Научная статья на тему 'Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и болезнь Паркинсона: проблема геномной нестабильности'

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и болезнь Паркинсона: проблема геномной нестабильности Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
154
40
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Симонова В.В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и болезнь Паркинсона: проблема геномной нестабильности»

001: 10.24411/2226-079Х-2019-12127

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и болезнь Паркинсона: проблема геномной нестабильности

В.В. Симонова

ФГБНУ "Научный центр неврологии"(Москва)

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), получаемые путем генетического репрограммирования из соматических клеток (чаще всего фибробластов), являются весьма перспективным объектом в изучении фундаментальных основ болезни Паркинсона (БП), особенно ее генетических форм. Появившаяся возможность генерации из ИПСК дофаминергических нейронов дала старт развитию нового подхода к нейротранс-плантации при БП [1]. Однако изучение генома ИПСК обнаруживает в клетках присутствие повышенного уровня геномной нестабильности, что является серьезной проблемой для дальнейшего клинического продвижения данной технологии.

Геномные перестройки ИПСК и их возможные причины

Примерно 10% клеточных линий ИПСК человека содержат по крайней мере одну хромосомную перестройку. Наиболее часто встречаются цитогенетические нарушения в виде аномального изменения числа хромосом -анеуплоидий. Такие перестройки преимущественно затрагивают хромосомы 8, 12, 17, 20 и X [2, 3]. В ДНК плюрипотентных стволовых клеток также обнаружены изменения числа копий хромосомных сегментов (copy number variation — CNV) как результат несбалансированных хромосомных перестроек. Наконец, в геноме ИПСК регистрируются и типичные однонуклеотидные замены, или точковые мутации (single nucleotide polymorphism — SNP) [4]. Однако наиболее опасной формой повреждения ДНК являются двуцепочечные

разрывы молекулы, которые инициируют хромосомные перестройки и ведут к несбалансированному набору генов в ядре клеток.

В процессе генерации ИПСК клетки проходят ряд перестроек. Сам метод репрограм-мирования соматической клетки в ИПСК, который осуществляется путем введения в клетку генов плюрипотентности или их продуктов (РНК, белковые факторы), предполагает прямое или косвенное воздействие на молекулу ДНК. Превращение соматических клеток в ИПСК невозможно без прохождения клеткой этапа стирания/восстановления "эпигенетических меток" (так называемый "сброс эпигенома"). Сущность этого процесса состоит в удалении совокупности метиль-ных групп (СН3), контролирующих активность генов [5]. При этом процесс деметили-рования ДНК ведет к активной транскрипции генов плюрипотентности [6]. Перестройка генома клетки при генерации ИПСК связана с реактивацией Х-хромосомы и потерей импринтинга для некоторых генов [7]. В последнее время высказывается предположение, что приобретение геномом нестабильности при клеточном репрограммировании обусловлено именно эпигенетической памятью, которая в областях с низким метилированием сохраняется в течение многих пассажей [7, 8]. Метилирование ДНК имеет решающее значение в судьбе клеток, так как принимает непосредственное участие в экспрессии генов плюрипотентности [9].

По сравнению с дифференцированными соматическими клетками ИПСК быстрее пролиферируют, приобретая короткий кле-

точный цикл, подобный циклу эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [10]. Такая модификация связана с изменением длительности фазы G1, ответственной за рост клетки, процессы синтеза в ней белков и мРНК. Плюри-потентные клетки тратят приблизительно 65% времени на Б-фазу и только около 15% на фазу G1, в то время как дифференцированные клетки расходуют около 40% времени на фазу G1 [10]. Быстрая репликация клеток коррелирует с появлением в них дополнительного числа центросом, и в этом ИПСК сходны с другими типами быстроделящихся клеток [11]. Являясь основным центром организации микротрубочек, центросомы опосредованно влияют на сегрегацию хромосом в митозе [12]. Однако приобретение дополнительного числа подобных органоидов не является преимуществом для клеток, поскольку есть основания полагать, что хромосомная нестабильность в ИПСК напрямую связана с присутствием дополнительных центросом [13]. Экспрессия репрограммирующих факторов вызывает в генерируемых клетках репликационный стресс, распознаваемый в Б-фазе серин-трео-ниновой протеинкиназой (АТЯ-киназой), отслеживающей повреждения ДНК. В норме эта киназа верифицирует одноцепочечную ДНК в стрессовой репликационной вилке и инициирует ряд реакций, останавливающих клеточный цикл [14], однако в ИПСК (как и в ЭСК) эти контрольные реакции дефектны [15]. Таким образом, быстрая пролиферация ИПСК повышает риск возникновения геномных аберраций, в то время как слабость "контрольных точек" позволяет этим аберрациям проходить через клеточный цикл.

