CC BY
45
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЛИМФОЛОГИЯ
УДК 612.4
Ю.И. Бородин, И.В. Майбородин, А.Ф. Сафина, Д.Н. Стрункин
ИНДУКЦИЯ ЦИТОХРОМА Р450 1А1/1А2
В КЛЕТКАХ ЖИРОВОЙ ТКАНИ КРЫС
ПОСЛЕ ЭНТЕРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ БЕНЗПИРЕНА
ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск
Исследовали брыжеечные лимфатические узлы крыс непрямым иммунопероксидазным методом с использованием моноклональных антител к цитохрому Р450 1А1/1А2 после пе-рорального введения бензпирена. Обнаружили, что данные формы цитохромов присутствуют, кроме паракортекса и мозгового вещества, и в паранодулярной жировой клетчатке. Таким образом, окисление различных токсических веществ экзо- и эндогенного происхождения может происходить не только в печени и в различных лимфатических узлах, но и в жировой ткани.
Ключевые слова: цитохром Р450, бензпирен, жировая ткань, липоциты
Монооксигеназная система ферментов, локализованная в мембранах эндоплазматического ретикулума клеток, является одной из первых систем организма, которая сталкивается с ксенобиотиками окружающей среды и биотрансформи-рует их [5]. Широкая субстратная специфичность ферментов монооксигеназной системы обусловлена функционированием множества форм ци-тохрома Р450 ^Р) 1А1.
Метаболизм ксенобиотиков может проходить в различных клетках, разных органах. Наиболее подробно изучена к настоящему времени система монооксигеназ печени. Возможна индукция CYP1A1 не только в печени, но и в предстательной железе и семенных пузырьках [13], центральной нервной системе (головном и спинном мозге) [8, 11], эпидермисе [15], боуменовых железах, ольфакторном и респираторном эпителии полости носа [16]. мРНК CYP1A1 была обнаружена в тканях молочной железы [9], эпителии желудочно-кишечного тракта [6, 13], клубочках почек, яичнике [6], эндотелии кровеносных сосудов [4, 6]. Экспрессия мРНК CYP1A1 и его активность могут быть индуцированы в тимусе, селезенке, клеточных культурах тимоцитов и спленоци-тов. Активность CYP1A1 не регистрировали в нормальных лимфоцитах человека [14], но экспрессию мРНК CYP1A1 можно индуцировать в культуре лимфоцитов периферической крови человека [5, 10]. Главную роль в деградации токсинов и малых молекул в различных моноцитах и макрофагах человека играет система коэнзимов цитохрома Р450, в том числе и CYP1A1, при-
чем в моноцитах возможна значительная индукция этого фермента [7]. Обнаружена индукция CYP1A1/1A2 в различных лимфатических узлах крыс после перорального введения бензпирена [2, 3]. Таким образом, метаболизм ксенобиотиков может проходить в различных клетках, разных органах.
При попытке получить точные данные о локализации CYP1A1/1A2 в лимфатических узлах [2, 3] была обнаружена достаточно сильно выраженная индукция этого фермента в жировой ткани, окружающей капсулу лимфатического узла.
Материал и методика. Для индукции CYP1A1 крысам-самцам Вистар весом 150-200 г (из Томского питомника) вводили перорально через зонд раствор бензпирена в растительном масле в дозе 30 мг/кг в течение 3 дней. На 5-е сутки после начала эксперимента животных декапитировали. Контрольным крысам вводили растительное масло (растворитель бензпирена) [2, 3]. Результаты получены в трех независимых сериях экспериментов.
Для исследований методом световой микроскопии лимфатические узлы вместе с окружающими тканями фиксировали в 4% растворе парафор-мальдегида на фосфатном буфере, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм депарафинировали в ксилоле, регидратировали в градиенте этанола и промывали в 1% растворе Тритона Х-100 на фосфатном буфере в течение 1 часа. Далее срезы инкубировали с 3% раствором перекиси водорода 10
минут для подавления эндопероксидазной активности. После промывания фосфатным буфером срезы были преинкубированы в 10% растворе фетальной сыворотки на этом буфере и затем инкубированы с антителами против CYP1A1/1A2 крысы (моноклональные антитела были получены с использованием гибридомной технологии, клон 14Н5 [12]) в разведении 1:50 в течение суток при 4°С. Полученные комплексы обрабатывали антимышиными антителами, меченными перок-сидазой в течение 2 часов при 37°С. После промывания фосфатным буфером продукты реакции на срезах визуализировали 3,3-диамидобензидином как субстратом для пероксидазы [2, 4]. Препараты изучали под микроскопом с масляной иммерсией, для более точного определения типа клеток срезы докрашивали гематоксилином и заключали в полистирол, изучали на световом микроскопе при увеличении до 2500 раз.
