CC BY
15
Клинические исследования и опыт в онкологии
© С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова, 2022
УДК 616.71-006.3.04-08-035 | DOI: 10.32000/2078-1466-2022-3-8-20
ИНГИБИТОР АКТ-СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ПОТЕНЦИРУЕТ ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ДОКСОРУБИЦИНА В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК ОСТЕОСАРКОМ IN VITRO
С.В. Бойчук12, А.Р. Галембикова1
1ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Казань
2ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» МЗ РФ,
г. Москва
AKT INHIBITOR POTENTIATES CYTOTOXIC ACTIVITY OF DOXORUBICIN IN OSTEOSARCOMA CELLS IN VITRO
S.V. Boychuk12, A.R. Galembikova1 1Kazan State Medical University, Kazan
2Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Moscow
Бойчук Сергей Васильевич — член-корреспондент АН РТ, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей патологии, декан медико-биологического факультета ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ
420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, тел.: +7-917-397-80-93, (843) 236-72-63, e-mail: [email protected], SPIN-код: 8058-6246, Author ID: 130120, ORCID ID: 0000-0003-2415-1084
Boychuk Sergey V. — Corresponding Member of the Tatarstan Academy of Sciences, Doct. of Sci. (Med.), Professor, Head of the Department of General Pathology, Dean of Biomedicine Faculty of the Kazan State Medical University
49 Butlerov Str., Kazan, 420012, Russian Federation., tel.: +7-917-397-80-93, (843) 236-72-63, e-mail: [email protected], SPIN-code: 8058-6246, Author ID: 130120, ORCID ID: 0000-0003-2415-1084
Реферат. Активация рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ выявляется при многих злокачественных новообразованиях, в том числе, саркомах мягких тканей (СМТ) и остеосаркомах (ОС) и, в ряде случаев, коррелирует с плохим прогнозом заболевания. Несмотря на то, что доксорубицин, ингибитор ДНК-топоизомеразы II типа, достаточно широко используется как в моно-, так и в составе комбинированной химиотерапии пациентов с СМТ и ОС, неуклонное развитие резистентности опухолей к данному препарату является одним из наиболее значимых факторов, определяющих плохой прогноз у пациентов с метастатическими и рецидивирующими формами заболевания. Это, в свою очередь, является стимулом для поиска новых эффективных методов повышения чувствительности опухолевых клеток к данному химиопрепа-рату и преодоления лекарственной резистентности опухолей. Результаты проведенного исследования свидетельствуют об активации c-Met-, FGFR-, AKT-, и МAPK-киназ в опухолевых клеточных линиях ОС, а подавление их активности с помощью соответствующих ингибиторов (кризотиниб, BGJ398, MK-2206 и U0126, соответственно) потенцирует цитотоксический эффект доксорубицина в отношении клеток ОС. Наибольший синергизм действия между доксорубицином и вышеуказанными ингибиторами тирозинкиназ был обнаружен в отношении ингибитора АКТ-сигнального пути, МК-2206. Было показано, что МК-2206, в значительной степени повышает чувствительность клеток ОС к доксорубицину, индуцируя их гибель по механизму апоптоза. Таким образом, гиперактивация АКТ-сигнального пути в клетках ОС создает предпосылки для повышения их чувствительности к химиопрепаратам, в частности, доксорубицину, что может рассматриваться в качестве перспективного подхода для комбинированного использования ингибиторов АКТ-сигнального пути и ингибиторов топоизо-меразы II типа в терапии пациентов с ОС.
Ключевые слова: AKT-сигнальный путь, доксорубицин, остеосаркома, ингибитор АКТ, МК-2206, синергизм, апоптоз.
Abstract. Activation of receptor and nonreceptor tyrosyne kinases (TK) is detected in a broad spectrum of human malignancies, including soft tissue sarcomas (STS) and osteosarcomas (OS) and in some cases correlates with poor prognosis and clinical outcomes. Despite the topoisomerase II inhibitor doxorubicin is broadly used for treatment of STS and Oc as mono- and as a component of the combined chemotherapeutic regimens, rapid development of tumor resistance to doxorubicin is considered to be most significant factor of poor prognosis and bad clinical outcome, especially for the patients with metastatic and recurrent
forms of disease. This, in turn, remains a driving force to develop novel effective approaches to increase sensitivity of tumor cells to this chemotherapeutic agent and overcome drug resistance. Our current data illustates activation of c-Met-, FGFR-, AKT-, MAPK-kinases in OS cells, whereas inhibition of their activities with corresponding TK inhibitors (TKIs) (crizotinib, BGJ398, MK-2206, and U0126, respectively) enhances cytotoxic activity of doxorubicin against OS cells. The most prominent synergism between doxorubicin and TKIs inhibitors was found for AKT inhibitor MK- 2206. We found that MK-2206 significantly enhanced sensitivity of OS cells to doxorubicin and induced their apoptosis. Thus, activation of AKT signaling in OS might be an attractive therapeutic target to increase OS sensitivy to chemotherapeutic agents, in particular, doxorubicin. This in turn provide the molecular basis for the effective further use of the combined (AKT- and topoisomerase II inhibitors) therapy for patinets with OS. Key words: AKT signaling pathway, doxorubicin, osteosarcoma, AKT inhibitor, MK-2206, synergism, apoptosis.
