864. doi: 10.1002/jsfa.8749.
16. Sunding D., Zilberman D. The agricultural innovation process: research and technology adoption in a changing agricultural sector// Handbooks in Economics. 2001. Vol. 18. No. 1A. P. 207-262. doi: 10.1071/EA9940549.
17. Banfalvi G. Antifungal activity of gentamicin B1 against systemic plant mycoses // Molecules. 2020. Vol. 25. No. 10. P. 2401-2411. doi: 10.3390/molecules25102401.
18. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins / K. Thevissen, H-H. Kristensen, B. P. Thomma, et al. //Drug Discovery Today. 2007. Vol. 12. No. 21-22. P. 966-971. doi: 10.2174/187221508786241684.
19. Левенец Т. В., Горбунова А. В., Ткачева Т. А. Основы химических производств: учебное пособие. Оренбург, 2015. 122 с.
20. Стратегия фундаментально-прикладных исследований в сфере адаптивно-интегрированной защиты растений /М. С. Соколов, Ю. Я. Спиридонов, А. П. Глинушкин и др. // Агрохимия. 2018. № 5. С. 3-12. doi: https://doi. org/10.7868/S0002188118050010.
21. Rajput A. P., Kankhare A. R. Synthetic utility of aza-heterocyclics: A Short Review// Int. J. Pharm. Sci. Invent. 2017. Vol. 6. P. 19-25.
22. Алимов М., Мамаджанова Д. Фумигация в современном карантине растений //Мат. VМедунар. науч.-практ. конф., посвященной 45-летию со дня основания Исследовательской станции «Маяк» Института овощеводства и бахчеводства УААН (в рамках IV научного форума «Научная неделя в Крутах - 2019»). Круты, 2019. С. 90-93.
23. Synthesis of 1,3,4,6-tetraoxocompounds/P. P. Mukovoz, V. O. Koz'minykh, A. V. Gorbunova, et al. //Russian Journal of General Chemistry. 2016. Vol. 86. No. 11. P. 2427-2436. doi: 10.1134/S1070363216110050.
24. Простой однореакторный синтез 2,2-хиноксалин-2,3-диилдиацетатов / П. П. Муковоз, О. Г. Карманова, Е. Н. Козьминых и др. //Башкирский химический журнал. 2012. Т. 19. № 2. С. 12-15.
25. Левенец Т. В., Козьминых В. О. Синтез и противомикробная активность эфиров 3-арилгидразоно-2,4-диоксоалкановых кислот //Химико-фармацевтический журнал. 2013. Т. 47. № 10. С. 25-29.
26. Synthesis, structure, and biological activity of (2Z)-2-[(2,4-dinitrophenyl)hydrazinylidene]butanedioic acid esters / P. P. Mukovoz, E. S. Dankovtseva, V. P. Mukovoz, et al. // Russian Journal of General Chemistry. 2019. Vol. 89. No. 1. P. 1-7. doi: 10.1134/S1070363219010018.
27. Synthesis, structure, and biological activity of products of reactions of 3,4-dioxohexane-1,6-dioic acid esters with 2-aminophenol /P. P. Mukovoz, P. A. Slepukhin, E. A. Danilova, et al. // Russian Journal of General Chemistry. 2018. Vol. 88. No. 7. P. 1363-1368. doi: 10.1134/S1070363218070022.
28. Reaction of methyl- 3,4-dihydroxy-6-oxo-2,4-alkadienoates with 2-aminophenol / P. P. Mukovoz, V. A. Andreeva, O. S. Eltsov, et al. // Russian Journal of General Chemistry. 2015. Vol. 85. No. 6. P. 1386-1390. doi: 10.1134/ S1070363215060055.
29. Synthesis and structure of 2,2'-(2-hydroxy-2H-1,4-benzoxazin-2-yl-3-yliden)diacetic acid esters / P. P. Mukovoz, V. O. Kozminykh, V. A. Andreeva, et al. // Russian Journal of Organic Chemistry. 2015. Vol. 51. No. 10. P. 1453-1456. doi: 10.1134/S1070428015100176.
