CC BY
38
УДК 330:633.15
ИННОВАЦИИ В СЕЛЕКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС СОЗДАНИЯ ГИБРИДОВ КУКУРУЗЫ
Innovations in the Selection of Corn Hybrids
Шпилев Н.С., д-р с.-х. наук, профессор, Ториков В.Е., д-р с.-х. наук, профессор, Мельникова О.В., д-р с.-х. наук, профессор, Сычева И.В., канд. с.-х. наук, профессор, Лебедько Л.В. канд. экон. наук, Осипов А.А., канд. с.-х. наук
ShpilevN.S., Torikov V.E., Melnikova O.V., SychevaI.V., LebedkoL.V., OsipovA.A.
ФГБОУ ВО «Брянский государственный аграрный университет» Bryansk State Agrarian University
Реферат. Эффективность селекционного процесса кукурузы зависит от количества и разнообразия исходного материала. Основным исходным материалом при создании гетерозис-ных гибридов кукурузы являются самоопыленные линии, которые получают путем принудительного самоопыления в течение 5-7 лет. Выращивание гаплоидных линий из пыльцевых зерен позволит сократить этот процесс до двух лет, но при этом, полученные гаплоиды полностью стерильны. Практическое их использование возможно только после удвоения числа хромосом, что даст возможность восстанавить их фертильность. На основании экспериментальных данных установлены наиболее эффективные способы удвоения числа хромосом, оптимальная концентрация раствора и продолжительность действия колхицина. Наилучший результат эффективности колхицинирования получен при использовании концентрации колхицина 0,150-0,175%. При такой концентрации колхицина происходило удвоение числа хромосом от 55,1 до 86,8% обработанных гаплоидных растений. Разные генотипы гибридов кукурузы избирательно реагировали на концентрацию раствора колхицина. Гаплоиды, выращенные из пыльцевых зерен гибридов Докучаевский 190 СВ и Воронежский 160 СВ, при использовании концентрации раствора от 0,150 до 0,175%, имели наибольшую эффективность колхицинирования (71,4-83,7%). При изучении эффективности колхицинирования использовали экспозицию 24 часа, что связано с продолжительностью циклов митоза. Интенсивность деления клеток во многом определялась внешними условиями, которые в наших опытах контролировались. У гаплоидов, выращенных из пыльцевых зерен гибрида Машук 185 МВ, удвоение числа хромосом происходило больше при обработке растений раствором колхицина 0,125-0,150% и составляло от 80,9 до 88,8%. Такая реакция разных генотипов исходных гибридов кукурузы объясняется различием генетики исходного материала для получения самоопыленных линий и влиянием разного типа цитоплазматиче-ской мужской стерильности (ЦМС) используемого при семеноводстве перечисленных гибридов. При переводе семеноводства гибридов Докучаевский 190 СВ и Воронежский 160 СВ на стерильную основу использовался бразильский тип ЦМС, а Машук 185 МВ - молдавский тип ЦМС. Селекционное исследование таких линий позволит сократить сроки создания гибридов кукурузы и значительно повысить эффективность селекционного процесса.
Abstract. The efficiency of the corn selection depends on the quantity and variety of the source material. The main source material for creating heterotic corn hybrids is self-pollinated lines, obtained by forced self-pollination for 5-7 years. Growing haploid lines from pollen grains will reduce this process up to two years, but the resulting haploids are completely sterile. Their practical use is possible only after doubling the number of chromosomes, thus allowing restoration of their fertility. Based on the experimental data, the most effective methods for doubling the number of chromosomes, the optimal concentration of the solution, and the duration of colchicine effect were established. The best result of colchicination efficiency was obtained when using a colchicine concentration of 0.150-0.175%. At that colchicine concentration the number of chromosomes doubled from 55.1 to 86.8% of the treated haploid plants. Different genotypes of corn hybrids selectively reacted to the concentration of colchicine solution. The haploids grown from the pollen grains of the hybrids Dokuchaevsky 190 SV and Voro-nezhsky 160 SV with a solution concentration from 0.150 to 0.175% had the highest colchicination efficiency (71.4-83.7%). When studying the effectiveness of colchicination, a 24-hour exposure was used,
owing to the duration of mitosis cycles. The intensity of cell division was largely determined by external conditions, which were controlled in our experiments. The haploids grown from pollen grains of Mashuk 185 MV hybrid have got the doubled number of chromosomes when plants were treated with 0.125-0.150% colchicine solution in the range of 80.9 to 88.8%. This reaction of different genotypes of the original corn hybrids is explained by the difference in the genetics of the source materialfor obtaining self-pollinated lines and the influence of different types of cytoplasmic male sterility (CMS) used in seed production of these hybrids. When transferring seed production of the hybrids Dokuchaevsky 190 SV and colchicination 160 SV to a sterile basis, the Brazilian CMS type was used, and as for the hybrid Mashuk 185 MV it was the Moldovan CMS type. The researches of such lines shorten the selecting time of corn hybrids and significantly increase the efficiency of the selection.