Хромосомную нестабильность могут провоцировать условия культивирования. Так, один из механизмов анеуплоидии заключается в "эффекте стороннего наблюдателя": после возникновения одного события анеу-плоидии в культуре ИПСК соседние с мутант-ной клетки могут также приобретать анеупло-идии путем передачи соответствующих биологически активных веществ через питательную среду или посредством доставки в экзосомах

[16]. Помимо этого высокий уровень анеупло-идий, наблюдаемых в ИПСК, обусловлен нарушением механизмов, влияющих на мито-тическую сегрегацию хромосом, сборку веретена деления, истощение компонента ядерной мембраны ламина В [16]. Необходимо упомянуть также белок сурвивин — ингибитор апоп-тоза, защищающий клетку от полиплоидии благодаря своей функции досмотра "контрольной точки" сборки веретена и цитокинеза. Этот белок имеет прямое отношение к молекулярным процессам, связанным с ИПСК, поскольку он играет роль в поддержании плюрипотентного состояния, участвуя в активации одного из канонических пептидных репрограммирующих факторов плюрипо-тентности — ОМ [17, 18]. Было показано, что нарушение экспрессии сурвивина ведет к развитию полиплоидии в клетках человека [19].

Механизмы геномного надзора и ранимость ИПСК

На сегодняшний день механизмы, которые поддерживают геномную целостность в ИПСК, в значительной степени остаются малопонятными. Каждая клетка сталкивается ежедневно примерно с 104—105 повреждений [20]. Поэтому в клетках отработан сложный, но эффективный механизм репараций ДНК. Однако в ИПСК, как предполагается, геномная нестабильность имеет место на фоне низкой точности восстановления повреждений ДНК [21]. Возможно, на процесс оказывает влияние изменение путей репарации ДНК. Так, например, при лентивирусной трансфек-ции соматических клеток в процессе образования ИПСК показано увеличение активности NHEJ-зависимого пути репарации (негомологичное соединение концов разрыва ДНК с низкой точностью) и, напротив, снижение НЯ-зависимых путей репарации ДНК (гомологичная рекомбинация с высокой точностью восстановления) [22, 23].

Надзор за геномом в ИПСК предположительно достигается с помощью такого механизма, как гиперчувствительность к действию апоптотических агентов, что позволяет быстро

удалять клетки после повреждения наследственного материала [24, 25]. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки легко погибают даже после воздействия на них низких доз генотоксических агентов. В этих клетках по сравнению с фибробластами зафиксировано снижение уровня транскрипции генов семейства ингибиторов апоптоза (Х1АР, В1КС2 и особенно В1КС3). В ИПСК зафиксированы не только низкий порог апоптоза, но и эффективная антиоксидантная защита. Гиперчувствительность к апоптозу в ИПСК опосредуется повышенной экспрессией проапоптотическо-го белка В^-2, а повреждение ДНК предотвращается активацией нескольких антиокси-дантных ферментов, и именно гиперчувствительность к апоптозу позволяет удалять клетки с поврежденной ДНК [24, 26]. В ИПСК значительно возрастает экспрессия нескольких антиоксидантных ферментов — 08ТА2 (в 80 000 раз выше, чем в первичных фиброблас-тах), глутатиона (в 3—4 раза выше), одновременно наблюдается значительное возрастание экспрессии нескольких пероксиредоксинов, которые поглощают активные формы кислорода и органические гидропероксиды, а также глутатионредуктазы [26]. Соответственно, содержание активных форм кислорода в ИПСК, согласно проведенным исследованиям, примерно 10 раз ниже, чем в фибробластах.