30. Method of synthesis and structure of (5E)-5-(2-alkoxy-2-oxoethylidene)-4-hydroxy-2,2-dimethyl-1-(4-methylphenyl)-2,5-dihydro-1H-pyrrole-3-carboxylates /P. P. Mukovoz, V. O. Kozminykh, V. A. Andreeva, et al. //Russian Journal of Organic Chemistry. 2015. Vol. 51. No. 6. P. 860-863. doi: 10.1134/S107042801506007X.
31. The technology of chemical compound biotoxicity assessment by the method of agar basins / A. N. Sizentsov, G. V. Karpova, E. V. Bibartseva, et al. // International Journal of Mechanical Engineering and Technology. 2018. Vol. 9. No. 11. P. 455-461.
32. Parasuraman S. Prediction of activity spectra for substances // Journal of pharmacology and pharmacotherapeutics.
2011. Vol. 2. No. 1. P. 52-55. doi: 10.4103/0976-500X.77119
33. The protein data bank/ H. M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, et al. // Nucleic Acids Research. 2000. Vol. 28. No. 1. P. 235-242. doi: 10.1093/nar/28.1.235.
34. Gaussian basis sets for correlated wave functions. Hydrogen, helium, first-and second-row atoms / A. C. Neto, E. P. Muniz, R. Centoducatte, et al. // Journal of Molecular Structure: THEOCHEM. 2005. Vol. 718. No. 1-3. P. 219-224. doi: 10.1016/j.theochem.2004.11.037.
35. Платонова Ю. В., Сурин Н. А. География грибов рода Fusarium (литературный обзор) // Фундаментальные исследования. 2004. № 4. С. 95-97. [Электронный ресурс]. URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/ view?id=5483 (дата обращения: 05.08.2020).
36. Соколова Л. М. Анализ видового разнообразия грибов из рода Fusarium // Аграрная наука. 2019. Т. 1. С. 118-122. doi: 10.32634/0869-8155-2019-326-1-118-122
37. Alterations in volatile metabolites profile of fresh tomatoes in response to Alternaria alternata (Fr.) Keissl. 1912 infection / D. Encinas-Basurto, M. I. Valenzuela-Quintanar, A. Sanchez-Estrada, et al. // Chilean Journal of Agricultural Research. 2017. Vol. 33. No. 7. P. 194-201. doi: 10.4067/S0718-58392017000300194.
38. Штамм Streptomyces nodosus 472 ВНИИСХМ Д-666-продуцент амфотерицина В / М. А. Малков, О. Г. По-латовская, М. И. Пронина и др. //Патент РФ № 2000131310/13, 13.12.2000.
39. An efficient gene transfer system for the pimaricin producer Streptomyces natalensis / L. L. Enriquez, M. V. Mendes, N. Anton, et al. //FEMS microbiology letters. 2006. Vol. 257. P. 312-318. doi: 10.1111/j.1574-6968.2006.00189.x.
40. Genome-wide analysis of the regulation of pimaricin production in Streptomyces natalensis by reactive oxygen species / T. Beites, A. Rodriguez-Garcia, F. Santos-Beneit, et al. // Appl Microbiol Biotechnol. 2014. Vol. 98. No. 5. P. 2231-2243. doi: 10.1007/s00253-013-5455-z.
41. Иващенко В. Г., Назаровская Л. А. Географическое распространение и особенности биоэкологии Fusarium Graminearum Schwabe //Микология и фитопатология. 1998. Т. 32. №. 5. С. 1-10.
42. 3-Aminomethyl- and 4-aminopiperidine analogues of 1-[2-(diphenylmethoxy)ethyl]-4-(3-phenylpropyl)piperazines: synthesis and evaluation as dopamine transporter ligands / S. Choi, D. Elmaleh, R. Hanson, et al. // J. Med. Chem. 2000. Vol. 43. P. 205-213. doi: 10.1002/chin.200016134.
43. Levenets T. V., Kozminykh V. O., Tolstikova A. O. Structure of ethyl 3-(4-tolyl)hydrazono-2,4-dioxopentanoates // Journal of Structural Chemistry. 2013. Vol. 54. No. 1. P. 186-188. doi: 10.1134/S0022476613010290.
44. Левенец Т. В., Козьминых В. О. Внутримолекулярная гетероциклизация эфиров 3-арилгидразоно-2,4-диоксопентановых кислот //Башкирский химический журнал. 2018. Т. 25. № 1. С. 48-50.
