CC BY
28
УДК 631.811.98 75.117.2.577.2.08
1НДУКЦ1Я РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТУ Б10СИНТЕЗУ si/miRNA 3 АНТИПАТОГЕННИМИ ТА АНТИПАРАЗИТАРНИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ
КЛ1ТИНАХ РОСЛИН
11нститут бюоргашчно!' xiMii та нафтох1мп НАН Украши, Ки!в 2Нацюнальний ушверситет 6iopecypciB i природокористування Украши, Ки1в
3М!жвщомчий науково-технолотчний центр «Агробютех»
HAH i МОН Украши, Киш 41нститут харчово!" бютехнологп та геномжи НАН Украши, Киш
E-mail: vTsygankova@ukr.net
Отримано 13.02.2012
У лабораторных дослщах показано, що композицшш полшомпонентш препарати з б1озахисними властивостями BioreH, Стампо i Регоплант за показниками проростання та швидкоста росту про-pocTKiB значно тдвищують (до 35—70%) стшшсть цукрового буряку до цистоутворювально1немато-дн Heterodera shcachtii та галово! нематодн Meloidogyne incognita i яро! пшенищ сорту Tpi30 до патогенного мшромщета Fusarium oxysporum graminearum. Встановлено, що максимальне зменшення (~ на 80%) шлькоста личинок нематоди H. schachtii в коренях цукрових буряшв вщбуваеться в pa3i об-роблення насшня регуляторами росту в найб^льш ефективних концентрациях: Стампо — 5 мкг/мл, Регоплант — 1 мкг/мл та BioreH — 1 мкг/мл.
Молекулярно-генетичним методом дот-блот-пбридизаци мРНК з кДНК i дослщженням функщо-нально! активност1 si/miRNA в безкл1тиннш систем! протешового синтезу вперше показано, що стшшсть рослин цукрового буряку до нематод H. schachtii та M. incognita i рослин яро! пшенищ сорту Tpi30 до патогенного мшромщета Fusarium oxysporum graminearum досягаеться стимулящею синтезу малих регуляторних si/miPHK.
Ключов1 слова: регулятори росту рослин, мал1 регуляторш РНК (si/miRNA), стшшсть
рослин до шшднишв, безкл1тинна система протешового синтезу i3 npopocTKiB пшенищ.
Одшею з головних проблем сучасного йльського господарства е створення високо-ефективних i еколопчно безпечних агротех-нологш, яш здатш тдтримувати стшшсть агросистем, спрямоваш на якомога ширше використання бюлопчного захисту рослин вщ шшдливих орган1зм1в, а також сприяють полшшенню якоста врожаю. С1льське госпо-дарство майже ycix кра'ш потерпае в1д шшдливих орган1зм1в — комах i кл1шДв, м1кроорган1зм1в (6aKTepi'i, гриби, Bipycn), нематод (ф1тогельмштав) та бур'яшв. За да-ними Оргашзацп з продовольства i йльсько-го господарства ООН (ФАО), щор1чно cBiTOBi втрати урожаю продовольчих культур ста-новлять приблизно 20-25%. До найб1льш поширених i небезпечних шшднишв, що вражають таш важлив1 для йльського господарства культури, як пшениця, кукуруд-за, ячмшь, соя, pinaK, належать: стебловий кукурудзяний метелик, озима совка, шведська муха, дротяники, люцернова сов-
В
B. А. Циганкова1
Т. Р. Стефановсъка2 Я. В. Андрусевич1
C. П. Пономаренко3 А. П. ГалтнА
Я. Б. Блюм4
ка, акащева вогшвка, бульбочков1 довгоно-сики, соева плодожерка 1 павутинний клщ, трипси, ршаковий кв1тко1д, бл1шки, ршако-вий б1лан, лучш клопи, попелищ. Не менш актуальною е проблема захисту рослин вщ широко розповсюджених грибкових, бак-тер1альних та в1русних захворювань, таких якфузарюз, церкоспороз, аскох1тоз, склеро-тинюз, пероноспороз, вертицильозне в'янен-ня, борошниста роса, бура листова 1ржа, бактер1альний опж, жовта мозажа со! та ш. [1]. Сумарш втрати врожаю йльськогоспо-дарських культур вщ хвороб, спричинених р1зними патогенними оргашзмами, сягають в Укра'1т 50%.