Интересно отметить, что при воздействии различных генотоксических факторов накопление ядерных и митохондриальных повреждений ДНК было значительно ниже в ИПСК, чем в фибробластах. В. Баппепшапп й а1. провели сопоставление ИПСК с большой панелью опухолевых клеточных линий и выявили значимо более редкое повреждение ДНК в ИПСК по сравнению с опухолевыми клетками. Примечательно, что, когда недифференцированные и дифференцированные ИПСК подвергались воздействию генотокси-нов, дифференцированные ИПСК явно демонстрировали повышенный уровень повреждения ДНК по сравнению с их недифференцированными аналогами. Как предполагают авторы эксперимента, защита плюри-

потентных стволовых клеток от повреждения ДНК быстро теряется при их дифференци-ровке [24].

В экспериментах, связанных с изучением БП, проблемы геномной стабильности ИПСК приобретают особенно сложный характер. Во-первых, БП является классическим воз-растзависимым заболеванием, частота которого значительно увеличивается у пожилых лиц (до 1—3% в группе старше 70 лет) [1]. Есть основания полагать, что "генетическое поведение" и закономерности функционирования клеточного цикла в фибробластах (либо в репрограммируемых клетках на любых этапах их трансформации и последующей дифферен-цировки), получаемых в результате биопсии от таких пожилых пациентов, могут существенно отличаться от аналогичных характеристик в "молодых" клетках от доноров в возрасте до 40—50 лет. Во-вторых, некоторые мутации в генах БП могут приводить к специфическим цитогенетическим нарушениям. Это, в частности, касается одного из наиболее значимых "паркинсонических" генов -ЬВЯК2: белковый продукт данного гена вовлечен в процесс регуляции F-актина и стабилизацию микротрубочек [27]. Очевидно, что адекватное функционирование микротрубочек веретена деления важно для нормального протекания митоза, поэтому мутации ЬШК2 являются существенным фактором митотиче-ской геномной нестабильности.

Пути решения проблемы

В настоящее время активно идет поиск путей, позволяющих минимизировать появление геномной нестабильности ИПСК. Перспективным направлением для получения репрограммированных клеток стало использование неинтегрирующих подходов доставки генов в клетку или применение белков, проницаемых для клеточной мембраны. На смену ранее применявшимся вирусным системам индукции, таким как лентивирусная и ретро-вирусная, пришли менее "инвазивные" (неинтегрирующие) и более безопасные. Среди них выделяют репрограммирование с

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

(а)

н

и

£ * О * 9 Й

УЗ

О*

Цитогенетический анализ различных клонов линии ИПСК от пациента с БП. а — клон 1: 1 — нормальная хромосома 11; 2 — перестроенный вариант нормальной хромосомы 11 (ёег11). б — клон 4: стрелками указаны нормальные хромосомы 11.

участием РНК-вируса Сендай и безвирусные технологии — использование плазмид, белков, микроРНК, синтетических РНК, "малых молекул" и др. М. Н^Бика е! а1. разработали искусственную хромосому, содержащую ДНК, в которой закодированы 4 основных репро-граммирующих фактора — КШ, с-Мус, Бох2 и Ой4, а также ген, "выключающий" белок р53 [28]. Альтернативный метод заключается в периодическом введении в культуру соматических клеток синтетической мРНК, кодирующей 5 репрограммирующих факторов (КН4, с-Мус, Ой4, Бох2 и Lin28) [29]. Весьма перспективны также попытки получить ИПСК путем применения низкомолекулярных соединений [30].

