CC BY
247
УДК 579.246:579.61
Ингибиторы образования биопленок бактериями Bacillus subtilis на основе тиопроизводных 2(5^-фуранона
Е. Ю. Тризна1*, Э. Н. Хакимуллина1, Л. З. Латыпова1, А. Р. Курбангалиева1,
И. С. Шарафутдинов1, В. Г. Евтюгин1, Э. В. Бабынин1, М. И. Богачев2, А. Р. Каюмов1
1Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18
2Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ», 197376,
Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 5
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 18.11.2014
После доработки 09.02.2015
РЕФЕРАТ Грамположительные бактерии вызывают широкий спектр инфекционных заболеваний, в том числе и внутрибольничные инфекции. В составе биопленки бактерии становятся устойчивыми к антибиотикам и иммунной системе человека, что вызывает трудности при лечении и определяет необходимость разработки ингибиторов формирования биопленки. Бактерии Bacillus subtilis широко используются в качестве модельного организма для изучения образования биопленок. Изучено влияние новых синтезированных 2(5Н)-фуранонов на формирование биопленок клетками бацилл. Из 57 проверенных соединений образование биопленки подавляли серусодержащие производные 2(5Н)-фуранона F12, F15 и F94, взятые в концентрации 10 мкг/мл. Показано, что F12 и F94 подавляли биосинтез GFP с промотора оперона eps, кодирующего гены синтеза экзополисахарида биопленки (EPS). Методом дифференциального флуоресцентного окрашивания установлено, что в присутствии F12, F15 и F94 значительно повышается чувствительность клеток бацилл к воздействию антибиотиков (канамицин и хлорамфеникол). Максимальный эффект оказывал F12. F15 разрушал уже сформированную биопленку и значительно повышал чувствительность бактерий к антибиотикам.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА антибактериальная активность, биопленки, 2(5Н)-фураноны, Bacillus subtilis. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МПК - минимальная подавляющая концентрация; МБПК - минимальная концентрация, подавляющая образование биопленки.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время показано, что большинство бактерий существуют в природе в виде специфически организованных биопленок. Биопленки представляют собой тесно адгезированное к субстрату сообщество дифференцированных микробных клеток, заключенных в полисахаридный матрикс (EPS). Такая форма существования предоставляет бактериям ряд преимуществ в условиях воздействия неблагоприятных факторов внешней среды и организма-хозяина. Это приводит к повышению эффективности биотехнологических процессов, с одной стороны, а с другой, к повышению устойчивости к противомикробным веществам, антисептикам и дезинфектантам, реф-рактерности к лечению, что в результате приводит к увеличению частоты внутрибольничных инфекций, создает трудности в микробиологической диагностике инфекционных заболеваний [1—3]. Таким образом, биопленки представляют серьезную проблему и тре-
буют разработки препаратов, разрушающих бактериальные биопленки и подавляющих их образование на предметах медицинского назначения. Бациллы, грамположительные спорообразующие палочки, например Bacillus anthracis и B. cereus, вызывающие сибирскую язву и тяжелые пищевые токсикоин-фекции, также образуют биопленки на различных поверхностях [1]. В качестве модельного объекта для изучения бациллярных биопленок широко используют клетки B. subtilis [1].
В настоящее время для борьбы с бактериальными биопленками применяют покрытие поверхностей частицами серебра, иммобилизованными ферментами, разрушающими матрикс биопленки, а также различные низкомолекулярные вещества - ингибиторы генов образования биопленок [4]. Среди таких соединений особое место занимают вещества 2(5H)-фуранонового ряда [5], первоначально выделенные из красной морской водоросли Delisea pulchra.
СНзл1ьз /С ( X СН2"г
и Ьн 4 7 НОН (С1Н2С)2НСО н
Рис. 1. Структурные формулы фуранонов, подавляющих образование биопленок В. subfШs при концентрации 10 мкг/мл
Таблица 1. Минимальные концентрации фуранонов, подавляющие рост и образование биопленок клетками В. subfШs 168, цито- и генотоксические свойства соединений
Фуранон Минимальная подавляющая концентрация (МПК), мкг/мл Минимальная концентрация, подавляющая образование биопленок (МБПК), мкг/мл СС СС50 для клеток MCF7, мкг/мл Генотоксичность соединений (превышение над контролем, разы/количество клеток)
Тест Эймса* SOS- хромотест*
F12 25 10 36.9 2.4 (109 ± 25.2) 0.69
F15 25 10 65.7 3.1 (133 ± 25.4) 0.61
F94 50 10 83.9 0.9 (41 ± 4.4) 1.09
Контроль** - - - 1.0 (45 ± 3.5) 1.00
Позитивный контроль*** - - - 8.2 (369 ± 15.6) 22.71
*Генотоксичность определяли при концентрации фуранонов 10 мкг/мл, что соответствует их МБПК.