Результаты и их обсуждение. После введения бензпирена в лимфатических узлах отмечена индукция CYP 1А1/1А2 в паракортикальной зоне и мозговом веществе. CYP 1А1/1А2 был обнаружен в макрофагах, литоральных клетках выстилки промежуточных и мозговых синусов, ретикулярных клетках и фибробластах. Не обнаружено микросомальных ферментов в корковом плато, лимфоидных фолликулах и в эндотелии кровеносных сосудов [2].
Однако после энтерального введения бензпи-рена случайно была найдена индукция микросо-мальных ферментов в клетках жировой ткани, окружающей лимфатические узлы (рис. 1, 2). Причем не все клетки жировой ткани демонстрировали активацию CYP (рис. 2).
После введения в пищеварительный тракт бензпирен из просвета тонкой кишки попадает в кровеносное русло и сосуды лимфатической системы. В процессе всасывания токсин индуцирует CYP 1А1/1А2 в макрофагах [2, 7] и эндотелиоци-тах капилляров [2, 4, 6] собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки.
Из кровеносных капилляров углеводород по системе вен портального тракта попадает в печень, где происходит индукция микросомальных ферментов в гепатоцитах и клетках Купфера [7].
По системе лимфатических капилляров бенз-пирен из просвета тонкой кишки попадает в регионарные (брыжеечные) лимфатические узлы. В данных органах происходит индукция CYP 1А1/ 1А2 в макрофагах, ретикулярных и литоральных клетках выстилки промежуточных и мозговых синусов [2].
Следует отметить, что, видимо, бензпирен транспортируется в брыжеечные лимфатические узлы не только с током лимфы, но и в макрофа-
гах из собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки. Миграция макрофагов, нагруженных инородными веществами, к настоящему времени достаточно хорошо освещена в научной литературе. Неокисленный в данных узлах углеводород попадает в лимфатические узлы следующего порядка и не исключено, что, пройдя через все узлы, бензпирен может проникнуть в кровь вместе с лимфой через лимфовенозное соустье. Кроме того, в лимфатических узлах происходит сброс части лимфы в кровь, поэтому возможно попадание бензпирена в кровеносную систему из лимфы (или вместе с лимфой) уже на уровне брыжеечных узлов первого порядка [1].
Прошедший через фильтры печени и лимфатических узлов бензпирен через кровеносное русло распространяется по всему организму и может вызывать индукцию монооксигеназ в различных
Рис. 1. Индукция CYP ^1/1А2 в жировой клетчатке вокруг брыжеечного лимфатического узла крысы после введения бензпирена.
Окраска диамидобензидином и гематоксилином. Увеличение х750
Рис. 2. Жировая клетчатка вокруг брыжеечного лимфатического узла крысы после введения бензпирена.
Индукция СУР 1А1/1А2 в клетках жировой ткани. Отдельные липоциты без активации ферментов. Окраска диамидобензидином и гематоксилином. Увеличение х1800
органах и тканях, в том числе и в жировой ткани.
Накопление бензпирена в жировой ткани хорошо известно и, по-видимому, связано с жиро-растворимостью этого вещества. Но значительная активация микросомальных ферментов в жировой ткани заставляет пересмотреть функции этой ткани. Не исключено, что в деактивации (окислении) некоторых веществ принимает очень активное участие и жировая ткань, а не только печень и лимфатические узлы. Тем более что удельный вес всей жировой ткани в организме довольно значителен и может превосходить вес печени и лимфатических узлов вместе взятых. Следует отметить, что наличие CYP 1А1/1А2 в клетках жировой ткани может влиять на метаболизм in situ стероидов и их антагонистов.
Заключение
В лимфатических узлах крыс бензпирен при пероральном применении вызывает индукцию CYP1A1/1A2 в паранодулярной жировой ткани. На основании этого можно заключить, что окисление различных токсических веществ экзо- и эндогенного происхождения может происходить не только в печени и в различных лимфатических узлах, но и в жировой ткани.
The induction of cytochrome Р450 1А1/1А2 in cells of rat fatty tissue after enteral benzo[a]pyrene administration
Yu.I. Borodin, I.V. Maiborodin, A.F. Safina, D.N. Strunkin
The rat mesenterial lymph nodes after enteral benzo[a]pyrene administration were investigated by the indirect immunoperoxidase method using monoclonal antibodies against cytochrome Р450 1A1/1A2. Have found out, that the this cytochrome forms are present, except for paracortex and medullar tissue of lymph node, and in paranodular fatty tissue. Thus, oxidation of various toxic substances exogenous and endogenous origins can occur not only in a liver and in various lymph nodes, but also in a fatty tissue.