45. Synthesis and antimicrobial activity of substituted benzoxazines and quinoxalines / A. V. Babenysheva, N. A. Lisovskaya, I. O. Belevich, et al. //Pharmaceutical Chemistry Journal. 2006. Vol. 40. No. 11. P. 611-613. doi: 10.1007/ s11094-006-0204-6.
46. Левенец Т. В., Козьминых В. О., Толстикова А. О. Конденсация ацетона с диэтилоксалатом и арилдиазо-ниевыми солями // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Химия. 2012. № 24 (283). С. 32-38.
References
1. Mace M, editor. Fungal wilt diseases of plants. [place unknown]: Elsevier; 2012. 654 p.
2. Ellis SD, Boehm MJ, Mitchell TK. Fungal and fungal-like diseases of plants [Internet]. Ohio: The Ohio State University, 2008 [cited 2020 Dec 1]. 4 p. Available from: https://ohioline.osu.edu/factsheet/plpath-gen-7.
3. Weete JD. Lipid biochemistry of fungi and other organisms. [place unknown]: Springer Science and Business Media;
2012. 388 p. doi: 10.1007/978-1-4757-0064-0.
4. Burg MB, Ferraris JD. Intracellular organic osmolytes: function and regulation. Journal of Biological Chemistry. 2008;283(12):7309-13. doi: 10.1074/jbc.R700042200.
5. Goker M, Garcia-Blazquez G, Voglmayr H, et al. Molecular taxonomy of phytopathogenic fungi: a case study in Peronospora. PloS one [Internet]. 2009 [cited 2020 Dec 7];4(7): Article e6319. Available from: https://journals.plos.org/plosone/ article?id=10.1371/journal.pone.0006319. doi: 10.1371/journal.pone.0006319.
6. Blaxter M. Molecular taxonomics for biodiversity surveys: already a reality. Trends Ecol. Evol. 2003;18:268-9.
7. Sokolov MS, Semenov AM, Spiridonov YuYa, et al. [Healthy soil is a condition for sustainability and development of agro- and sociospheres (problem-analytical review)]. Izvestiya Rossiiskoi akademii nauk. Seriya biologicheskaya. 2020;(1):12-21. Russian. doi: 10.31857/S0002332920010142.
8. Sokolov MS, Glinushkin AP, Spiridonov YuYa, et al. [Technological features of soil-protecting resource-saving agriculture (in the development of the FAO concept)]. Agrokhimiya. 2019;(5):3-20. Russian. doi: 10.1134/S000218811905003X.
9. Sokolov MS, Spiridonov YuYa, Kalinichenko VP, et al. [Controlled co-evolution of the pedosphere is a real biosphere strategy of the XXI century (contribution to the development of noospheric ideas of V.I. Vernadsky)]. Agrokhimiya. 2018;(11):3-18. Russian. doi: 10.1134/S0002188118110091.
10. Semenov AM, Glinushkin AP, Sokolov MS. [Soil ecosystem health: from a fundamental setting to practical solutions]. Izvestiya Timiryazevskoi sel'skokhozyaistvennoi akademii. 2019;(1):5-18. Russian.
11. Sokolov MS, Spiridonov YuYa, Toropova EYu, et al. [Ecological and phytosanitary functions of soil organic matter (problem-analytical review)]. Agrokhimiya. 2018;(5):79-96. Russian. doi: 10.7868/S0002188118050113.
12. Huang N, Shoichet BK, Irwin JJ. Benchmarking sets for molecular docking. Journal of medicinal chemistry. 2006;49(23):6789-801. doi: 10.1021/jm0608356.
13. Shoichet BK. Virtual screening of chemical libraries. Nature. 2004;432(7019):862-5. doi:10.1038/nature03197.
14. Sanders MPA, Barbosa AJM, Zarzycka B, et al. Comparative analysis of pharmacophore screening tools. Journal of chemical information and modeling. 2012;52(6):1607-20. doi: 10.1021/ci2005274.
15. Kim DY, Kadam A, Shinde S, et al. Recent developments in nanotechnology transforming the agricultural sector: a transition replete with opportunities. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2018;98(3):849-64. doi: 10.1002/ jsfa.8749.