Одним з розповсюджених 1 шшдливих паразитав рослин е нематоди. Втрати урожаю вщ ураження рослин паразитичними нематодами в р1зних кра'шах становлять вщ 25% до 70%, а за екстремальних умов мо-жуть сягати 90-100% [1]. Встановлено, що загальш щор1чш втрати врожа!в вщ ф1то-
гельмштав у грошовому екв1валент1 в усьому cbítí становлять 100 млрд. долар1в США [2]. Життед1яльшсть ycix Грунтових нематод (ф1топаразитичних й в1льно1снуючих) tícho зв'язана, з одного боку, з вегетуючими рос-линами, а з другого — з ф1топатогенними i сапроф1тними бактер1ями i грибами, Bipy-сами та шшими оргашзмами, що беруть участь у розвитков1 хвороб рослин, спричи-нених ф1тогельмштами.
У наш час представники понад 20 род1в ф1тонематод зареестроват як обл1гатт паразиты вищих рослин. Б1льш1сть Í3 них на-лежить до ряду Tylenchida Thorne, родини Heteroderidae. Для краш Свропи, у тому числ1 для Poci'í й Украши, найб1льшу небез-пеку для йльськогосподарських рослин становлять цистоутворювальш нематоди G. ros-tochiensis, G. pallida i G. tabaccum. Перш1 дв1 викликають глободероз рослини i спричи-нюють зниження врожаю картопл1 (шод1 до 60%); обидва види включено до перелшу ка-рантинних o6'eKTÍB Свропейсько! оргашза-цп Í3 захисту рослин. Okpím зазначених нематод, широко розповсюджеш i завдають велико! шкоди картопл1 бульбова нематода (Ditylenchus destructor), нематоди - перенос -ники BipyciB (Paratrichodorus teres, Xiphine-ma diversicaudatum, Longisporus elongatus), шш1 Коренев! нематоди (Paratylenchus, Helycotylenchus). Yci перел1чеш парази-th4hí нематоди особливо великого збитку завдають на тл1 в1русних захворювань кар-топл1 й в умовах Центрально! бвропи зни-щують 88% урожаю [3]. У закритому Грунта оранжерей i теплиць найб1льш шкодочин-ними е три види галових нематод: Meloido-gyne incognita (твденна), Meloidogyne javanica (яванська) Meloidogyne arenaria (apaxicoBa), що спричинюють небезпечне захворювання — мелойдогшоз. Щ парази-TH4HÍ оргашзми уражують i овочев1 культу-ри вщкритого Грунту: томати, баклажани, картоплю, цукров1 й столов! буряки, морк-ву, баштанш культури тощо [4].
Не менш шшдливою е бурякова цистоут-ворювальна нематода Heterodera schachtii Schmidt - небезпечний шшдник, що зумов-люе гетеродероз цукрових буряшв у майже 40 кра'шах св1ту [5]. Втрати врожаю вщ цьо-го ф1тогельмшта становлять 95% вщ усього комплексу шшдливих opraHÍ3MÍB культури. В Укра!ш бурякова нематода поширена у Вшницьшй, Сумсьшй, Чернтвсьшй, Черкасьшй, Харшвсьшй областях, де втрати врожаю буряшв досягають 30% [6]. Важ-лива особлив1сть паразита — здатшсть роз-виватися на рослинах з 25 боташчних
родин, зокрема на культурних рослинах (pinaKy, KanycTi, олшнш редьщ, прчищ) та бур'янах з родини капустяних (Brassicacae), а також на бур'янах з родини Chenopodia-ceae [6]. Основним методом проф1лактики шшдника е дотримання йвозмши. 1снуе група культур, яш нематода не вражуе: зер-HOBi колосов1, зернобобов!, кукурудза, кар-топля, 6araTopi4Hi трави. Вирощування цих культур сприяе очищению Грунту в!д нематоди. Розмщення цукрових буряк!в п!сля попередника, який ушкоджуеться ц!ею нематодою, сприяе зб1льшенню чисельност! популяц!! шшдника. Особливо велик! втрати врожаю вщ нематоди спостер!гаються п!д час вирощування цукрових буряшв у монокультур! та за велико! концентраци (до 60-80%) у ciB03MiHi !! культур-хазя!в. В ос-танн! роки внаслщок зб!льшення площ вирощування pinaKy зростае ризик п!двищення шшдливоста буряково! нематоди у буряко-вих с!возм!нах, а вщтак питания обмеження чисельност! цього небезпечного шшдника стае дедал1 гостр1шим [7].