Введение
Остеосаркома (ОС) возникает из косте-образующих мезенхимальных стволовых клеток и представляет собой наиболее распространенное первичное злокачественное новообразование костей с высокой степенью злокачественности у детей и подростков [1, 2]. При всех высокозлокачественных остеосаркомах требуется проведение со-четанной терапии — полихимиотерапия и оперативное вмешательство. Проведение химиотерапии показано для подавляющего большинства пациентов с ОС из-за высокой вероятности диссеминирования опухолевого процесса. В то же время, лучевая терапия обладает ограниченной эффективностью и применяется в случае невозможности достижения локального контроля оперативным путем. В последние годы с момента внедрения неоадъювантной химиотерапии, общая 5-летняя выживаемость пациентов с ОС существенным образом увеличилась с 20 до 70% [3, 4]. При проведении неоадью-вантной химиотерапии пациентам с ОС в настоящее время используются 4 основных химиопрепарата: доксорубицин, метотрек-сат, цисплатин и ифосфамид [5]. Однако для пациентов с диссеминированными формами заболевания и быстро развивающейся устойчивостью опухоли к химиопрепаратам общая 5-летняя выживаемость по-прежнему остается невысокой и не превышает 20% [6, 7]. Следовательно, поиск новых подходов повышения эффективности химиопрепаратов, используемых в настоящее время в терапии пациентов с ОС, является актуальной научно-практической задачей.
Активация различных сигнальных путей, обеспечивающих усиление пролиферации опухолевых клеток и их устойчивость к апоптозу, является довольно частым событием при многих злокачественных новообразованиях. Активация PßK/AKT/mTOR-сиг-нального пути в опухолевых клетках может являться следствием активирующих или эпигенетических мутаций в соответствующих генах тирозинкиназных и нетирозинкиназных рецепторов, аутокринной или паракринной активацией основных или альтернативных сигнальных путей и др. Помимо усиления пролиферативного потенциала, приводящего к ускоренному росту и прогрессирова-нию опухоли, активация вышеуказанных сигнальных путей также может быть причиной первичной или вторичной резистентности к химио- и таргетным препаратам различных групп, а также лучевой терапии [8-11]. Свидетельства абберантной активации PI3K/ AKT/mTOR-сигнального пути были получены для остеосарком (ОС) [12, 13], саркомы Юинга [14, 15], тем самым, иллюстрируя перспективность терапевтического воздействия на данный путь в терапии пациентов со многими злокачественными новообразованиями. Помимо этого, было показано, что некоторые другие тирозинкиназные рецепторы или их лиганды гиперэкспрессируют-ся при ОС. К ним относятся с-KIT, рецептор сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGFR)-2,-3, рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR)-ß, и с-MET [16, 17]. Данная гиперэкспрессия коррелирует в ряде случаев с высоким риском метастази-рования опухоли и плохой выживаемостью
пациентов с ОС [18]. Более в 10% случаев у пациентов с ОС обнаруживаются мутации в гене c-Myc (гомолог вирусного онкогена миелоцитоматоза птиц) [19], что также способствуют инвазии опухолевых клеток посредством активации в них MAPK-ERK-сигнального пути [20]. Высокая экспрессия MYC в клетках ОС также способствует усиленной клеточной пролиферации, миграции, клоногенности и образованию сфероидов in vitro [21].
Тем не менее, несмотря на достаточно убедительные данные, свидетельствующие об активации достаточно широкого спектра тирозинкиназных путей в клетках ОС, доказательств их взаимосвязи с формированием устойчивости ОС к химиопрепаратам до настоящего времени не было получено. В связи с вышеизложенным, целью данного исследования было изучение зависимости между уровнем экспрессии активированных форм некоторых рецепторных и нере-цепторных тирозинкиназ (c-Met, FGFR, AKT и MAPK) в клетках ОС и изменения их чувствительности к доксорубицину на фоне ин-гибирования активности соответствующих тирозинкиназ с помощью соответствующих ингибиторов.
Материал и методы исследования
Исследования проводились на клеточных линиях остеосарком U2OS (American Type Culture Collection (АТСС), США), Saos-2 (ATCC, США) и фибросаркомы НТ1080 (АТСС, США). Клеточные линии культивировали во влажной атмосфере с 5% содержанием CO2 при 37°C (LamSystems, Россия) в культураль-ной среде RPMI-1640 (ПАНЭКО, Россия) или DMEM, содержащей 10-15% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 1% L-глутамина (ПАНЭКО, Россия), 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/л стрептомицина (ПАНЭКО, Россия). Клетки культивировали в присутствии химиопрепарата доксоруби-цина (Sigma, США), и/или селективных ингибиторов соответствующих киназ c-Met
(crizotinib, Selleck Chem, США), FGFR 1-4 (BGJ398, Selleck Chem, США), AKT (MK-2206, Selleck Chem, США) и MAPK (U0126, Selleck Chem, США).
Для изучения цитотоксичности исследуемых химиопрепаратов опухолевые клетки засевали в лунки плоскодонного 96-лу-ночного культурального планшета horning, США). После достижения 70-80%-ной кон-флюентности клеток в культуру клеток вносили химиопрепарат доксорубицин без (контроль) и в сочетании с вышеуказанными ингибиторами тирозинкиназ. Клетки культивировали с различными концентрациями препаратов в 3-х повторностях в течение 72 часов при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Пролиферативную способность клеток ОС определяли фотоколо-риметрически с помощью реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega, США) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 492 нм. Статистический анализ результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.