Для обеспечения целостности генома в культуре ИПСК должны строго поддерживаться условия роста, коррелирующие с уровнем активных форм кислорода. Как высокие, так и низкие уровни последних могут нарушать способность клеток к репрограммирова-нию [31]. К тому же повышенные уровни активных форм кислорода также могут ухудшать дифференцировочный потенциал ИПСК [32]. Показана необходимость подбора оптимального уровня активных форм кислорода для нормального роста клеток в культуре и поддержания в них геномной стабильности.

Наметились определенные успехи в преодолении репликативного стресса. Его снижение во время репрограммирования, достигаемое генетическим или химическим путем, обеспечивает снижение нестабильности генома ИПСК. Положительные результаты дает, в частности, исследование киназы 1 контрольной точки клеточного цикла (СНК1) — фермента, играющего ключевую роль в формировании ответа на повреждение ДНК [16]. Увеличение его уровня снижает вызванный репрограммированием стресс репликации и повышает эффективность генерации ИПСК. Аналогичным образом, добавление нуклеози-дов во время перепрограммирования снижает груз поврежденной ДНК и количество геномных перестроек ИПСК [33]. Перед использованием ИПСК в клинических исследованиях необходимо контролировать специфические гистоновые метки и статус метилирования ДНК выбранной панели [16].

При репрограммировании клеточную линию целесообразно разделять на клоны. Геномная аномалия может проявиться исключительно в одном клоне, как это произошло в наших исследованиях с линией ИПСК от одного из пациентов с БП [27]: на рисунке видно, что клон 1 несет хромосомную перестройку 46,XY,der11 (а), тогда как клон 4 от того же пациента имеет нормальный карио-тип 46^ (б).

Технологии клеточного репрограммирова-ния сегодня продолжают бурно развиваться и имеют очевидные прикладные перспективы.

Одним из наиболее продвинутых разделов медицины в этом отношении являются нейро-дегенеративные заболевания, в первую очередь болезни Паркинсона, Альцгеймера, Ген-тингтона. Очевидно при этом, что трансляция результатов фундаментальных исследований в неврологическую клинику, в том числе применительно к БП, будет невозможна без эффективного решения проблем геномной нестабильности репрограммированных клеток.

Список литературы

1. Симонова В.В. Современные возможности исследования клеточных и молекулярных механизмов болезни Паркинсона. Бюллетень Национального общества по изучению болезни Паркинсона и расстройств движений. 2018;1:9-13.

2. Taapken S.M., Nisler B.S., Newton M.A. et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2011;29:313-4.

3. Martins-Taylor K., Nisler B.S., Taapken S.M. et al. Recurrent copy number variations in human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 2011;29:488-91.

4. Weissbein U., Benvenisty N., Ben-David U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. J. Cell Biol. 2014;204:153-63.

5. Papp B., Plath K. Reprogramming to pluripoten-cy: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 2011;21:486-501.

6. He S., Sun H., Lin L. et al. Passive DNA demethylation preferentially up-regulates plurip-otency-related genes and facilitates the generation of induced pluripotent stem cells. J. Biol. Chem. 2017;292:18542-55.

7. Godini R., Lafta H.Y., Fallahi H. Epigenetic modifications in the embryonic and induced pluripotent stem cells. Gene Expr. Patterns. 2018;29:1-9.

8. Luu P.L., Gerovska D., Schöler H.R., Arauzo-Bravo M.J. Rules governing the mechanism of epigenetic reprogramming memory. Epigenomics. 2018;10:149-74.

9. Singer Z.S., Yong J., Tischler J. et al. Dynamic heterogeneity and DNA methylation in embryonic stem cells. Mol. Cell. 2014;55:319-31.

10. Ghule P.N., Medina R., Lengner C.J. et al. Reprogramming the pluripotent cell cycle: restoration of an abbreviated G1 phase in human

induced pluripotent stem (iPS) cells. J. Cell. Physiol. 2011;226:1149-56.

11. Yang A.H., Kaushal D., Rehen S.K. et al. Chromosome segregation defects contribute to aneuploidy in normal neural progenitor cells. J. Neurosci. 2003;23:10454-62.