Ключевые слова: колхицин, гаплоиды, гибрид, цитоплазматическая мужская стерильность, питательная среда, фенотипы, in vitro, in vivo, фертильность, гетерозис.
Keywords: colchicine, haploids, hybrid, cytoplasmic male sterility, nutritional medium, phe-notypes, in vitro, in vivo, fertility, heterosis.
Введение. Согласно Росстата, посевные площади кукурузы в России в 2018 году составили 2452,2 тысячи гектаров. Возделывание современных гибридов кукурузы и совершенствование технологий возделывания за последние десять лет позволили увеличить сбор зерна более чем на 70%, в 2019 г. он составил 13928, 7 тыс. тон. Потенциальная урожайность кукурузы на зерно превышает двести центнеров с одного гектара, лучшие хозяйства приближаются к ее реализации так в 2019 г. в Краснодарском крае была получена максимальная урожайность зерна кукурузы, которая составила 178,3ц/га.
Главным фактором повышения урожайности является успех в селекции гетерозисных гибридов кукурузы, что позволяет создавать генотипы этой культуры характеризующиеся высокой потенциальной урожайностью, пластичностью и высокой окупаемостью дополнительных затрат, т.е. интенсивностью.
В России, согласно Государственного реестра селекционных достижений допущенных к производственному использованию (2018 г.) огромный выбор гибридов, по Российской Федерации 931 и 98 по Центральному региону[1].
К сожалению, около половины из которых являются импортными, что усложняет разработку стратегии развития кукурузоводства в нашей стране. Среди гибридов, допущенных к производственному использованию, имеются простые межлинейные, двойные межлинейные, трехлинейные, линейно-сортовые и сорто-линейные.
Благодаря сочетанию достаточно высокого гетерозиса и приемлемой цены семян наибольшее распространение получили трехлинейные гибриды. Независимо от типов гибридов основным исходным материалом для создания гетерозисных гибридов являются самоопыленные линии, которые в основном получают путем многократного принудительного опыления.
Для получения самоопыленных линий с высокой комбинационной способностью требуется в среднем пять-семь лет, что существенным образом увеличивает сроки создания производственно-значимых гибридов.
Разработка и апробирование методов ускоренного создания гомозиготных линий кукурузы позволит сократить время создания гибридов и повысить эффективность селекционного процесса. Результаты исследований на эту тему представлены в данной научной работе.
Материал и методика исследований. В качестве исходного материала использовались гибриды кукурузы получившие наибольшее распространение в Центральном регионе, имеющие разное происхождение: Машук 185 МВ - простой межлинейный гибрид, Докучаев-ский 190 СВ - трехлинейный гибрид и Воронежский 160 СВ - двойные межлинейныйгибрид из пыльцевых зерен которых были получены гаплоиды.
Результаты исследований и их обсуждение. Полученные in vitro из пыльцевых зерен представляются гаплоидами в соматических клетках которых содержится половина хромосом, свойственных для исследуемого вида, при этом из двух гомологичных хромосом присутствует одна хромосома.
Гаплоиды при обычных способах выращивания абсолютно стерильны из-за значительных нарушений мейоза. Для восстановления фертильности необходимо проводить удвоение числа хромосом. Эффекта удвоения числа хромосом можно достичь используя многие химические вещества: закись азота, аценафтен, линдан, колхицин и другие соединения.
Спонтанное удвоение хромосом обычно низкое. Поэтому иногда применяют антими-тотические агенты. Число эмбрионов было ниже, но число зеленых проростков удвоилось, число гаплоидов на колос было выше. Однако уровень диплоидизации из года в год меняется и часто получаются химеры. Успех также очень зависит от среды и условий культивирования, да и сама технология обработки колхицином очень сложна и вредна.
