CC BY
39
УДК 576.895.42(571.1/5)(1-21): 579.834.114
A.B. Рябченко, А.Л. Мамаев
ИНФИЦИРОВАННОСТЬ КЛЕЩЕЙ IXODES PERSULCATUS, ОТЛОВЛЕННЫХ ВЕСНОЙ 2006 г. В ЛЕСОПАРКОВОЙ ЗОНЕ НОВОСИБИРСКОГО АКАДЕМГОРОДКА, СПИРОХЕТАМИ BORRELIA BURGDORFERI S.L.
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Настоящая работа посвящена изучению зараженности клещей Ixodes persulcatus Schulze спи рохетами Borrelia burgdorferi s.l. Исследовались клещи, отловленные весной 2006 г. в рекреа ционной зоне Новосибирского научного центра. Инфицированность клещей спирохетам) определяли методом однораундовой ПЦР. Зараженность клещей, установленная этими ме тодами составила 27,0±4,0%. Геновидовую принадлежность спирохет определяли с использо ванием метода, описанного Postic D. et al. (1994) в модификации Beklemishev A.B. et al. (2003) Было установлено, что в исследованной популяции клещей циркулируют только два генови да боррелий: Borrelia garinii и Borrelia afzelii, с существенным преобладанием первого.
Ключевые слова: клещи Ixodes persulcatus, Borrelia burgdorferi s.l., геновид, В. garinii, В. afzelii зараженность, Лайм-боррелиоз, ПЦР, ПДРФ, генотипирование
Введение
Лайм-боррелиоз, или иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) — трансмиссивная природно-очаговая инфекция, передаваемая человеку с укусами иксодовых клещей (Ixodes persulcatus Schulze). Возбудителями ИКБ у человека являются спирохеты трех геновидов, относящихся к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.): Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.), Borrelia afzelii и Borrelia garinii. Каждый из названных геновидов вызывает свойственные для него клинические формы заболевания: артрит, нейробор-релиоз, хронический атрофический дерматит, соответственно [1]. Еще в 90-х годах прошлого века было установлено, что в популяциях иксодовых клещей, распространенных на территории России, циркулируют только два геновида боррелий — В. garinii и В. afzelii с доминирующим распространением первого [2, 3]. Однако уже в 2001 г. появились сообщения об обнаружении геновида В. burgdorferi sensu stricto в отдельных популяциях клещей I. persulcatus Schulze в европейской части России [4-6], что свидетельствует о распространении этого геновида с территории Западной Европы на восток. Таким образом, ежегодный мониторинг зараженности иксодовых клещей возбудителями ИКБ на урбанизированных территориях России важен как для оценки эпидемиологического состояния по ИКБ, так и для прогноза заболеваемости ИКБ и форм его течения. В связи с этим целью настоящей работы явилось исследование зараженности клещей
I. persulcatus, населяющих рекреационную зош Академгородка, спирохетами Borrelia burgdorfer s.l. и определение геновидового состава спиро хет.
Материалы и методы
Сбор клещей. Сбор клещей (Ixodes persulcatus Schulze) проводили флаговым методом в лесо парковой зоне Новосибирского научного центр; (ННЦ) в мае 2006 г. Было отловлено 590 взрос лых особей обоих полов.
Выделение суммарного препарата нуклеиновых кислот из клещей. ДНК выделяли толькс из живых клещей. Каждого клеща гомогенизировали в 100 мкл 4M раствора гуанидинтиоционата содержащего гликоген, и прогревали при 60 °С i течение часа в твердотельном термостате. Зател-проводили фенольно-хлороформную экстракцию ДНК из лизата клещей. ДНК осаждали из водной фазы равным объемом изопропилового спирта осадки промывали дважды 70% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл ТЕ-бу-фера. Препараты ДНК хранили в ТЕ-буфере при -20 °С. В ПЦР использовали по 3 мкл препарата на 30 мкл реакционной смеси.
Обнаружение ДНК боррелий с помощью ПЦР проводили по методике [10] с некоторыми модификациями [3]. Ампликоны анализировали в 6% полиакриламидном геле (ПААГ).
Генотипирование боррелий осуществляли с помощью анализа полиморфизма длин рест-риктных фрагментов (ПДРФ), получаемых гидролизом ампликонов межгенной области rrf-rrl
58
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
рестриктазой Msel или Tru9I [10|. Продукты гидролиза анализировали в 16% ПААГ.
Электрофорез ДНК в ПААГ. Электрофорез проводили по общепринятым методикам |9]. Гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуально анализировали и фотографировали при освещении УФ-светом с длиной волны 312 нм на цифровой фотоаппарат фирмы Sony (модель DSC-F717), оборудованный соответствующим с ветовы м фил ьтром.