Для оценки уровня экспрессии белков использовали метод вестерн-блоттинга. С этой целью клетки трипсинизировали, дважды промывали PBS и лизировали на льду в течение 20 мин. с использованием буфера RIPA (25 мМ трис-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия и 0,1% SDS), дополненный ингибиторами про-теазы и фосфатазы. Далее экстракты клеточных культур центрифугировали 30 мин. при 13000 об/мин. при 4°С. Осадок удаляли и определяли концентрацию белка в супер-натанте (лизате цельных клеток) с помощью анализа Бредфорда. Образцы, содержащие 30 мкг белка, разделяли на гелях NuPAGE от 4 до 12% Bis-Tris или от 3 до 8% Tris-ацетата (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США), инкубировали со специфическим антителом и визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции
(реагент Western Lightning Plus-ECL, США) на гель-документирующей системе «Fusion Solo WL.2M» (Vilber Lourmat, Коллегиен, Франция). Для иммуноблотинга использовали следующие первичные антитела: фосфо-AKT S473 (#4060P), AKT (#4691P), фосфо-MAPK (#4370S), MAPK (#4696S), фосфо-FGFR (#3471), FGFR1 (#9740S), FGFR2 (#23328S), фосфо-Мet (#3077),
c-Met (#8189) (Cell Signaling, Danvers, MA, ША), FGF-2 (#365106) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, США), бета-актин (A00730-200, Gene Script, Piscataway, NJ, США), вторичные антитела, конъюгированные с HRP, были приобретены у Santa Cruz Biotechnology (США). Денситометрический анализ проводили в программе NIH Image J (Bethesda, США).
Рис. 1. А — уровень экспрессии общих и фосфорилированных форм рецепторов фактора роста фибробластов (FGFR), c-Met, AKT, MAPK и FGF-2, в клеточных линиях фибросаркомы (HT1080) и остеосарком (U2OS, Saos-2). Актин использовался в качестве контроля белковой нагрузки; Б — денситометрический анализ отражает уровень фосфорилированных форм по отношению к уровню общих форм c-Met, FGFR, AKT, MAPK в клеточных линиях фибросаркомы (HT1080) и остеосарком (U2OS, Saos-2); В — на гистограмме отражен средний показатель синергизма доксорубицина с кризотинибом (ингибитор c-Met), BGJ398 (ингибитор FGFR), MK-2206 (ингибитор AKT), U0126 (ингибитор MAPK) на клеточных линиях фибросаркомы (HT1080) и остеосарком (U2OS, Saos-2). Для оценки синергизма доксорубицина с различными селективными ингибиторами использовали программу Synergy Finder
Fig. 1. A — expression level of common and phosphorylated forms of fibroblast growth factor receptors (FGFR), c-Met, AKT, MAPK and FGF-2, in fibrosarcoma (HT1080) and osteosarcoma cell lines (U2OS, Saos-2). Actin was used as a protein load control; B —densitometric analysis reflects the level of phosphorylated forms in relation to the level of common forms of c-Met, FGFR, AKT, MAPK in fibrosarcoma (HT1080) and osteosarcoma cell lines (U2OS, Saos-2); C — the histogram shows the average synergism of doxorubicin with crizotinib (c-Met inhibitor), BGJ398 (FGFR inhibitor), MK-2206 (AKT inhibitor), U0126 (MAPK inhibitor) on fibrosarcoma (HT1080) and osteosarcoma cell lines (U2OS, Saos-2). To evaluate the synergy of doxorubicin with various selective inhibitors, the Synergy Finder program was used
Количество апоптотических клеток подсчитывали с использованием набора Muse Annexin V Dead Cell Kit (Merck KGaA, Германия) в соответствии с инструкциями компании-производителя. В качестве контроля использовали клетки, культивированные в питательной среде без внесения химиопре-паратов. Клетки анализировали на приборе Muse Cell Analyzer (Merck KGaA, Германия). Для всех экспериментов было получено не менее 10 000 событий для каждого образца.
Для оценки интенсивности окрашивания кристаллическим фиолетовым опухолевых клеток под влиянием доксорубицина и МК2206 в отдельности или в комбинации, клеточные линии засевали в чашки Петри p100 и инкубировали в присутствии вышеуказанных соединений в течение 96 часов. Клеточную среду удаляли и добавляли по 5 мл 0,5% раствора кристаллического фиолетового в каждую чашку Петри и инкубировали в течение 20 мин. при комнатной температуре. Чашки Петри многократно промывали в потоке водопроводной воды и высушивали. В каждую чашку Петри добавляли по 3 мл 1% SDS с последующей их инкубацией на рокер-шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа. Оптическую плотность образцов измеряли при длине волны 570 нм с использованием планшетного ридера MultiScan FC (Thermo Fisher Scientific, США).
Все эксперименты проводили в 3-х повтор-ностях. Данные для каждой группы указаны как среднее ± стандартное отклонение (SD). Результаты считали статистически значимыми при p<0,05. Степень комбинированных эффектов определяли количественно с помощью R-пакета вычислительного инструмента Synergy Finder (https://bioconductor. org/packages/release/bioc/html/synergyfinder. html). Эталонная модель взаимодействия с нулевой активностью (ZIP) использовалась для расчета синергии. Эталон ная модель взаимодействия с нулевой активностью (ZIP) использовалась для расчета синергии. Средний показатель синергизма (average
synergy score) использовался в качестве оценки взаимодействия комбинации препаратов. Значение average synergy >10 отражало синергию между двумя препаратами, а<-10, соответствовало антагонистическому взаимодействию между двумя препаратами. Промежуточные значения average synergy (от 10 до -10) свидетельствовали об аддитивном эффекте исследуемых препаратов [22].
Результаты
Методом вестерн-блоттинга в клеточных линиях остеосарком (U2OS и Saos-2) и фи-брасаркомы НТ1080 были обнаружены признаки активации киназ-опосредованных сигнальных путей, регулирующих процессы пролиферации, деления и апоптоза (рис. 1). На рисунке 1А показана фоновая экспрессия общих и фосфорилированных (т.е. активированных) форм киназ c-Met, FGFR, AKT, MAPK, в вышеуказанных клеточных линиях. В дальнейшем было обнаружено, что уровень экспрессии фосфорилированных форм этих киназ (рис. 1Б) положительно коррелировал с синергизмом действия доксорубици-на и их селективных ингибиторов (рис. 1В). Например, фоновая экспрессия фосфорили-рованной формы AKT в клетках линии Saos-2 была менее выраженной по сравнению с клетками остеосаркомы линии U2OS, но превышала аналогичный показатель в клетках фибросаркомы линии HT1080 (рис. 1Б). Это, в свою очередь. обуславливало наибольший показатель синергизма между доксоруби-цином и ингибитором АКТ-сигнального пути MK-2206, наблюдавшегося для клеток линии U2OS (рис. 1В).