16. Sunding D, Zilberman D. The agricultural innovation process: research and technology adoption in a changing agricultural sector. Handbooks in Economics. 2001;18(1A):207-62. doi: 10.1071/EA9940549.
17. Banfalvi G. Antifungal activity of gentamicin B1 against systemic plant mycoses. Molecules. 2020;25(10):2401-11. doi: 10.3390/molecules25102401.
18. Thevissen K, Kristensen H-H, Thomma BP, et al. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discovery Today. 2007;12(21-22):966-71. doi: 10.2174/187221508786241684.
19. Levenets TV, Gorbunova AV, Tkacheva TA. Osnovy khimicheskikh proizvodstv: uchebnoe posobie [Fundamentals of chemical manufacturing: a study guide]. Orenburg: [publisher unknown]; 2015. 122 p. Russian.
20. Sokolov MS, Spiridonov YuYa, Glinushkin AP, et al. [Strategy of fundamental-applied research in the field of adaptive-integrated plant protection]. Agrokhimiya. 2018;(5):3-12. Russian. doi: https://doi.org/10.7868/S0002188118050010.
21. Rajput AP, Kankhare AR. Synthetic utility of aza-heterocyclics: A Short Review. Int. J. Pharm. Sci. Invent. 2017;6:19-25.
22. Alimov M, Mamadzhanova D. [Fumigation in modern quarantine of plants]. In: mat. V Medunarodnoi nauchno-prakticheskoi konferentsii, posvyashchennoi 45-letiyu so dnya osnovaniya Issledovatel'skoi stantsii "Mayak" Instituta ovoshchevodstva i bakhchevodstva UAAN [materials of the V International Scientific and Practical Conference dedicated to the 45th anniversary of the founding of the Research Station "Mayak" of the Institute of Vegetable and Melon Growing of the UAAS]. Kruty (Ukraine): [publisher unknown]; 2019. p. 90-3. Russian.
23. Mukovoz PP, Koz'minykh VO, Gorbunova AV, et al. Synthesis of 1,3,4,6-tetraoxocompounds. Russian Journal of General Chemistry. 2016;86(11):2427-36. doi: 10.1134/S1070363216110050.
24. Mukovoz PP, Karmanova OG, Koz'minykh EN, et al. [Simple one-pot synthesis of 2,2-quinoxaline-2,3-diyldiacetates]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal. 2012;19(2):12-5. Russian.
25. Levenets TV, Koz'minykh VO. [Synthesis and antimicrobial activity of 3-arylhydrazone-2,4-dioxoalkanoic acid esters]. Khimiko-farmatsevticheskii zhurnal. 2013;47(10):25-9. Russian.
26. Mukovoz PP, Dankovtseva ES, Mukovoz VP, et al. Synthesis, structure, and biological activity of (2Z)-2-[(2,4-dinitrophenyl)hydrazinylidene]butanedioic acid esters. Russian Journal of General Chemistry. 2019;89(1):1-7. doi: 10.1134/ S1070363219010018.
27. Mukovoz PP, Slepukhin PA, Danilova EA, et al. Synthesis, structure, and biological activity of products of reactions of 3,4-dioxohexane-1,6-dioic acid esters with 2-aminophenol. Russian Journal of General Chemistry. 2018;88(7):1363-8. doi: 10.1134/S1070363218070022.
28. Mukovoz PP, Andreeva VA, Eltsov OS, et al. Reaction of methyl- 3,4-dihydroxy-6-oxo-2,4-alkadienoates with 2-aminophenol. Russian Journal of General Chemistry. 2015;85(6):1386-90. doi: 10.1134/S1070363215060055.
29. Mukovoz PP, Kozminykh VO, Andreeva VA, et al. Synthesis and structure of 2,2'-(2-hydroxy-2H-1,4-benzoxazin-2-yl-3-yliden)diacetic acid esters. Russian Journal of Organic Chemistry. 2015;51(10):1453-6. doi: 10.1134/S1070428015100176.
30. Mukovoz PP, Kozminykh VO, Andreeva VA, et al. Method of synthesis and structure of (5E)-5-(2-alkoxy-2-oxoethylidene)-4-hydroxy-2,2-dimethyl-1-(4-methylphenyl)-2,5-dihydro-1H-pyrrole-3-carboxylates. Russian Journal of Organic Chemistry. 2015;51(6):860-3. doi: 10.1134/S107042801506007X.