Поэтому в последние годы ученые все чаще используют спонтанную диплоидизацию из-за ее простоты и безопасности. Хотя процент получения дигаплоидов и ниже, зато, учитывая огромное количество задействованных микроспор, можно получать значительное количество полностью фертильных, взрослых, дигаплоидных растений [2,3].
Благодаря простоте использования и высокой эффективности мы использовали колхицин. Колхицин это алколоид растительного происхождения, выделенный из клубнелуковиц Безвременника осеннего (Colchicum autamnale), принадлежащего к семейству Liliaceae. Химическая формула С22Н25О6. эффект удвоения числа хромосом достигается благодаря действиям колхицина на делящиеся клетки, парализуя действие веретена и хромосомы предназначенные для двух клеток остаются в одной.
Существует несколько технических приемов введения колхицина в растение, начиная от замачивания семян в растворе колхицина и заканчивая добавлением колхицина в питательную среду при выращивании гаплоидов. Несмотря на высокоэффективное действие при удвоении числа хромосом колхицин имеет один существенный недостаток, а именно, он приводит к угнетению развития корневой системы, вследствие чего растения слабо приживаются. Для уменьшения таких отрицательных последствий мы использовали колхицинирование через корневую систему, которую перед колхицинированием промывали, условно делили пополам. Одну половину помещали в воду, вторую в раствор изучаемой концентрации колхицина. Такой подход предполагает - если под действием колхицина корневая система будет угнетаться, то вторая часть, будучи в воде, полностью сохранит свою жизнеспособность.
Для колхицинирования использовали растения гаплоидов выращенных in vitro. Растения в этом питомнике сильно различались между собой по развитию и росту. Отдельные растения засыхали, не достигнув фенологической фазы пять-шесть листьев. Около пятидесяти процентов растений по фенотипу не проявляли признаков угнетения (рис. 1).
Это позволяет предположить, что генотипы несущие гомозиготный ген определяют положительные качества растений.
Такие растения мы использовали для колхицинирования. Для выбора оптимальной концентрации для кукурузы мы использовали шесть вариантов концентрации колхицина, от 0,1% до 0,225% с интервалом 0,025. Экспозиция обработки для всех вариантов составляла 24 часа. Колхицинирование проводили в лабораторных условиях с повышенной влажностью воздуха (70-80% и оптимальной температурой -18-200С). После колхицинирования растения пересаживали в тепличные условия, где на протяжении 20 дней поддерживались оптимальные условия.
При достижении молочно-восковой спелости определяли количество растений, в початках которых формировались семена, что служило критерием успешного колхицинирова-ния. При 100% приживаемости растений после пересадки эффект колхицинирования в зависимости от концеентрации раствора существенно различался (табл. 1).
Рисунок 1 - Посевы галоидов кукурузы (2019 г.)
Таблица 1- Результаты колхицинирования гаплоидов от разных гибридов через корневую систему_
Концентрация раствора Докучаевский 190 СВ Машук 185 МВ Воронежский 160 СВ
обработано растений (шт.) число растений с зернами (шт.) результативность колхицинирования (%) обработано растений (шт.) число растений с зернами (шт.) результативность колхицинирования (%) обработано растений (шт.) число растений с зернами (шт.) результативность колхицинирования (%)
0,100 32 17 53,1 33 25 75,7 41 24 58,5
0,125 29 16 55,1 27 24 88,8 34 21 61,7
0,150 42 30 71,4 21 17 80,9 29 22 75,8
0,175 37 31 83,7 30 20 66,6 38 28 73,6
0,200 21 18 85,7 36 18 50,0 33 18 54,5
0,225 34 13 38,2 32 15 46,8 37 17 45,9
Наилучший результат эффективности колхицинирования был получен при использовании концентрации колхицина 0,150-0,175%. Такая концентрация колхицина обеспечивала удвоение числа хромосом от 55,1 до 86,8% обработанных гаплоидных растений.
При этом установлено, что разные генотипы гибридов кукурузы избирательно реагировали на концентрацию раствора колхицина. Так, гаплоиды, выращенные из пыльцевых зерен гибридов Докучаевский 190 СВ и Воронежский 160 СВ имели наибольшую эффективность колхицинирования при использовании концентрации раствора от 0,150 до 0,175% (71,4-83,7%). В то же время как у гаплоидов выращенных из пыльцевых зерен гибрида Ма-шук 185 МВ удвоение числа хромосом происходило больше при обработке растений раствором колхицина 0,125-0,150% и составляло от 80.9 до 88,8%.