До найб1льш ефективних метод1в обмеження чисельноста нематод-шшднишв належать вирощування стшких до них сорт1в та оброблення насшня рослин нематицидами. Нематициди було заборонено до викорис-тання напришнщ 80-х рок1в минулого стор1ччя в 61льшост1 краш св1ту через ix надзвичайно високу токсичшсть, негатив-ний вплив на довшлля та здоров'я людини. Тому вкрай важливим для регуляцп чисель-HocTi ф1тогельмшт1в е застосування речовин xiMi4Horo чи бюлопчного походження, яш е менш токсичними та б1льш безпечними для довшлля. До високоефективних антипа-разитарних 3aco6iB належать препарати, розроблет на основ! авермектишв, аверсек-тин1в та абамектишв — комплексних анти-паразитарних антибютишв (продуцент — штам Грунтового стрептомщету Streptomy-ces avermitilis). Результата дослщжень, про-ведених упродовж останшх 20 рок1в у США, Захщнш Cßponi та Poci'i, показали, що вико-ристання авермектину та абамектину зни-жуе чисельшсть ф1топаразитичних нематод на р1зних культурах [8], зокрема томатах [9], банаш [10], бавовнику [11], тютюнов! [12] та на часнику [13]. Найб1льш ефективним е використання авермектишв проти галових нематод М. incognita, М. arenaria, М. javanica. Вщомо також про ефектившсть дп пре-парат1в проти стеблово! нематоди Ditilen-chus dipcasi, внутр1шньокоренево1 нематоди Rotylenchulus reniformis та ф1топаразита Tylenchulus semi penetrans. Ефективним
е оброблення насшня бавовнику абамекти-ном проти галових нематод, цукрових бу-ряшв — проти буряково! нематоди та куку-рудзи — проти P. pratensis [11, 14].
В Укра1ш в останш роки дедал1 ширше використовують в1тчизняш антипаразитарш препарати, найефектившшим з яких е Авер-ком, створений на основ! авермектишв — комплексних антипаразитарних антибюти-KiB (штам-продуцент - Грунтовий стрептомь цет Streptomyces avermitilis) ствроб1тника-ми 1нституту мшробюлоги та в1русологи НАН Украши [15, 16]. Було встановлено, що цей препарат пщвищуе 1мунозахисш влас-тивост1 рослин, прискорюе ix picT та обме-жуе шшдливють паразитичних оргашзм1в — нематод [15]. Проведен! лабораторш досль дження показали, що у високих концентра-щях Аверком спричинюе 80%-ну загибель личинок нематод Meloidogyne incognita. Оброблення Грунту в лабораторних умовах препаратом призводило до зменшення комплексу ф1тогельмштав у чотири рази [16].
До нових ефективних в1тчизняних пре-парат1в з антинематодною та антипатогенною д1ею належать також створен! в 1нсти-TyTi 6ioopraHi4Ho'i xiMi'i та нафтох1мп НАН Украши разом i3 Державним тдприемством «М1жв1домчий науково-технолойчний центр «Агробютех» НАН i МОН Украши» композицшш пол1функщональш препарати BioreH, Сймпо та Регоплант. Бшзахисш властивост1 ix зумовлеш синерпчним ефек-том взаемоди продукйв життед1яльност1 в культур! in vitro гриба-мшсомщета, вилу-ченого з коренево! системи женьшеню (сумш амшокислот, вуглевод1в, жирних кислот, пол1сахарид1в, ф1тогормошв та мшроеле-ментав), та аверсектишв — комплексних антипаразитарних макрол1дних антибютишв, продукйв метабол1зму Грунтового стреп-томщету Streptomyces avermitilis [1]. Стреп-томщети в1дом1 як продуцента не лише антибютишв, але й таких бюлопчно активних речовин, яш виявляють ф1тозахисну i picT-стимулювальну д1ю на рослини. Це — р1зно-MaHiTHi гормони, в1тамши, амшокислоти, каротино1ди, ензими, токсини та rnrni речо-вини, яш впливають на ростов! процеси рослин, стимулюючи проростання насшня i тдвищуючи врожайшсть [15, 16].
Як виявлено в проведених нами молеку-лярно-генетичних дослщженнях [17, 18], щ препарати значно тдвищують стшшсть рослин до р1зних патоген1в завдяки стимуляцп ними синтезу власне кл1тинних малих регу-ляторних РНК (small regulatory RNA), що беруть участь у RNAi (RNA interference)
процесс який прийнято називати посттранс-крипцшним сайленсингом гешв (PTGS) у рослин, тварин та гриб1в [19-24]. Сайлен-синг гешв — процес, у результат! якого вщ-буваеться або деградащя, або блокування трансляцп молекул-м1шеней mRNA, мае ве-лике значения в адаптацшнш резистентноста до BipyciB, у захист1 геному проти моб1льних ДНК-елементав, а також в онтогенетичнш регуляцп eKcnpeciï гешв. Головну роль у сайленсингу виконують мал1 регуляторш si/miPHK розм1ром 22-24 ht [19-24], що синтезуються з попереднишв - дволанцюго-вих dsRNA (double-stranded RNA) транс-криптав ендонуклеазним розщепленням за допомогою РНКаза-III под1бних ензим1в. Разом 3i сайт-специф1чними ендо- та екзо-нуклеазами si/miRNA або блокують (сай-ленсують) транслящю аберантних та недос-коналих за структурою власне кл1тинних мРНК, а також мРНК патогешв i паразитав, або ензиматично розщеплюють щ молекули-мшеш мРНК, що й призводить до ïx дегра-дацп [19-33].