12. Schatten H. The mammalian centrosome and its functional significance. Histochem. Cell Biol. 2008;129:667-86.

13. Ganem N.J., Godinho S.A., Pellman D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 2009;460:278-82.

14. Flynn R.L., Zou L. ATR: a master conductor of cellular responses to DNA replication stress. Trends Biochem. Sci. 2011;36:133-40.

15. Desmarais J.A., Hoffmann M.J., Bingham G. et al. Human embryonic stem cells fail to activate CHK1 and commit to apoptosis in response to DNA replication stress. Stem Cells. 2012;30:1385-93.

16. Henry M.P., Hawkins J.R., Boyle J., Bridger J.M. The genomic health of human pluripotent stem cells: genomic instability and the consequences on nuclear organization. Front. Genet. 2018;9:62343.

17. Kapinas K., Kim H., Mandeville M. et al. microRNA-mediated survivin control of pluripo-tency. J. Cell. Physiol. 2015;230:63-70.

18. Mull A.N., Klar A., Navara C.S. Differential localization and high expression of SURVIVIN splice variants in human embryonic stem cells but not in differentiated cells implicate a role for SURVIVIN in pluripotency. Stem Cell Res. 2014;12:539-49.

19. Li F., Ackermann E.J., Bennett C.F. et al. Pleiotropic cell-division defects and apoptosis induced by interference with survivin function. Nat. Cell Biol. 1999;1:461-6.

20. Giglia-Mari G., Zotter A., Vermeulen W. DNA damage response. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2011;3(1):a000745.

21. Zhang M., Wang L., An K. et al. Lower genomic stability of induced pluripotent stem cells reflects increased non-homologous end joining. Cancer Commun. 2018;38:49.

22. Friedberg E.C. A history of the DNA repair and mutagenesis field. The discovery of base excision repair. DNA Repair. 2016;37:A35-9.

23. Weeden C.E., Chen Y.S., Ma S.B. et al. Lung basal stem cells rapidly repair DNA damage using the error-prone nonhomologous end-joining pathway. PLoS Biol. 2017;15(1):e2000731.

24. Dannenmann B., Lehle S., Hildebrand D.G. et al. High glutathione and glutathione peroxi-dase-2 levels mediate cell-type-specific DNA damage protection in human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 2015;4:886-98.

25. Armstrong L., Tilgner K., Saretzki G. et al. Human induced pluripotent stem cell lines show stress defense mechanisms and mitochondrial regulation similar to those of human embryonic stem cells. Stem Cells. 2010;28:661-73.

26. Dannenmann B., Lehle S., Essmann F., Schulze-Osthoff K. Genome surveillance in pluripotent stem cells: low apoptosis threshold and efficient antioxidant defense. Mol. Cell Oncol. 2016;3(2):e1052183.

27. Simonova V. V., Vetchinova A.S., Novosadova E.V. et al. Genone editing and the problem of terta-ploidy in cell modeling of the genetic form of parkinsonism. Biochemistry (Moscow). 2018;83(9):1040-5.

28. Hiratsuka M., Uno N., Ueda K. et al. Integration-free iPS cells engineered using human arti-

ficial chromosome vectors. PLoS One. 2011;6(10):e25961.

29. Warren L., Manos P.D., Ahfeldt T. et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 2010;7:618-30.

30. Lin T., Wu S. Reprogramming with small molecules instead of exogenous transcription factors. Stem Cells Int. 2015;2015:794632.

31. Zhou G., Meng S., Li Y. et al. Optimal ROS signaling is critical for nuclear reprogramming. Cell Rep. 2016;15:919-25.

32. Rönn R.E., Guibentif C., Saxena S., Woods N.B. Reactive oxygen species impair the function of CD90+ hematopoietic progenitors generated from human pluripotent stem cells. Stem Cells. 2017;35:197-206.

33. Ruiz S., Lopez-Contreras A.J., Gabut M. et al. Limiting replication stress during somatic cell reprogramming reduces genomic instability in induced pluripotent stem cells. Nat. Commun. 2015;6:8036.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.