Литература
1. Бородин Ю.И. Лимфатический узел при цирку-ляторных нарушениях / Ю.И. Бородин, В.Н. Григорьев. — Новосибирск, 1986. — 272 с.
2. Индукция цитохрома Р450 1А1/1А2 в лимфатических узлах крыс бензпиреном / Ю.И. Бородин, А.Ф. Сафина, И.В. Майбородин, А.Ю. Гришанова // Бюлл. экспер. биол. и медицины. — 2003. — Т. 136.
— № 12. — С. 690-695.
3. Сафина А.Ф. Об участии лимфатических узлов в процессах детоксикации / А.Ф. Сафина, В.А. Вавилин, А.Ю. Гришанова // Бюлл. СО РАМН.
— 1999. — № 2. — С. 122-125.
4. 7-ketocholesterol is an endogenous modulator for the arylhydrocarbon receptor / J.F. Savouret, M. Ante-nos, M. Quesne et al. // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol.
276. — № 5. — P. 3054-3059.
5. CYP1A1 mRNA levels as a human exposure bio-marker: use of quantitative polymerase chain reaction to measure CYP1A1 expression in human peripheral blood lymphocytes / J.P. Van den Heuvel, G.C. Clark, C.L. Thompson et al. // Carcinogenesis. — 1993. — Vol. 14. — № 10. — P. 2003-2006.
6. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) in blood lymphocytes evidence for catalytic activity and mRNA expression / A. Dey, D. Parmar, M. Dayal et al. // Life Sci.
— 2001. — Vol. 69. — № 4. — P. 383-393.
7. Cytochrome P450 1B1: a major P450 isoenzyme in human blood monocytes and macrophage subsets / J.M. Baron, G. Zwadlo-Klarwasser, F. Jugert et al. // Biochem. Pharmacol. — 1998. — Vol. 56. — № 9. — P. 1105-1110.
8. Cytochrome P450 and associated monooxygenase activities in the rat and human spinal cord: induction, immunological characterization and immunocytochem-ical localization / S.V. Bhagwat, B.C. Leelavathi, S.K. Shankar et. al. // Neuroscience. — 1995. — Vol. 68. — № 2. — P. 593-601.
9. Developmental and endocrine regulation of P450 isoforms in rat breast / H. Hellmold, J.G. Lamb, A. Wyss et al. // Mol. Pharmacol. — 1995. — Vol. 48. — № 4. — P. 630-638.
10. Dey A. Tissue- and cell type-specific expression of cytochrome P450 1A1 and cytochrome P450 1A2 mRNA in the mouse localized in situ hybridization / A. Dey, J.E. Jones, D.W. Nebert // Biochem. Pharmacol.
— 1999. — Vol. 58. — № 3. — P. 525-537.
11. Farin F.M. Regiospecific expression of cyto-chrome P450s and microsomal epoxide hydrolase in human brain tissue / F.M. Farin, C.J. Omiecinski // J. Toxicol. Environ. Health. — 1993. — Vol. 40. — № 2-3.
— P. 317-335.
12. Grishanova A.Yu. Using of antibodies to cyto-chrome P450 librery in xenobiotic metabolism studies / A.Yu. Grishanova, V.V. Lyakhovich // Cytochrome P450: Biochemistry and Biophisics. — Moscow, 1992.
— P. 525-527.
13. Induction of CYP isoenzymes in various organs of rats by 3-methylcholanthrene or beta-naphthofla-vone / T. Matsuda, S. Imaoka, Y. Funae et al. // Cancer Lett. — 1995. — Vol. 97. — № 2. — P. 137-143.
14. Main drug-metabolizing enzyme systems in human non-Hodgkin's lymphomas sensitive or resistant to chemotherapy / V. Ribrag, L. Massaad, F. Janot. et al. // Leuk. Lymphoma. — 1995. — Vol. 18. — № 3-4. — P. 303-310.
15. Purification and characterization of NADPH-cytochrome P450 reductase from rat epidermis / H. Takahara, S.I. Zaidi, H. Mukhtar et al. // J. Cell Biochem. — 1993. — Vol. 53. — № 3. — P. 206-212.
16. Voigt J.M. Localization and induction of cyto-chrome P450 1A1 and aryl hydrocarbon hydroxylase activity in rat nasal mucosa / J.M. Voigt, F.P. Gueng-erich, J. Baron // J. Histochem. Cytochem. — 1993.
— Vol. 41. — № 6. — P. 877-885.