Метою нашо! робота було визначення можливоста за допомогою вищезазначених композицшних препарайв тдсилювати синтез ендогенних малих регуляторних si/miRNA як основних складових iMyHHoï системи рослин.
Матер1али i методи
У досл1дах використовували рослини цукрового буряку Beta vulgaris L., шфжо-ван1 в лабораторних або тепличних умовах цистоутворювальною коренепаразитуючою нематодою H. shcachtii i галовою нематодою М. incognita, а також рослини яро! пшенищ сорту Гр1зо, шфшоваш патогенним мжро-мщетом Fusarium oxysporum graminearum. В експериментах з визначення сортово! чут-ливоста до регулятор1в росту використовували сорта озимо! пшенищ Ятрань 60, Воло-дарка, Смуглянка та Подолянка, люб'язно надаш академжом НАН Украши В. А. Моргуном. Дослщш рослини обробляли компо-зицшними полжомпонентними препаратами Регоплант, Стампо, BioreH.
Експерименти з вивчення ефективноста антинематодно! д1'х регулятор1в росту проводили спочатку в умовах теплищ. Насшня рослин обробляли препаратами Регоплант, Стампо, BioreH, в яких концентращя авер-сектину становила 0,05; 0,1; 0,5; 1 та 10 мкг/мл, теля чого висаджували в горщечки д1аметром 10 см за температури 25±5 °С. Для заражения рослин використовували
шфекцшш личинки цистоутворювальних нематод, яш екстрагували 1з цист. Цисти цистоутворювальних нематод вид1пяли з Грунту за допомогою стандартного методу волого! декантацп на ситах. Вид!леш таким чином цисти переносили у чашки Оостенбрша та заливали насиченим розчином хлориду цинку [34]. 1нкубащю цист проводили протягом 7 дшв при шмнатнш температур!. Личинки нематод виловлювали 1з суспензп, застосо-вуючи сито з д1аметром пор 25 мкм.
Нематоди у шлькоста 1000 личинок на кожен горщик вносили через два тижш теля вийву обробленого регуляторами насшня, а через два тижш рослини викопували та визначали шльшсть личинок, що потра-пили в кореш. Як контроль використовува-ли рослини, вирощеш з насшня, яке не об-робляли регуляторами росту. Через два тижш рослини викопували та визначали шльшсть шфекцшних личинок, що потра-пили у кореш. Кореш цукрових буряшв аку-ратно промивали у проточнш вод1. Потам корен! занурювали у розчин мол очно! кислоти, глщеролу, ашлшу та дистильовано! води на шлька хвилин, тдшр1вали 2 хв у мшро-хвильовш печ1 та висушували на поверь Шматочки корешв завдовжки 1,5 см помь щали у гомогешзатор. Гомогешзоваш корен! переносили у цилшдри об'емом 150 мл з1 100 мл води, ретельно струшували та тдраховували шльшсть нематод, що проникли у кореш.
Вплив обробки насшня регуляторами росту вивчали за показниками зменшення вщсотка проникнення в кореш цукрових буряшв личинок нематод.
Визначення летально! концентрацп 1_й50 та 1_й90 проводили в лабораторних умовах. Реестрували смертшсть буряково! та галово! нематод на 2-гу та 24-ту год теля оброблення препаратами Регоплант 1 Стампо у концентра-щях аверсектину 0,05; 0,1; 0,5; 1; 10 мкг/мл. Досл1д проводили на годинниковому скельщ у чотирьох повторениях. У кожне скельце вносили 500 мкл тестовано! конце-нтраци регулятор1в росту та 40 личинок цистоутворювально! або галово! нематоди. Личинки другого вшу цистоутворювально! нематоди отримували за методикою, що була описана вище. Для вид1лення личинок другого вшу галово! нематоди використовували ф1льтрувальний екран з порами 20 мкм [35].
