CC BY
44
УДК 571.27
ИНДУКЦИЯ ЗАЩИТНОГО ОТВЕТА В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ И ГЛИОКЛАДИНА ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ BIPOLARIS SOROKINIANA
© Р. И. Касимова1, А. Р. Ахатова1, Р. И. Ибрагимов2, Л. Г. Яруллина1*
1Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, Просп. Октября 71, E-mail: yarullina@bk.ru 2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
E-mail: ibragimov56@yandex. ru
Было проведено изучение продукции перекиси водорода, активности пероксидазы и окса-латоксидазы, уровня экспрессии кодирующих их генов под воздействием хитоолигосахаридов разной степени ацетилирования и биофунгицида глиокладина при инфицировании Bipolaris sorokiniana. Получены данные, свидетельствующие об успешном развитии защитных реакций в растениях при участии Н2О2 и оксидоредуктаз, что предполагает возможность использования данных препаратов для защиты растений от корневой гнили.
Ключевые слова: triticum aestivum, хитоолигосахариды, глиокладин, оксалатоксидаза, пероксидаза, bipolaris sorokiniana, перекись водорода
Введение
С развитием сельского хозяйства все более актуальной становится проблема борьбы с патогенами и вредителями, которые поражают сельскохозяйственные культуры и тем самым приводят к существенным потерям урожая и снижению качества продукции. Наиболее перспективным и экологически безопасным способом защиты растений является использование препаратов, стимулирующих защитные механизмы растительного организма.
Одной из первых ответных реакций растения на инокуляцию патогеном является локальный синтез активных форм кислорода (АФК), в частности перекиси водорода (Н2О2). Перекись водорода выполняет функции вторичного мессенджера при передаче стрессового сигнала в геном клетки, непосредственно ингибирует рост патогена и участвует в лигницификации клеточной стенки [1]. Важным ферментом, участвующим в продукции перекиси водорода, является оксалатоксидаза, окисляющая оксалаты с образованием Н2О2. Учитывая, что щавелевая кислота является фактором патогенности многих возбудителей грибных болезней, утилизация ее растительной оксалатоксидазой обеспечивает успешное протекание защитных реакций. Перок-сидаза - один из важных ферментов «двойного назначения», вовлеченный как в систему генерации, так и утилизации Н2О2. Ее полифункциональность позволяет растению оперативно реагировать на большинство стрессоров биотической и абиотической природы [2]. Весьма важным является поиск препаратов, индуцирующих активность ферментов, участвующих в регуляции уровня Н2О2 при инфицировании растений возбудителями болезней различной трофности.
Задача данного исследования - сравнительное изучение влияния хитоолигосахаридов различной степени ацетилирования и биофунгицида глиокла-
дина на содержание перекиси водорода, ферментативную активность пероксидазы и оксалатоксидазы, а также на экспрессионную активность их генов.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования были использованы корни проростков пшеницы T. aestivum Ь. сорта Жница. Растения выращивали при комнатной температуре (20-22 °С) на светоплощадке с 16-ти часовым светопериодом, освещенностью 12-16 тыс. люкс (лампы ЛД-4, ЛБ-40). Перед посевом семена стерилизовали 80%-ным этанолом (3 мин), промывали дистиллированной водой и проращивали в кюветах на вермикулите. Заражение пшеницы Bipolaris sorokiniana вызывали путем полива основания стеблей 5-суточных проростков суспензией конидий гриба в воде из расчета 106 спор/мл.
Водорастворимые хитоолигосахариды (ХОС) со степенью ацетилирования (СА) 30% и 65%, молекулярной массой 5-7 кД в концентрации 1 мг/л использовали для замачивания семян пшеницы. Хитоолигосахариды 65% СА и 30% СА были приобретены в ЗАО «Сонат» (Москва).
Препарат Глиокладин™ - микробиологический фунгицид на основе Trichoderma harzianum ВИЗР-18 (титр 109 КОЕ/г), направленный против почвенных инфекций, разработан в ГНУ Всероссийский институт защиты (ЗАО «Агробиотехноло-гия»). Вносили в грунт из расчета 1 таблетка на 300 мл грунта перед посадкой растений. Объем кюветы составлял 1.5 л. Контрольные растения замачивали в дистиллированной воде.
Концентрацию Н2О2 измеряли с использованием красителя ксиленоловый оранжевый [3]. Концентрацию Н2О2 определяли по предварительно построенной калибровочной кривой.
Реакционная смесь для определения активности оксалатоксидазы содержала 100 мкл сукцинатного
* автор, ответственный за переписку
714
БИОЛОГИЯ
буфера, 0.0025 М щавелевую кислоту («Реахим», Россия), 50 мкл ферментной вытяжки и коммерческой пероксидазы хрена («ДиаэМ», Россия) в концентрации 15 ед/мл и 0.08% хромогенный субстрат (ö-фенилендиамин (ОФД) («Реахим», Россия).
Активность пероксидазы определяли микрометодом по окислению её субстрата [4]. Активность фермента выражали в единицах на г сырого веса растительной ткани.