**Диметилсульфоксид в количестве, вносимом в виде раствора фуранона.
***Азид натрия (3 мкг/мл) в тесте Эймса и митомицин С (0.1 мкг/мл) в SOS-хромотесте.
Таблица 2. Влияние фуранонов на толщину биопленки клеток В. subfШs
Фуранон Толщина биопленки, мкм
Культивирования с предварительно внесенными фуранонами, 96 ч Добавление фуранонов к сформированной биопленке с последующей инкубацией в течение 24 ч
Контроль 10 ± 1.6 10 ± 1.3
F12 4 ± 0.4 6 ± 0.3
F15 2 ± 0.3 4 ± 0.2
F94 4 ± 0.6 8 ± 0.7
Показано, что производные фуранонов обладают антимикробным действием в отношении большого числа грамположительных и грамотрицательных бактерий и подавляют образование ими биопленок
[5, 6].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Фураноны
На рис. 1 представлены структурные формулы исследованных соединений: F12 - 5-гидрокси-4-[(4-
метилфенил)сульфанил]-3-хлор-2(5Н)-фуранон [7], F15 - 4-бензилсульфанил-5-гидрокси-3-хлор-2(5Н)-фуранон [8] и F94 - 1,3-бис[3-хлор-5-(1,3-дихлорпропан-2-илокси)-2(5Н)-фуранон-4-илсульфанил]пропан [9], синтезированы по известным методикам.
Штаммы и условия культивирования
В работе использовали следующие штаммы: В. suЪtilis 168 [10]; В. subtilis К511 [11], несущий ген gfp под контролем промотора гена epsA, активного при образовании биопленок у бацилл.
ТОМ 7 № 2 (25) 2015 | АСТА ^ТОИАЕ | 111
Для проверки мутагенности соединений использовали штаммы Salmonella typhimurium TA100 (HisG46, rfa, uvr-, pkm 101, bio-) [12] и S. typhimurium TA1535/pSK1002 [13].
Все бактериальные штаммы культивировали в среде LB (триптон - 1.0 г/л; дрожжевой экстракт -0.5 г/л; NaCl - 0.5 г/л; pH 8.5) [14]. Образование биопленок бациллами определяли с использованием среды ВМ (Basal medium), представляющей модифицированную среду SMM [15], с внесением пептона до 7 г/л.
Окрашивание биопленок кристаллическим фиолетовым
Образование биопленок анализировали в 96-луночных пластиковых планшетах (Cellstar Grenier bio-one No. 655 180) методом окрашивания кристаллическим фиолетовым. Бактерии выращивали без качания при 37оС на среде ВМ в лунках, содержащих по 200 мкл культуры бактерий начальной плотностью 3 х 107 КОЕ/мл. Через 72 ч культивирования удаляли культуральную жидкость, однократно промывали фосфатно-соле-вым буфером (PBS) pH 7.4 и просушивали в течение 20 мин. Вносили 150 мкл 0.1% раствора кристаллического фиолетового (Sigma-Aldrich) в 96% этаноле, инкубировали в течение 20 мин. Несвязавшийся краситель смывали PBS. Связавшийся краситель элю-ировали в 150 мкл 96% этилового спирта и измеряли поглощение при длине волны 570 нм на микропланшетном ридере Tecan infinite 200 Pro (Швейцария). В качестве контроля использовали лунки, в которых клетки не инкубировали, но проводили все манипуляции процесса окрашивания.
Определение минимальной подавляющей концентрации
Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) фуранонов определяли методом микроразведений в среде ВМ. Концентрации фура-нонов после серийных разведений составляли 0.1-500 мкг/мл. Лунки засевали 200 мл бактериальной культуры (3 х 107 КОЕ/мл) в среде BM и инкубировали при 37°C. Минимальную подавляющую концентрацию определяли как наименьшую концентрацию фуранона, при которой отсутствовал видимый рост бактерий к 24 ч инкубации. Минимальную концентрацию, подавляющую образование биопленок (МБПК), определяли как наименьшую концентрацию фуранонов, которая полностью подавляла образование биопленок через 72 ч роста.