Результаты исследования и обсуждение
Зараженность клещей боррелиями оценивали с помощью обнаружения геномных ДНК спирохет методом Г1ЦР. Способ включал выделение суммарного препарата ДНК из каждого клеща и последующее выявление в нем геномной ДНК боррелий с помощью ИП.Р. В качестве амплифи-цируемой мишени использовали специфичную для представителей комплекса В. burgdorferi s.l. межгенную область генов рибосомальных 5S (nf) п 23S (гг/) РНК [ 101. Продукты ПЦР анализировали в 6% ПААГ. В случае положительного ответа длина ампликона составляет 250-270 п.н. Для выявления ложноотрицательных результатов анализа, обусловленных присутствием в препарате исследуемой ДНК ингибиторов ПЦР, реакцию проводили в присутствие ДНК внутреннего контроля с дополнительной парой соответствующих ей праймеров. В качестве ДНК внутреннего контроля использовали ампликон фрагмента генома вируса гепатита В (HBV). Размер ампликона, получаемого на ДНК внутреннего контроля, составляет 150 п.н. В качестве положительного контроля в ПЦР использовали геномную ДНК В .burgdorferi sensu stricto эталонного штамма В31, размер ампликона межгенной области rrf-rrl которого составляет 250 п.н. На рисунке 1 представлены результаты типичного анализа образцов ДНК клешей на присутствие в них геномных ДНК боррелий.
На рис. 1 четко видно, что на дорожках 5,7,9 и 10 присутствует полоса продукта ПЦР, соответствующего по своему размеру ампликону межген-ной области rrf-rrl (-250 п.н.). Иными словами в образцах ДНК клещей, результаты анализа которых представлены на дорожках 5, 7, 9 и 10, присутствует ДНК спирохет В. burgdorferi s.l. В целом за весенний период 2006 г. нами были проанализированы 590 клещей, из них в 154 была обнару-
1 2 3456 789 10
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации межгенной области rrf-rrl,
полученных методом ПЦР на образцах ДНК, выделенных из клещей. Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле.
Дорожки: 1 — отрицательный контроль; 2
— маркерная ЛИК (р1!С19 гидролизованная рестриктазой М.чр1); 3-9 - продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК клещей; 10 — продукт ПЦР на геномной ДНК В.Ьиг&1оф>п ¿л. шт.В31 (положительный контроль)
жена ДНК спирохет В. Ьищс1офп я.1. Результаты этих анализов представлены в таблице.
Определение геновидовой принадлежности спирохет В. bшgdorferi 5.1, обнаруженных в исследованных клешах, проводили с помощью метода генотипирования их геномных ДНК предложенного Ро81к- е1 а1. 110). Этот метод основан на анализе полиморфизма длин рестриктных фрагментов, полученных гидролизом амплико-нов межгенной области п{-п1 рестриктазой \IseI или Тги91. Представителям каждого геновида и геномной группы спирохет В. Ьи^сЬ^еп 5.1. свойственен определенный набор отличающихся по размерам рестриктных фрагментов ампликона межгенной области \rf-ni 110]. Таким образом, по результатам электрофоретического анализа полученных рестриктов можно судить о геновидовой принадлежности боррелий, содержащихся в исследуемом клеще. С использованием этого метода нами были исследованы 68 образцов ДНК, в которых по данным ПЦР-анализа была обнаружена геномная ДНК спирохет В. ЬигщЛо^еп в.!. На рисунке 2 представлены результаты одного из таких анализов.
Таблица
Зараженность взрослых клещей I. регхи1саШх, отловленных в рекреационной зоне ННЦ и весенний период 2006 г., различными геновидами спирохет В. Ьиг&1ог/еп а\/.
Количество обследованных клещей Доля ПЦР-позитивных клещей, (%) Количество генотини хшанных ПЦР-позитивных образков ДНК из клешей
Суммарное количество В. garinii NT29 В. garinii 20047Т В. garinii NT29 + 20047Т В. afzelii В. garinii + В. afzelii
590 27.0±4,0 68 10 33 3 16 6
1 2 3 4 5 6
•РН
34
Рис. 2. Элсктрофореграмма рестриктных фрагментов, полученных в процессе генотипирочания анализируемых образцов ДНК В.burgdorferi s.I. по методике 110]. Электрофорез проводили в 16% полиакриламидном геле. Дорожки: 1 — маркер молекулярных масс (ДНК pUC19. гидролизованная рестриктазой MspI);
2-6 — ампликоны мешенной области rrf-irl анализируемых образцов ДНК В.burgdorferi s.I., гидролизованные рестриктазой 'Гги 91
Судя по картине электрофореза образцов ам-пликонов, гидролизованных рестриктазой Тги91 (Рис. 2), два исследуемых образца ампликонов (дорожки 2 и 3) получены в результате амплификации межгениой области rrf-rrl на геномных Д11К спирохет, относятся к геновиду B.garinii (геномная группа NT 29), два образца (дорожки 4 и 5) — к геиовиду В. afzelii, и одни образец гидролизованных ампликонов (дорожка 6) - иа смеси геномных ДНК спирохет, представлен смесью гено-видов B.garinii (геномная группа NT 29), B.garinii
(геномная группа 20047) и В. afzelii. Результать генотипирования 68 образцов ДНК методом [ 10 представлены в таблице. Как следует из данны.' таблицы, доминирующим геновидом являют« спирохеты В. garinii, включающие представителей двух геномных групп: NT29 и 20047. Шесп клещей из 68 были инфицированы спирохетам! обоих геновидов.