Для определения оптимального синергизма между доксорубицином и ингибитором АКТ-сигнального пути, МК2206 был проведен колориметрический анализ цитотоксичности (MTS-тест) с 5 концентрациями доксорубицина кратных 2 (0,0625-1 м^) и 4 концентрациями МК-2206 кратных 2 (1,25-10 м^). С помощью программного обеспечения Synergy Finder были получены двухмерный и трехмерный
Рис. 2. Синергизм доксорубицина и ингибитора AKT-сигнального пути (MK-2206) в клеточных линиях фибросаркомы HT1080 (А) и остеосарком U2-OS, Saos-2 (Б и В, соответственно). Для оценки синергизма доксорубицина с различными селективными ингибиторами использовали программу Synergy Finder. Для определения оптимального синергизма был проведен колориметрический анализ цитотоксичности (MTS-тест) с 5 концентрациями доксорубицина кратных 2 (0,0625-1 мкМ) и 4 концентрациями МК-2206 кратных 2 (1,25-10 мкМ). Средний показатель синергизма (average synergy score) для клеток фибросаркомы HT1080 составил 7,024, для клеток остеосаркомы U2OS — 39,136, для клеток остеосаркомы Saos-2 — 16,587
Fig. 2. Synergism of doxorubicin and AKT-signaling pathway inhibitor (MK2206) in the cell lines of fibrosarcoma HT1080 (A) and osteosarcoma U2-OS, Saos-2 (B and C, respectively). The Synergy Finder program was used to evaluate the synergy of doxorubicin with various selective inhibitors. To determine the optimal synergy, a colorimetric cytotoxicity analysis (MTS test) was performed with 5 concentrations of doxorubicin multiples of 2 (0.0625-1 |im) and 4 concentrations of MK-2206 multiples of 2 (1.25-10 |im). The average synergy score for HT1080 fibrosarcoma cells was 7,024, for U2OS osteosarcoma cells — 39,136, for Saos-2 osteosarcoma cells — 16,587
(surface-plots), отражающие оптимальные дозы доксорубицина и МК2206, которые обуславливают наибольший синергизм (рис. 2). Например, для клеток фибросаркомы (HT-1080) наиболее выраженный цитотоксичес-кий эффект наблюдается при использовании доксорубицина в концентрации 0,0625 мкМ и МК2206 — 5 мкМ, а для клеток остеосар-ком (U2-OS и Saos-2) — 0,125 мкМ и 10 мкМ, соответственно. Средний показатель синергизма (average synergy score) для клеток остеосаркомы Saos-2 составил 16,587, для клеток остеосаркомы U2-OS — 39,136, а для клеток фибросаркомы HT1080 — 7,024.
Анализ жизнеспособности клеток методом световой микроскопии (рис. 3) и окрашивание чашек Петри красителем кристаллическим фиолетовым (рис. 4) подтвердили результаты колориметрического MTS-теста. Например, доксорубицин и МК-2206, использованные в отдельности, не оказывали выраженного цитотоксического эффекта в отношении клеток фибросаркомы (HT1080) и остеосарком (U2OS, Saos-2), в то время как комбинация этих препаратов существенным образом подавляла жизнеспособность опухолевых клеток, о чем свидетельствовало снижение конфлюентности клеток в чашках Петри, визуализируемое путем световой микроскопии (рис. 3), а также снижение интенсивности их окрашивания кристаллическим фиолетовым (рис. 4).
Вышеописанные результаты также коррелировали с результатами проточной ци-тофлюорометрии по подсчету количеств клеток, погибающих по механизму апопто-за. Было показано, что уже спустя 12-часов после инкубации опухолевых клеток всех вышеперечисленных клеточных линий в присутствии доксорубицина и MK-2206 мы наблюдали достоверное повышение (уровень значимости p<0,05) количества апоп-тотических (аннексин V-положительных) клеток линии HT1080, U2OS и Saos-2, по сравнению с контрольными клетками (инкубация с DMSO), а также клетками, нахо-
дившимися под воздействием доксоруби-цина или МК-2206 в отдельности (рис. 5). Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ингибирование АКТ-сигнального пути эффективно сенсибилизирует клетки остеосарком к ингибитору ДНК-топоизомеразы II типа, доксорубицину.