Такая реакция разных генотипов исходных гибридов кукурузы может объясняться несколькими причинами:
1) влияние разного типа цитоплазматической мужской стерильности используемого при семеноводстве перечисленных гибридов. При переводе семеноводства на стерильную основу гибридов Докучаевский 190 СВ и Воронежский 160 СВ использовался бразильский тип ЦМС, а Машук 185 МВ - молдавский тип ЦМС;
2) различием генетики исходного материала для получения самоопыленных линий и др.
При использовании разной экспозиции действия колхицина существенных различий не
было получено. Определяя эффективность колхицинирования мы использовали экспозицию 24
часа. Это связано с продолжительностью циклов митоза, а поскольку интенсивность деления клеток во многом определялась внешними условиями, которые в наших опытах контролируются, мы обосновано рекомендуем обрабатывать растения колхицином в течение 24 часов.
В Краснодарском НИИСХ им. П.П. Лукьяненко для удвоения числа хромосом у гаплоидных линий кукурузы обработку колхицином проводили путем введения раствора в стебель растения [4]. Преимущество данного метода заключается в том, что растение не выкапывают с почвы, а, следовательно, оно меньше травмируется и меньше тратится времени,
По нашим данным введение раствора колхицина шприцем выше корневой шейки на пять сантиметров концентрацией не выше 0.125% не приводило к гибели растений и выживаемость растений составила 96,2%
При концентрации раствора 0,150% и при дальнейшем увеличении концентрации раствора выживаемость резко снижалась и при обработке растений концентрацией раствора 0,225% число выживаемых растений составила 0,3%.
Анализ корневой системы погибших растений показал, что у них вторичная корневая система была сильно угнетена. По нашему мнению это результат отрицательного действия колхицина.
Не зависимо от концентрации раствора колхицина и способа введения мы использовали гаплоидные растения не старше IV этапа органогенеза, когда еще не формируются генеративные клетки.
Выводы. 1. Для удвоения числа хромосом гаплоидных растений кукурузы необходимо использовать введение колхицина в растения через половину корневой системы;
2. При колхицинировании растений значительно различающихся по генотипу для увеличения эффективности подбирать оптимальную концентрацию раствора в пределах 0,125-0,175%;
3. Экспозиция обработки растений должна быть не менее 24 часов.
Библиографический список
1. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. Т. 1 «Сорта растений». М.: ФГБНУ «Росинформагротех», 2018. 508 с.
2. The auxins centrophenoxine and 2,4-D differ in their effects on non-directly induced chromosome doubling in anther culture of wheat (T. aestivum L.) / M. Rubtsova, H. Gnad, М. Melzer, J. Weyen, M. Gils // Plant Biotechnol Rep. 2012. Vol. 7. Р. 247-255.
3. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. Advances in haploid production in higher plants // SpringerScience + Business Media B.V. 2009. 347 p.
4. Шацкая О.А., Паршина М.В. Получение линий кукурузы методом гаплоидии: оценка всхожести гаплоидных семян и выживаемости обработанных колхицином растений // Научное обеспечение агропромышленного комплекса. Краснодар, 2017. С.1311-1312.
5. Кукуруза и сорго: биология и технологии возделывания /Белоус Н.М., Ториков В.Е., Дронов А.В., Дьяченко В.В. - Брянск, 2010.
References
1. State Register of selection achievements approved for use. Vol. 1 "Varieties of plants". Moscow: Rosinformagrotech, 2018. - 508s.
2. The auxins centrophenoxine and 2,4-D differ in their effects on non-directly induced chromosome doubling in anther culture of wheat (T. aestivum L.) / M. Rubtsova, H. Gnad, М. Melzer, J. Weyen, M. Gils //Plant Biotechnol Rep. 2012. Vol. 7. Р. 247-255.
3. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. Advances in haploid production in higher plants // SpringerScience + Business Media B.V. 2009. 347p.
4. Shatskaya O.A., ParshinaM.V. Obtaining corn lines by haploidy: estimation of germination of haploidic seeds and survival of colchicine-treated plants/ O.A. Shatskaya, M. V. Parshina // Scientific support of the agro-industrial complex, Krasnodar, 2017. - P. 1311-1312.
5. Corn and sorghum: biology and cultivation technologies / N.M. Belous, V.E. Torikov, A.V. Dronov, V.V. Dyachenko. - Bryansk, 2010.