Определение гено-и цитотоксичности фуранонов
Мутагенность фуранонов в концентрации МБПК оценивали в тесте Эймса [12]. В качестве отрицатель-
Рис. 2. Влияние фуранонов на интенсивность свечения GFP, экспрессируемого с промотора оперона eps в клетках В. subfШs К511. Клетки выращивали в течение 72 ч в присутствии F12 (Б), F15 (б), F94 (Г) в концентрации 10 мкг/мл (соответствует МБПК). Контроль (А) - культура, выращенная в отсутствие фуранонов. Масштабная черта 10 мкм
А Контроль ' / Зк 1 Б Ст ; »с ' »• " Ж'-" \ _ В Кт НШШ л 1 |Г -V; ■ -* 1-Т. ____
Г Р12 / '"«Г* < | ч* Д Р12+Ст ф/ ж А 0 \ ( ^ V • V 1 Е Р12+Кт • ^ • \ / % § '
Ж Р15 4 ^ Ч * 1 " З Р15+Ст V \ И Р15+Кт -■К 4 * ;?1 •ИЛ! <• ^ |Ц •М. Фь N ^ Г / 0 1 £ -
К Р94 / - / ' ^ — с. 1 /■ Л Р94+Ст г- - ж л' Ж * М Р94+Кт тГ * * ^ * N. ' » ' Ф > м-
Рис. 3. Влияние фуранонов на образование биопленки бактериями В. subfШs и чувствительность к антибиотикам клеток В. subfШs, адгезированных на поверхности куль-туральной чашки. Клетки В. subfilis 168 выращивали в течение 72 ч для формирования биопленки (А, Б, В) в присутствии фуранонов (Г, Ж, К) в концентрации 10 мкг/мл (соответствует МБПК), затем вносили хлорамфе-никол (Ст) (Д, З, Л) или канамицин (Кт) (Е, И, М). Количество жизнеспособных клеток через 24 ч инкубации с антибиотиком оценивали путем окрашивания клеток йодидом пропидия и флуоресцеиндиа-цетатом. Масштабная черта 10 мкм
ного контроля использовали растворитель диметил-сульфоксид (ДМСО), в качестве положительного -азид натрия ^а^). Тестируемое вещество считали мутагенным, если число колоний-ревертантов в опыте более чем в 2 раза превышало их число в контроле (растворителе). ДНК-повреждающую активность соединений оценивали в SOS-хромотесте на штамме typhimurium TA1535/pSK1002 [13]. Ночную культуру бактерий разводили в среде LB в 10 раз и растили в течение 4 ч в присутствии исследуемых соединений. Затем клетки собирали центрифугированием и определяли в них активность Р-галактозидазы согласно [16]. Цитотоксичность веществ определяли на клетках линии MCF7 с помощью метаболического МТS-теста (Promega). Рассчитывали коэффициент цитотоксичности СС50 (концентрация вещества, при которой активность снижается в 2 раза).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Нами ранее были идентифицированы галоген- и се-русодержащие производные 2(5Н)-фуранона, по-
давляющие образование биопленок В. suЪtilis [6]. Дополнительный скрининг 56 соединений позволил идентифицировать дополнительно два фура-нона ^15 и F94), в концентрации 10 мкг/мл подавляющих образование биопленки клетками бацилл (табл. 1). Ф2 и Ф8 (5-гидрокси-4-[(4-метилфенил)-сульфанил]-3-хлор-2(5Н)-фуранон и 3,4-дихлор-5-(1,3-дихлорпропан-2-илокси)-2(5Н)-фуранон соответственно), охарактеризованные в работе [6], повышали активность системы генетической компетентности бацилл и не были включены в дальнейшее исследование. F15 и F94 не повышали активность фактора транскрипции СотА, активирующего систему развития генетической компетентности бацилл (не показано).