Обсуждение
Результаты исследований последний лет убедительно свидетельствуют о признаках активации АКТ-сигнального пути при многих злокачественных заболеваниях [23-25]. Активация PI3K/AKT/mTOR сигнального пути часто обнаруживается при ОС и СМТ, и может использоваться как независимый прогностический фактор рецидива опухоли, общей и безрецидивной выживаемости [12-15]. Вышеизложенное свидетельствует о перспективности использования ингибиторов данного пути в терапии пациентов как с солидными опухолями, так и онкогематологическими заболеваниями [26]. Помимо очевидной регулирующей роли АКТ-сигнального пути в процессах пролиферации, апоптоза, миграции и дифференцировки опухолевых клеток, в дальнейшем возникло предположение о способности данного сигнального пути модулировать чувствительность опухолевых клеток к химио- и таргетным препаратам различных групп и обуславливать, тем самым, лекарственную устойчивость злокачественных новообразований [27]. Следовательно, комбинирование использование ингибиторов АКТ-сигнального пути и химио- и тар-гетных препаратов, может рассматриваться в качестве перспективного подхода для ре-сенситизации злокачественных новообразований к химио- и таргетным препаратам. Результаты последующих исследований, в том числе, проведенные нашей научной группой, полностью подтвердили правомочность данной точки зрения. Например, ин-гибирование АКТ-сигнального пути в эстроген-положительных клетках рака молочной железы (РМЖ), резистентных к палбоциклибу
Рис. 3. Результаты световой микроскопии (увеличение 10х). Клетки линии фибросаркомы HT1080 (А) инкубировали c DMSO (контроль), МК2206 (5 цМ), доксорубицином (0,062 цМ) и комбинацией препаратов в течение 96 часов. Клетки линии остеосаркомы U2OS (Б) и Saos-2 (B) инкубировали с DMSO (контроль), МК2206 (10 цМ), доксорубицином (0,125 цМ) и комбинацией в течение 96 часов
Fig. 3. Results of light microscopy (magnification 10x). Fibrosarcoma HT1080 (A) cells were incubated with DMSO (control), MK2206 (5 цМ), doxorubicin (0.062 цМ) and a combination of drugs for 96 hours. Osteosarcoma cells U2OS (B) and Saos-2 (C) were incubated with DMSO (control), МК2206 (10 цМ), doxorubicin (0.125 цМ) and a combination for 96 hours
A.
Контроль
Доксорубицин
MK2206
Доксорубицин
Доксорубицин
МК2206 + Доксорубицин
МК2206 + Доксорубицин
(высокоселективный ингибитор циклинзави-симых киназ 4 и 6) с помощью эверолимуса (селективный ингибитор mTOR) приводило в ресенситизации опухолевых клеток линии MCF-7 у палбоциклибу [28]. Аналогичным образом, были показаны преимущества комбинированного использования палбоциклиба и ингибиторов АКТ-сигнального пути в отношении клеток тройного негативного РМЖ [29]. В дальнейшем были получены доказательства о взаимосвязи между активацией АКТ-сигнального пути в клетках тройного
негативного РМЖ и их резистентностью к хи-миопрепаратам, нарушающим динамическое состояние микротрубочек таксанового и не-таксанового ряда, в частности, паклитаксе-лу и эрибулину, соответственно [30, 31]. Этот факт может являться следствием способности актин-связывающих белков (например, CapG и трасгелина-2) индуцировать активацию АКТ-сигнального пути в опухолевых клетках [30]. В связи с этим вполне логичным выглядят данные о способности ингибиторов некоторых сигнальных молекул АКТ-
ПОВОЛЖСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ
ВЕСТНИК Том 13, №3. 2022
Рис. 4. A-В — снимки чашек Петри после их окрашивания кристаллическим фиолетовым (КФ). Клетки линии фибросар-комы HT1080 (А) инкубировали с DMSO (контроль), МК2206 (5 pM), доксорубицином (0,062 pM) и комбинацией препаратов в течение 96 часов. Клетки линии остеосаркомы U2OS (Б) и Saos-2 (B) инкубировали с DMSO (контроль), МК2206 (10 pM), доксорубицином (0,125 pM) и комбинацией в течение 96 часов; Г — интенсивность окрашивания клеток КФ, полученных с помощью спектрофотометрии при длине волны 492 нМ
Fig. 4. A-С — pictures of Petri dishes after they are stained with crystal violet (CF). Fibrosarcoma HT1080 (A) cells were incubated with DMSO (control), MK2206 (5 pM), doxorubicin (0.062 pM) and a combination of drugs for 96 hours.Osteosarcoma cells U2OS (B) and Saos-2 (С) were incubated with DMSO (control), MK2206 (10 pM), doxorubicin (0.125 pM) and a combination for 96 hours; D — the intensity of staining of CF cells obtained by spectrophotometry at a wavelength of 492 nM
Рис. 5. Изменения количества (в %) аннексин V-позитивных клеток (суммарные данные раннего и позднем апоптоза). (А) Клеточная линия фибросаркомы (HT1080) инкубировали c DMSO (контроль), МК2206 (5 цМ), доксорубицином (0,062 цМ) и комбинацией препаратов в течение 12 часов. Клеточные линии остеосаркомы U2OS (Б) и Saos-2 (В) инкубировали с DMSO (контроль), МК2206 (10 цМ), доксорубицином (0,125 цМ) и комбинацией в течение 12 часов. Уровень значимости *— p<0,05 Fig. 5. Changes in the numbers (in %) of annexin V-positive cells (total data of early and late apoptosis). (A) The fibrosarcoma cell line (HT1080) was incubated with DMSO (control), MK2206 (5 цМ), doxorubicin (0.062 цМ) and a combination of drugs for 12 hours. Osteosarcoma cell lines U2OS (B) and Saos-2 (C) were incubated with DMSO (control), МК2206 (10 цМ), doxorubicin (0.125 цМ) and a combination for 12 hours. Significance level *— p<0.05
опосредованного пути (например, mTOR) потенцировать цитотоксические эффекты данных химиопрепаратов в отношении клеток тройного негативного РМЖ [32, 33].