31. Sizentsov AN, Karpova GV, Bibartseva EV, et al. The technology of chemical compound biotoxicity assessment by the method of agar basins. International Journal of Mechanical Engineering and Technology. 2018;9(11):455-61.
32. Parasuraman S. Prediction of activity spectra for substances. Journal of pharmacology and pharmacotherapeutics. 2011;2(1):52-5. doi: 10.4103/0976-500X.77119.
33. Berman HM, Westbrook J, Feng Z, et al. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 2000;28(1):235-42. doi: 10.1093/nar/28.1.235.
34. Neto AC, Muniz EP, Centoducatte R, et al. Gaussian basis sets for correlated wave functions. Hydrogen, helium, first-and second-row atoms. Journal of Molecular Structure: THEOCHEM. 2005;718(1-3):219-24. doi: 10.1016/j. theochem.2004.11.037.
35. Platonova YuV, Surin NA. [Geography of fungi of the genus Fusarium (literary review)]. Fundamental'nye issledovaniya [Internet]. 2004 [cited 2020 Aug 5];(4):95-7. Available from: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=5483. Russian.
36. Sokolova LM. [Analysis of the species diversity of fungi from the genus Fusarium]. Agrarnaya nauka. 2019;1:118-22. Russian. doi: 10.32634/0869-8155-2019-326-1-118-122
37. Encinas-Basurto D, Valenzuela-Quintanar MI, Sanchez-Estrada A., et al. Alterations in volatile metabolites profile of fresh tomatoes in response to Alternaria alternata (Fr.) Keissl. 1912 infection. Chilean Journal of Agricultural Research. 2017;33(7):194-201. doi: 10.4067/S0718-58392017000300194.
38. Malkov MA, Polatovskaya OG, Pronina MI, et al. Shtamm Streptomyces nodosus 472 VNIISKhM D-666-produtsent amfoteritsina V [Strain Streptomyces nodosus 472 VNIISHM D-666 is a producer of amphotericin B]. Russian Federation patent Ru 2000131310/13. 2000 Dec 13. Russian.
39. Enriquez LL, Mendes MV, Anton N, et al. An efficient gene transfer system for the pimaricin producer Streptomyces natalensis. FEMS microbiology letters. 2006;257:312-8. doi: 10.1111/j.1574-6968.2006.00189.x.
40. Beites T, Rodriguez-Garcia A, Santos-Beneit F, et al. Genome-wide analysis of the regulation of pimaricin production in Streptomyces natalensis by reactive oxygen species. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(5):2231-43. doi: 10.1007/s00253-013-5455-z.
41. Ivashchenko VG, Nazarovskaya LA. [Geographical distribution and features of bioecology of Fusarium Graminearum Schwabe]. Mikologiya i fitopatologiya. 1998;32(5):1-10. Russian.
42. Choi S, Elmaleh D, Hanson R, et al. 3-Aminomethyl- and 4-aminopiperidine analogues of 1-[2-(diphenylmethoxy) ethyl]-4-(3-phenylpropyl)piperazines: synthesis and evaluation as dopamine transporterligands. J. Med. Chem. 2000;43:205-13. doi: 10.1002/chin.200016134.
43. Levenets TV, Kozminykh VO, Tolstikova AO. Structure of ethyl 3-(4-tolyl)hydrazono-2,4-dioxopentanoates. Journal of Structural Chemistry. 2013;54(1):186-8. doi: 10.1134/S0022476613010290.
44. Levenets TV, Koz'minykh VO. [Intramolecular heterocyclization of 3-arylhydrazone-2,4-dioxopentanoic acid esters]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal. 2018;25(1):48-50. Russian.
45. Babenysheva AV, Lisovskaya NA, Belevich IO, et al. Synthesis and antimicrobial activity of substituted benzoxazines and quinoxalines. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2006;40(11):611-3. doi: 10.1007/s11094-006-0204-6.
46. Levenets TV, Koz'minykh VO, Tolstikova AO. [Condensation of acetone with diethyl oxalate and aryldiazonium salts]. Vestnik Yuzhno-Ural'skogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Khimiya. 2012;(24):32-8. Russian.