Чтобы установить влияние фуранонов на уровень экспрессии оперона eps, кодирующего гены синтеза экзополисахарида биопленки, клетки В. suЪtilis К511, несущие ген gfp под контролем промотора гена epsA, выращивали в среде ВМ в течение 72 ч в присутствии и в отсутствие фуранонов и анали-
ТОМ 7 № 2 (25) 2015 | АСТА ЫАТиИАЕ | 113
А Контроль Б Ст В Кт
Г Р12 - 1 /Ч\ • Д Р12+Ст Е Р12+Кт
Ж . Р15 З Р15+Ст И Р15+Кт
К Р94 Л Р94+Ст М Р94+Кт
Рис. 4. Фураноны разрушают биопленку и повышают эффективность антибиотиков против клеток B. subfШs в составе сформированной биопленки. Клетки В. subfilis 168 выращивали в течение 72 ч для формирования биопленки (А, Б, В),затем вносили фураноны до конечной концентрации 30 мкг/мл (трехкратное превышение МБПК) в присутствии хлорамфеникола (Ст) (Д, З, Л) или канами-цина (Кт) (Е, И, М). Количество жизнеспособных клеток через 24 ч инкубации с антибиотиком оценивали, окрашивая клетки йодидом пропидия и флуоресцеиндиаце-татом. Масштабная черта 10 мкм
зировали на флуоресцентном микроскопе (рис. 2). Выявление GFP в клетках в отсутствие фуранонов свидетельствовало об экспрессии оперона eps и образовании клетками экзополисахарида - основы матрикса биопленки (рис. 2А). В присутствии фуранонов F12 и F94 GFP не идентифицировался, что говорит о репрессии образования экзополисахарида и, как следствие, о подавлении образования биопленки в присутствии данных соединений (рис. 2Б,Г). По всей видимости, молекулярными мишенями этих соединений являются регуляторные пути адаптации организмов к стрессовым условиям. Так, показано, что F12 ингибирует активность факторов транскрипции Spo0A и ТпгА [6]. Напротив, GFP выявляется и в присутствии F15, но в значительно меньшем количестве по сравнению с контролем, следовательно, подавления оперона eps не происходило. Вероятно, соединение F15 ингибирует образование биопленки другим путем, не затрагивая регуляцию оперона eps.
Фураноны повышают чувствительность адгезированных клеток к антибиотикам
Известно, что противомикробные средства малоэффективны против бактерий в составе биопленки. Предположительно, подавление образования биопленки должно повышать эффективность антибиотических препаратов. Потенциальный синергизм фура-нонов с антибиотиками изучали методом «шахматной доски», где концентрации фуранона и антибиотика (канамицин и хлорамфеникол) варьировали от 0.1 до 2.0 МПК [17]. Однако ни одно соединение не проявило синергизма с противомикробными препаратами в отношении планктонных клеток = 1.2 ± 0.21).
Чтобы проверить, будут ли фураноны повышать чувствительность к антибиотикам бактерий, адгезированных на поверхностях, бациллы выращивали в среде ВМ в течение 72 ч в присутствии фуранонов в концентрации 10 мкг/мл (МБПК), затем вносили антибиотики (хлорамфеникол и канамицин) до конечных концентраций 10 мкг/мл (установленные
МПК составляли 2.5 мкг/мл). После 24 ч культивирования удаляли культуральную жидкость, биопленку промывали PBS и проводили дифференциальное флуоресцентное окрашивание йодидом пропидия и флуоресцеиндиацетатом для выявления соответственно мертвых и живых клеток в слое микробных клеток, адгезированных на поверхности культу-ральной чашки. Полученные препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss Axio Imager 2.0 (рис. 3).
В контрольной пробе наблюдали образование биопленки толщиной до 10 мкм (рис. 3А, табл. 2), при этом внесение хлорамфеникола (рис. 3Б) или канамицина (рис. 3В) приводило к гибели лишь незначительной части адгезированных клеток. Напротив, в культуре, выращенной в присутствии F15 (10 мкг/мл), толщина биопленки составляла 2 мкм, и внесение антибиотика приводило практически к полной гибели бацилл (рис. 3З,И), тогда как сам фуранон не вызывал бактерицидного эффекта (рис. 3Ж). В случае F12 и F94 в концентрации 10 мкг/мл эффект был менее выражен. Таким образом, присутствие фуранонов в среде культивирования подавляло образование биопленки на поверхности культуральной чашки и повышало эффективность антибиотиков, по всей видимости, благодаря большей доступности бактериальных клеток для антимикробных соединений.
Также исследовали возможность разрушения бактериальной биопленки в присутствии фуранонов. С этой целью клетки бацилл выращивали в среде ВМ в течение 72 ч, удаляли культуральную жидкость и вносили чистую среду ВМ с добавлением фура-нонов (30 мкг/мл), канамицина и хлорамфеникола. Через 24 ч остаточную биопленку промывали PBS и проводили дифференциальное флуоресцентное окрашивание (рис. 4).
В отсутствие фуранонов, как и в предыдущем опыте, антибиотики оказались малоэффективными против клеток, включенных в матрикс биопленки (рис. 4Б,В). Внесение F12 (30 мкг/мл) вызывало значительное разрушение биопленки через 24 ч
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Vlamakis H., Chai Y., Beauregard P., Losick R., Kolter R. // Nat. Rev. Microbiol. 2013. № 11. P. 15-168.