Аналогичным образом были получены доказательства о взаимосвязи между активацией АКТ-сигнального пути в опухолевых клетках и их резистентностью к антиметаболитам, например, 5-фторурацилу и гем-цитабину, что в свою очередь, объясняет способность ингибиторов АКТ-сигнального пути повышать чувствительность опухолевых клеток к этим химиопрепаратам [34-36]. В связи с вышеизложенным, вполне логичными выглядят проходящие в настоящее время клинические испытания по изучению эффективности ингибиторов АКТ-сигнального пути, используемых в сочетании с лекарственными препаратами различных групп в терапии различных злокачественных новообразований, в первую очередь, у пациентов с различными формами РМЖ. В частности, изучается эффективность комбинированно-
го применения паклитаксела с препаратами, блокирующими активность Акжиназы — МК-2206 (N00126314), AZD5363 (торговое название капиварсетиб) (N003997123). Аналогичным образом, проводятся клинические испытания на предмет изучения способности препаратов, блокирующих активность Р13К-киназы (BYL719 — алпе-лесиб; GDC-0980 — апитолисиб; XL147 — пиралисиб) повышать чувствительность клеток РМЖ к паклитакселу (N002038010, NCT01254526 и N001042925, соответственно). Изучается также способность ингибиторов mTOR (эверолимус) повышать терапевтический эффект паклитаксела у пациентов с различными формами РМЖ (N000411788).
Исследования нашей научной группы также показали эффективность использования ингибиторов рецепторных и нереценторных тиро-зинкиназ в сенситизации опухолевых клеток к химиопрепаратам. Например, было показано, что ингибитор FGFR-сигнального пути BGJ398 ресенситизацию опухолевых клеток
РМЖ, резистентных к паклитакселу [37, 38]. Также было выявлена способность ингибитора АКТ-сигнального пути, МК-2206 вызывать сенситизацию клеток СМТ, а также гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) к некоторым химиопрепаратам, например, ингибитору ДНК-топоизомеразы II типа, доксорубицину. Было обнаружено, что ингибирование активности PI3K/AKT/ mTOR сигнального пути сенситизирует СМТ, а также ГИСО (в том числе, резистентные к таргетному препарату иматинибу мезилату) к воздействию низких концентраций док-сорубицина [39]. Изучение молекулярных механизмов данного феномена позволило выявить способность ингибиторов АКТ-сигнального пути нарушать процессы репарации поврежденной ДНК по механизму гомологичной рекомбинации, что объясняло способность данных таргетных препаратов вызывать сенситизацию опухолевых клеток к ДНК-повреждающим агентам. В дальнейшем нами был также доказан факт активации AKT-сигнального пути в клетках саркомы Юинга, что также делает этот путь привлекательной мишенью для сенситиза-ции опухолевых клеток к агентам, повреждающим ДНК, в частности, к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа c помощью ингибитора AKT1-3 - MK-2206 [40], так и ингибиторов эффекторной сигнальной молекулы -mTOR — эверолимуса и рапамицина [41].
Результаты настоящего исследования иллюстрируют способность ингибитора АКТ-сигнального пути MK-2206 повышать чувствительность клеток ОС к доксорубицину in vitro. Несмотря на обнаруженный нами факт активации данного пути в клетках ОС, использование ингибитора в отдельности не приводило к существенному снижению скорости пролиферации опухолевых клеток и их апоптозу. Тем не менее, использование MK-2206 в комбинации с доксорубицином в значительной степени усиливало цитотокси-ческие свойства химиопрепарата. Важно отметить, что ингибиторы ДНК-топоизомеразы
II типа, в частности доксорубицин, являются основными химиопрепаратами, включенными в большинство протоколов для терапии пациентов с ОС. Описаны две традиционные схемы химиотерапии: одна включает использование доксорубицина (45 мг/м2) в сочетании с цисплатином (100-120 мг/м2), а другая включает комбинированное использование метотрексата (8-12 г/м2), цисплатина (120 мг/м2) и доксорубицина (60 мг/м2) [42-45]. Поэтому усиление ци-тотоксических свойств ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа путем ингибирования AKT/mTOR-сигнального пути в клетках ОС можно рассматривать как перспективный подход к разработке новых терапевтических стратегий в отношении пациентов с ОС, в том числе, на фоне уже развившейся резистентности опухоли к некоторым химиопре-паратам, используемым в настоящее время в лечении пациентов с ОС.
Заключение
Уровень экспрессии фосфорилированных форм c-Met, FGFR, AKT и MAPK киназ в клетках ОС положительно коррелирует с синер-гетическим эффектом оксорубицина и селективных ингибиторов соответствующих киназ — кризотиниба, BGJ398, MK-2206, U0126. Результаты исследования доказывают способность ингибитора АКТ-сигнального пути МК-2206 повышать чувствительность клеток ОС к доксорубицину и открывают перспективы для изучения клинической эффективности их комбинированного использования в терапии пациентов с ОС, в том числе, на фоне развившейся химиорезистентности опухоли.
Информация о конфликте интересов:
Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов
Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № № 21-75-00014)
Литература
1. Lindsey B.A., Markel J.E., Kleinerman E.S. Osteosarcoma overview // Rheumatol. Ther. — 2017. — 4. — P. 25-43. doi: 10.1007/s40744-016-0050-2
2. Gorlick R., Anderson P., Andrulis I., et al. Biology of childhood osteogenic sarcoma and potential targets for therapeutic development: meeting summary // Clin. Cancer Res. — 2003 Nov. — 9 (15). — P. 5442-5453.
3. Bishop МЖ, Janeway K.A., Gorlick R. Future directions in the treatment of osteosarcoma // Curr Opin Pediatr. — 2016. — 28 (1). — P. 26-33. doi: 10.1097/IVIOR0000000000000298
4. Ritter J., Bielack S.S. Osteosarcoma // Ann. Oncol. — 2010. — 21 (Suppl 7). — P. vii320-vii325.
doi: 10.1093/annonc/mdq276
5. Rastogi S., Aggarwal A., Tiwari A., Sharma V. Chemotherapy in nonmetastatic osteosarcoma: recent advances and implications for developing countries // J. Glob. Oncol. — 2018 Sep. — 4. — P. 1-5.