Заключение
В результате проведенных исследований былс установлено, что, как и в предыдущие годы наблюдений [3, 12], в популяции клещей /. persulcatus населяющих рекреационную зону Н НЦ, циркулируют только два геновида спирохет В. burgdorfer, s.I.: В. garinii и В. afzelii, с существенным преобладанием первого.
Полученные результаты свидетельствуют с том, что на протяжении последних 8 лет не наблюдается изменений в геновидовом составе спирохет В. burgdorferi s.I.. циркулирующих в исследуемой популяции клешей 1. persulcatus, хотя отмечаются зависимые от года наблюдений колебания в количестве инфицированных спирохетами особей.
INFECTION RATE OF IXODES PERSULCATUS TICKS, CAUGHT IN THE RECREATION ZONE OF NOVOSIBIRSK ACADEMTOWN IN THE SPRING 2006, BY BORRELIA BURGDORFERI S.L. SPIROCHETE A.V. Ryabchenko, A.L. Mamaev
The present work is devoted to studying of infection rate of Ixodes persulcatus ticks by Borrelia burgdorferi s.I. spirochetes. The ticks caught in the spring 2006 in recreation zone of the Novosibirsk scientific centre were investigated. The infection rate of ticks by spirochetes was determined by a PCR method and has made 27,0±4,0. A belonging of spirochetes to certain genospecies was determined with use of the method described Postic, D. et a!. (1994) with modification by Beklemishev A.B. et al. (2003). It has been shown, that only two genospecies of B. burgdorferi s.I. — Borrelia garinii and Borrelia afzelii circulate in the investigated population of ticks, with essential predominance of the first.
Литература
1. Different genospecies of Borrelia burgdorferi are associated with distinct clinical manifestations in Lyme bor-rcliosis / A.P. van Dam, H. Kuiper, K. Vos, et al. // Clin. Infect. Dis. - 1993. - Vol. 17. - P. 708-717.
2. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neighbouring countries: high incidence of mixed isolates / D. Postic, E. Korenberg, N. Gorelova, et al. // Res. Microbiol. - 1997. - Vol. 148. - P. 691-702.
3. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Ixodes persulcatus ticks in West Siberia, Russia / A.B. Beklemishev, A.K. Dobrotvorsky, A.V.
60
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 r.
Piterina, et al. // FEMS Microbiol Lett. — 2003. — Vol. 227. - №2.-P. 157-161.
4. The first isolation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in Russia / N.B. Gorelova, E.I. Korenberg, D. Postic, et al. // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. — 2001. -Vol. 4.-P. 10-12.
5. Определение генетической гетерогенности в популяции Ixodes persulcatus Schulze (Acari: Ixodidae) в Севе-ро-заїтадной части России и распространения клещевых патогенов, возбудителей болезни Лайма и эрлихиоза, в различных генотипах клещей / А.В Семенов, А.Н. Алексеев, Н.В. Дубинина и др. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. — 2001. — №3. — С. 11-15.
6. Обнаружение Borrelia burgdorferi sensu stricto в Московской области, Россия / Т. Масузава, Р.Л. Наумов, М. Кудекен, и др. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. — 2001. — №2. — С. 52.
7. Primary culture of Borrelia burgdorferi from Ixodes ricinus ticks / M.M. Wittenbrink, C. Reuter, M. L. Manz, et al. // Zentralbl Bakteriol. — 1996. — Vol. 285. — №1.
- P. 20-28.
8. Lyme disease: a selective medium for isolation of the suspected etiological agent, a spirochete / S.E. Johnson, G.C. Klein, G.P. Schmid et al. // J. Clin. Microbiol.
- 1984. - Vol. 19. - №1. - P. 81-82.
9. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. — М., 1984. — 480 с.
10. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf(5S)-rrl(23S) intergenic spacer amplicons. / Postic D., M. Assous, P.A.D. Grimont, et al. // Int. J. Syst. Bacteriol.
- 1994. - Vol. 44. - P. 743-752.
11. Differentiation of Borrelia burgdorferi sensu lato strains using class I lysyl-tRNA synthetase-encoding genes. /N. Mejlhede, A. Monthan, M. Theisen, et al. // Med. Microbiol. Immunol. — 2003. — Vol. 192. — P. 79-83.
12. Characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato from Novosibirsk region (West Siberia, Russia) based on direct PCR. /N. N. Livanova, О. V. Morozova, I. V. Morozov, et al. // Eur. J. Epidemiol. — 2003. — Vol. 18. — №12.
- P. 1155-1158.