РНК из растений выделяли фенольно-детер-гентным методом. Для получения кДНК на основе мРНК изучаемых образцов проводили реакцию обратной транскрипции с использованием M-MuLV обратной транскриптазы согласно протоколу фирмы-поставщика. Полимеразно-цепную реакцию (ОТ-ПЦР) проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-«Терцик ». После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 7% ПААГ в электрофоретической камере S2 («Хеликон», Россия). В качестве положительного контроля использовали ПЦР гена, кодирующего конститутивно экспрессирующийся тубулин. С помощью программы «Primer Select» (DNAStar) были подобраны высокоспецифичные праймеры к генам оксалатоксидазы (AJ556991.1) и анионной пероксидазы (TC 151917), фланкирующие фрагмент ДНК размером 410 и 157 п.н. соответственно. Экспериментальным путем были подобраны условия проведения ПЦР.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ фирмы Stat Soft (Statistica 6.0). Компьютерный анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene («DNASTAR, Inc.», США). Опыты проводились в 3 биологических и 3 химических повторностях. В работе приведены фотографии ПААГ после электрофореза с наилучшим разделением образцов. Количественные данные обрабатывались статистически, на рисунках приведены стандартные отклонения.
Результаты и их обсуждение
Результаты проведенных исследований показали, что в обработанных ХОС 65% С А и глиок-ладином инфицированных возбудителем корневой гнили растениях пшеницы наблюдается значительное повышение концентрации перекиси водорода (рис. 1).
Важную роль в регуляции уровня Н2О2 при инфицировании различными патогенами выполняют оксидоредуктазы и, в первую очередь, перокси-даза и оксалатоксидаза. Нами было проведено исследование активности пероксидазы в корнях пшеницы при обработке биопрепаратами и инфицировании. Так наибольшая активность фермента наблюдалась на 6 сутки после инокуляции (рис. 2). Причем, наивысший уровень активации фермента, как в неинфицированных, так при инфицировании
отмечен в образцах, обработанных ХОС 30% СА (рис. 2, 6). Вероятно, активация пероксидазы под воздействием ХОС 30 % СА приводит к снижению уровня Н2О2 в растительных тканях (рис. 1).
Рис. 1. Изменение концентрации перекиси водорода в корнях пшеницы при обработке биопрепаратами и инфицировании В. хотоЫтапа. 1 - контроль, 2 - ХОС 30% СА, 3 - ХОС 65% СА, 4 - глиокладин, 5 - В^., 6 - ХОС 30% СА + В.з., 7 - ХОС 65% СА + В.з., 8 - глиокладин + В.з.
Рис. 2. Влияние инфицирования В. зогокшапа и обработки биопрепаратами на активность пероксидазы в корнях пшеницы (обозначения как на рис. 1).
Можно предположить, что основную функцию в регуляции содержания Н2О2 в местах инфицирования у пшеницы выполняет оксалатоксидаза. Так в неинфицированных растениях активность оксала токсидазы равномерно снижалась в ходе эксперимента (рис. 3). Этот факт может быть обусловлен тем, что фермент причисляют к группе germin-белков [5] и его содержание в растениях снижается по мере роста растения (рис. 3). В обработанных препаратами неинфицированных растениях пик активности фермента приходился также на 6 сутки (2, 3, 4). Наибольшая активность фермента была отмечена в инфицированном необработанном образце. Вероятно, это свидетельствует о том, что растения испытывали на себе больший стресс, чем обработанные, в связи с активным развитием патогена. В обработанных ХОС 65% СА и глиоклади-ном растениях наблюдалось повышением активности оксалатоксидазы, но оно было ниже, чем в инфицированном контроле (рис. 3).
Рис. 3. Влияние инфицирования В. 80Г0к1шапа и обработки биопрепаратами на активность оксалатоксидазы в корнях пшеницы (обозначения как на рис. 1).
Рис. 4. Экспрессионная активность гена анионной перокси-дазы в корнях пшеницы при обработке биопрепаратами и инфицировании Б. sorokiniana (обозначения как на рис. 1).
Исследования экспрессионной активности генов этих ферментов выявило схожие результаты. Пик экспрессионной активности анионной перок-сидазы в основном приходится на 6 сут после инокуляции (рис. 4), в то время как экспрессия гена оксалатоксидазы уменьшалась в ходе эксперимента (рис. 5). Интересно, что наибольшее индуцирующее действие на защитный потенциал пшеницы при поражении возбудителем корневой гнили Бipolaris sorokiniana оказывали ХОС СА 65% и глиокладин. Полученные данные могут быть использованы для
разработки новых методов защиты растений от грибных патогенов.
Работа проведена при финансовой поддержке гранта РФФИ_поволжье_а № 11-04-97037 и ФЦП ГК № 01201353578.
Рис. 5. Экспрессионная активность гена оксалатоксидазы в корнях пшеницы при обработке биопрепаратами и инфицировании B. sorokiniana (обозначения как на рис. 1).
ЛИТЕРАТУРА
1. Bolwell G. P., Bindschedler L. V., Blee K. A., Butt V. S., Davies D. R., Gardner S. L., Gerrich C., Minibayeva F. The Apoplastic oxidative burst in response to biotic stress in plants: a tree-component system // J. Exp. Bot. 2002. 53, 1367-1376.
2. Андреева В. А. Фермент пероксидаза: Участие в защитном механизме растений (от вирусной инфекции). М.: Наука. 1988. 129 с.
3. Bindschedler L. V., Minibayeva F., Gardner S. L., Gerrish C., Davies D. R., Bolwell G. P. Early signalling events in the apoplastic oxidative burst in suspension cultured French bean cells involve cAMP and Ca2+ // New Phytologist. 2001. V. 151. P. 185-194.
4. Ермаков А. И., Арасимович В. В., Ярош Н. П. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиз-дат, Ленингр. отделение. 1987. 430 с.
5. Dumas B., Freyssinet G., Pallet K. Tissue-specific expression of germin-like oxalate oxidase development and fungal infection of barley seedlings // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1091-1096.
Поступила в редакцию 03.08.2013 г.