doi: 10.1200/JGO.2016.007336
6. Burns J., Wilding C.P., Jones R.L., Huang P.H. Proteomic research in sarcomas — current status and future opportunities // Semin Cancer Biol.—2020 Apr.—61. — P. 56-70. doi: 10.1016/j.semcancer.2019.11.003
7. Harrison D.J., Geller D.S., Gill J.D., et al. Current and future therapeutic approaches for osteosarcoma // Expert Rev. Anticancer Ther. — 2018. — 18 (1). — P. 39-50. doi: 10.1080/14737140.2018.1413939
8. West K.A., Castillo S.S., Dennis P.A. Activation of the PI3K/ Akt pathway and chemotherapeutic resistance // Drug Resist Updat. — 2002 Dec. — 5 (6). — P. 234-48.
doi: 10.1016/s1368-7646(02)00120-6
9. Avan A., Narayan R., Giovannetti E., Peters G.J. Role of Akt signaling in resistance to DNA-targeted therapy // World J. Clin. Oncol. — 2016 Oct. — 7 (5). — P. 352-369. doi: 10.5306/wjco.v7.i5.352
10. Kim D., Dan H.C., Park S., et al. AKT/PKB signaling mechanisms in cancer and chemoresistance // Front Biosci. — 2005 Jan. — 10. — P. 975-87. doi: 10.2741/1592
11. !cCubrey J.A., Steelman L.S., Abrams S.L., et al. Roles of the RAF/HEK/ERK and PI3K/PTEN/AKT pathways in malignant transformation and drug resistance // Adv. Enzyme Regul. — 2006. — 46. — P. 249-79. doi: 10.1016/j.advenzreg.2006.01.004
12. Zhang J., Yu X.H., Yan Y.G., et al. PI3K/AKT signaling in osteosarcoma // Clin. Chim. Acta. — 2015. — 444. — P. 182-192. doi: 10.1016/j.cca.2014.12.041
13. Zhou Y., Zhu L.B., Peng A.F., et al. LY294002 inhibits the malignant phenotype of osteosarcoma cells by modulating the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT/ fatty acid synthase signaling pathway in vitro // Mol. Hed. Rep. — 2015. — 11. — P. 1352-1357.
doi: 10.3892/mmr.2014.2787
14. Mateo-Lozano S., Tirado O.M., Notario V. Rapamycin induces the fusion-type independent downregulation of the EWS/FLI-1 proteins and inhibits Ewing's sarcoma cell proliferation // Oncogene. — 2003. — 22. — P. 9282-9287. doi: 10.1038/sj.onc.1207081
15. Manara M.C., Nicoletti G., Zambelli D., et al. NVP-BEZ235 as a new therapeutic option for sarcomas // Clin. Cancer Res. — 2010 Jan. — 16 (2). — P. 530-40. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-09-0816
16. MacEwen E.G., Kutzke J., Carew J., et al. c-Met tyrosine kinase receptor expression and function in human and canine osteosarcoma cells // Clin. Exp. Metastasis. — 2003. — 20 (5). — P. 421-30. doi: 10.1023/a:1025404603315
17. Pignochino Y., Grignani G., Cavalloni G., et al. Sorafenib blocks tumour growth, angiogenesis and metastatic potential in preclinical models of osteosarcoma through a mechanism potentially involving the inhibition of ERK1/2, MCL-1 and ezrin pathways // Mol Cancer. — 2009 Dec. — 8. — P. 118. doi: 10.1186/14764598-8-118
18. Messerschmitt P.J., Rettew A.N., Brookover R.E., et al. Specific tyrosine kinase inhibitors regulate human osteosarcoma cells in vitro // Clin. Orthop Relat Res. — 2008 Sep. — 466 (9). — P. 2168-75.
doi: 10.1007/s11999-008-0338-9
19. Ueda T., Healey J.H., Huvos A.G., Ladanyi M. Amplification of the MYC gene in osteosarcoma secondary to paget's disease of bone // Sarcoma. — 1997. — 1. — P. 131-134. doi: 10.1080/13577149778209
20. Han G., Wang Y., Bi W. C-Myc overexpression promotes osteosarcoma cell invasion via activation of MEK-ERK pathway // Oncol. Res. — 2012. — 20. — P. 149-156. doi: 10.3727/096504012X13522227232237
21. Chen D., Zhao Z., Huang Z., et al. Super enhancer inhibitors suppress MYC driven transcriptional amplification and tumor progression in osteosar-coma // Bone Res. — 2018 Apr. — 6. — P. 11.