2. Каюмов А.Р., Балабан Н.П., Марданова А.М., Костров С.В., Шарипова М.Р. // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 557-563.
3. Schmidt T., Ziganshin A.M., Nikolausz M., Scholwin F., Nelles M., Kleinsteuber S., Pröter J. // Biomass Bioenergy. 2014. V. 69. P. 241-248.
4. Ma Y., Xu Y., Yestrepsky B.D., Sorenson R.J., Chen M., Larsen S.D., Sun H. // PLoS One. 2012. P. 1-10.
5. Lonn-Stensrud J., Landin M.A., Benneche T., Petersen F.C., Scheiel A.A. // J. Antimicrobial Chemotherapy. 2009. № 63. Р. 309-316.
(табл. 2), добавление антибиотиков вызывало гибель подавляющего большинства клеток (рис. 4Г-Е). При этом эффект F15 был менее выражен, а F94 практически не повышал чувствительность клеток к антибиотикам и не вызывал разрушения биопленки (рис. 3Ж-М).
Цито- и генотоксические свойства соединений F12, F15 и F94
Определение цитотоксичности F12, F15 и F94 показало, что значения СС50 у них в 7 раз превышали концентрации, необходимые для подавления образования биопленок (табл. 1). Хотя SOS-хромотест не выявил ДНК-повреждающей активности у этих соединений, данные теста Эймса свидетельствовали о потенциальной мутагенности F12 и F15.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, серусодержащие фураноны F12 и F15 могут представлять интерес для дальнейшей разработки на их основе ингибиторов бактериальных биопленок. Однако потенциальная мутагенная активность этих фуранонов, выявленная в тесте Эймса, является противопоказанием для прямого использования и требует дальнейшей модификации структуры. •
Данное исследование выполнено с использованием оборудования Междисциплинарного центра
коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России (Ю RFMEFI59414X0003).
Работа поддержана государственной программой повышения конкурентоспособности Казанского
(Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров, Министерством образования и науки РФ (контракт № 2014/187) и РФФИ (грант № 14-04-31635 мол_а).
6. Kayumov A.R., Khakimullina E., Sharafutdinov I., Trizna E., Latypova L., Hoang L., Margulis A., Bogachev M., Kurbangalieva A. // J. Antibiotics. 2014. № 143. doi:10.1038/ja.2014.143 (epub ahead of print)
7. Kurbangalieva A.R., Devyatova N.F., Bogdanov A.V., Berd-nikov E.A., Mannafov T.G., Krivolapov D.B., Litvinov I.A., Chmutova G.A. // Phosphorus, Sulfur, Silicon, Relat. Elem. 2007. V. 182. № 3. P. 607-630.
8. Латыпова Л.З., Сайгитбаталова Е.Ш., Чулакова Д.Р., Лодоч-никова О.А., Курбангалиева А.Р., Бердников Е.А., Чмутова Г.А. // Журн. орг. химии. 2014. Т. 50. Вып. 4. С. 532-545.
9. Хоанг Т.Л., Хазиев Р.М., Зарипова А.Р., Курбангалиева А.Р., Чмутова Г.А. // Сб. тезисов III Всероссийской научной кон-
ТОМ 7 № 2 (25) 2015 | ACTA NATURAE | 115
ференции (с международным участием) «Успехи синтеза и комплексообразования». Москва, 21-25 апреля 2014. М.: РУДН, 2014. С. 205.
10. Kayumov A., Heinrich A., Sharipova M., Iljinskaya O., Forchhammer K. // Microbiology. 2008. V. 154. P. 2348-2355.
11. Kobayashi K. // Mol. Microbiol. 2008. № 69. P. 1399-1410.
12. Ames B.N., McCann J. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1976. № 271. Р. 5-13.
13. Oda Y., Nakamura S., Oki I., Kato T., Shinagawa H. // Mutat Res. 1985. № 147. Р. 219-229.
14. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. P. 4-16.
15. Kayumov A., Heinrich A., Sharipova M., Iljinskaya O., Forchhammer K. // Microbiology. 2008. V. 154. P. 2348-2355.
16. Fedorova K., Kayumov A., Woyda K., Ilinskaja O., Forchhammer K. // FEBS Lett. 2013. V. 587. P. 1293-1298.
17. Prichard M.N., Jr., Shipman C. // Antiviral Res. 1990. № 14. P. 181-206.