doi: 10.1038/s41413-018-0009-8
22. Yadav B., Wennerberg K., Aittokallio T., Tang J. Searching for drug synergy in complex dose-response landscapes using an interactionpotency model // Comput. Struct. Biotechnol. J. — 2015. — 13. — P. 504-513. doi: 10.1016/j.csbj.2015.09.001
23. Altomare D.A., Tanno S., De Rienzo A., et al. Frequent activation of AKT2 kinase in human pancreatic carcinomas // J. Cell Biochem. — 2002. — 87 (4). — P. 470-6. doi: 10.1002/jcb.10287
24. Rychahou P.G., Kang J., Gulhati P., et al. Akt2 overexpression plays a critical role in the establishment of colorectal cancer metastasis // Proc. Natl. Acad. Sci U S A. — 2008 Dec. — 105 (51). — P. 20315-20. doi: 10.1073/pnas.0810715105
25. Shoji K., Oda K., Nakagawa S., et al. The oncogenic mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in endometrial carcinomas // Br. J. Cancer. — 2009 Jul. — 101 (1). — P. 145-8. doi: 10.1038/sj.bjc.6605109
26. Steelman L.S., Stadelman K.M., Chappell W.H., et al. Akt as a therapeutic target in cancer // Expert Opin. Ther. Targets. — 2008 Sep. — 12 (9). — P. 1139-65. doi: 10.1517/14728222.12.9.1139
27. West K.A., Castillo S.S., Dennis P.A. Activation of the PI3K/Akt pathway and chemotherapeutic resistance / Drug Resist Updat. — 2002 Dec. — 5 (6). — P. 234-48. doi: 10.1016/s1368-7646(02)00120-6
28. Chen L., Yang G., Dong H. Everolimus Reverses Palbociclib Resistance in ER+ Human Breast Cancer Cells by Inhibiting Phosphatidylinositol 3-Kinase(PI3K)/ Akt/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Pathway // Med. Sci Monit. — 2019 Jan. — 25. — P. 77-86. doi: 10.12659/MSM.912929
29. Cretella D., Ravelli A., Fumarola C., et al. The antitumor efficacy of CDK4/6 inhibition is enhanced by the combination with PI3K/AKT/mTOR inhibitors through impairment of glucose metabolism in TNBC cells // J. Exp. Clin. Cancer Res. — 2018 Mar. — 37 (1). — P. 72. doi: 10.1186/s13046-018-0741-3
30. Chi Y., Xue J., Huang S., et al. CapG promotes resistance to paclitaxel in breast cancer through transactivation of PIK3R1/P50 // Theranostics. — 2019 Sep. — 9 (23). — P. 6840-6855. doi: 10.7150/thno.36338
31. Liu L., Meng T., Zheng X., et al. Transgelin 2 Promotes Paclitaxel Resistance, Migration, and Invasion of Breast Cancer by Directly Interacting with PTEN and Activating PI3K/Akt/GSK-3P Pathway // Mol CancerTher.—2019 Dec. — 18 (12). — P. 2457-2468. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-19-0261
32. Owusu-Brackett N., Evans K.W., Akcakanat A., et al. TAK228 enhances antitumor activity of eribulin in triple negative breast cancer // Oncotarget. — 2019 Aug. — 10 (49). — P. 5011-5019.
doi: 10.18632/oncotarget.27082
33. Wen W., Marcinkowski E., Luyimbazi D., et al. Eribulin Synergistically Increases Anti-Tumor Activity of an mTOR Inhibitor by Inhibiting pAKT/pS6K/pS6 in Triple Negative Breast Cancer // Cells. — 2019 Aug. — 8 (9). — P. 1010. doi: 10.3390/cells8091010
34. Choi E.J., Kim G.H. 5-Fluorouracil combined with apigenin enhances anticancer activity through induction of apoptosis in human breast cancer MDA-MB-453 cells // Oncol Rep. — 2009 Dec. — 22 (6). — P. 1533-7. doi: 10.3892/or_00000598
35. Yao X., Tu Y., Xu Y., et al. Endoplasmic reticulum stress confers 5-fluorouracil resistance in breast
cancer cell via the GRP78/OCT4/lncRNA MIAT/ AKT pathway // Am. J. Cancer Res. — 2020 Mar. —
10 (3). — P. 838-855.
36. Wu Z.H., Lin C., Liu M.M., et al. Src Inhibition Can Synergize with Gemcitabine and Reverse Resistance in Triple Negative Breast Cancer Cells via the AKT/c-Jun Pathway // PLoS One. — 2016 Dec. —
11 (12). — P. e0169230.
doi: 10.1371/journal.pone.0169230
37. Boichuk S., Dunaev P., Mustafin I., et al. Infigratinib (BGJ 398), a Pan-FGFR Inhibitor, Targets P-Glyco-protein and Increases Chemotherapeutic-Induced Mortality of Multidrug-Resistant Tumor Cells // Biomedicines. — 2022 Mar. — 10 (3). — P. 601.
doi: 10.3390/biomedicines10030601
38. Mani S., Hande A., Boichuk S. Triple-Negative Breast Cancer: the Current Aspects of Pathogenesis and Therapies // BioNanoSci. — 2022. https://doi.org/10.1007/s12668-022-00991-1
39. Boichuk S., Bikinieva F., Nurgatina I., et al. Inhibition of AKT-Signaling Sensitizes Soft Tissue Sarcomas (STS) and Gastrointestinal Stromal Tumors (GIST) to Doxorubicin via Targeting of Homology-Mediated DNA Repair // Int. J. Mol Sci. — 2020 Nov. — 21 (22). — P. 8842. doi: 10.3390/ijms21228842
40. Galembikova A., Boichuk S. Targeting of AKT-Signaling Pathway Potentiates the Anti-cancer Efcacy of Doxorubicin in A673 Ewing Sarcoma Cell Line // BioNanoSci. — 2021. https://doi.org/10.1007/s12668-021-00901-x
41. Бойчук С.В., Дунаев П.Д., Галембикова А.Р. Инги-бирование AKT-сигнального пути в саркомах мягких тканей — новый подход к их сенситизации к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа // Клиническая патофизиология. — 2021. — 27 (3). — C. 75-87.
42. Casali P.G., Bielack S., Abecassis N., et al. Bone sarcomas: ESMO-PaedCan-EURACAN clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up // Ann. Oncol. — 2018. — 29. — P. iv79-iv95.
doi: 10.1093/annonc/mdy310
43. Picci P. Osteosarcoma (osteogenic sarcoma) // Orphanet J. of Rare Dis. — 2007. — 2. — 6.
doi: 10.1186/1750-1172-2-6
44. Zhang Y., Yang J., Zhao N., et al. Progress in the chemotherapeutic treatment of osteosarcoma (Review) // Oncol. Lett. — 2018. — 15. — P. 6228-6237. doi: 10.3892/ol.2018.9434
45. Li S., Sun W., Wang H., et al. Research progress on the multidrug resistance mechanisms of osteosarcoma chemotherapy and reversal // Tumor Biol. — 2015. — 36. — P. 1329-1338. doi: 10.1007/s13277-015-3181-0