За допомогою методу молекулярно! пб-ридизацп мРНК 1з si/miRNA перев1ряли можлив1сть шдукцп регуляторами росту рослин синтезу si/miRNA з антинематодною актившстю. 1з щею метою насшня цукрово-
го буряку з високою схож1стю пророщували у чашках Петр1 на безнематодному водному середовишД (контроль) та Í3 суспенз1ею цист нематод, з яких у процес1 шкубацл при 23 °С з'являлися личинки нематод (приблизно на 5-7-й дш). У паралельних пробах додавали також композицшш препарати Регоплант, Ст1мпо, Бюген.
Аналопчш експерименти проводили з перев1рки антипатогенно! дИ малих регу-ляторних si/miRNA залежно вщ р1вня ix синтезу. У цих дослщах насшня яро! пшени-щ сорту Гр1зо, не оброблене (контроль) та об-роблене комплексними пол1функщональни-ми препаратами Регоплант, Стампо, BioreH, було пророщено в чашках Петр1 за темпера-тури 25 + 5 С та шфшовано патогенним мшромщетом Fusarium oxysporum grami-nearum.
Препарати si/miRNA високо! чистоти Í3 дослщних рослин вид1ляли за допомогою рашше розробленого нами методу [18], який передбачае таш етапи:
1) вид1лення сумарного препарату РНК Í3 кл1тин рослин [36-38]. Пол1мершсть видь лених сумарних препаратав РНК анал1зува-ли за допомогою електрофорезу в 1,5%-му гел1 агарози у присутноста 7 М сечовини за методом Локера [39] (гел1 фарбували розчином етид1умбромщу перед фотографуванням фракцш РНК в ультрафюлета);
2) роздшення пол1(А)+мРНК (тобто мРНК) та пол1(А)-мРНК на ол1го(0Т)-целюлознш колонщ з метою подальшого використання пол1(А)+мРНК для тестування функщональ-но1 активност1 si/miRNA в безкл1тинних системах протешового синтезу з проростшв пшенищ [36, 38];
3) осадження високомолекулярно! пол1(А) мРНК з елюату проводили за допомогою 10%-го розчину пол1етиленглшолю (мол. маса 8000) з 0,5 М NaCl, a si/miRNA -Píbhhm об'емом 96%-го етанолу при -22 °C впродовж доби; з колонки пол1(А)+РНК 3hí-мали 2-3 об'емами буфератакого складу: 10 мМ трис-НС1 (pH 7,5), 1 мМ ЕДТА, 0,05% ДДС-Na [40, 41], а теля елюцп з колонки пoлi(A)+мPHK осаджували етанолом;
4) молекулярна пбридизащя в розчит 2xSSC низькомолекулярних si/miRNA з фракщею пoлi(A)+мPHK;
5) нанесення пбридних молекул пoлi(A)+мPHK Í3 si/miRNA на олшо(0Т)-це-люлозну колонку з наступною елющею з колонки буфером, зазначеним у пункта 3;
6) температурна (95 °С) денатуращя очи-щених за допомогою колонки пбридних молекул пoлi(A)+мPHK Í3 si/miRNA;
7) в1докремлення пол1(Д)+мРНК в1д si/miRNA за допомогою методу фракщону-вання на олшо^Т)-целюлознш колонщ;
8) повторив осадження si/miRNA 96%-м етанолом та перев1рка чистоти вид1лених si/miRNA за допомогою електрофорезу в 15%-му пол1акриламщному гел1 (ПААГ-електрофорез).
Видоспециф1чну сайленсингову актив-HicTb si/miRNA визначали у безкл1тинних системах протешового синтезу з проростшв пшенищ [38].
Для дослЩв i3 пбридизацп si/miRNA, вид1пених з дослщних рослин, i3 мРНК контрольних рослин, перед одержанням si/miRNA ïï iHTeHCHBHo м1тили in vivo 33P за допомогою Na2HP33O4 [36]. Для дослвдв i3 перев1рки ïï шпбуючо! активноста в безкль тинних системах протешового синтезу вико-ристовували нем1чену si/miRNA [38].
Дот-блот (точкова) г1бридизащя 33РкДНК з мРНК. Препарати мРНК з до-слщних (оброблених регуляторами росту) рослин пшенищ поддавали дот-блот-пбри-дизацп з кДНК контрольних рослин з метою визначення вщсотка гомологи популяцш мРНК з дослщних i контрольних рослин [40, 41].
Для синтезу ланцюга кДНК було застосо-вано буферний розчин такого складу: 100 мМ трис-HCl (pH 8,3) при 42 °С, 10 мМ MgCl2, 140 мМ KC1, 100 мкг/мл ол1го(0Т)12-18 прай-мер, 2 мМ метилгщрарпевого гщроксиду, 20 мМ ß-меркаптоетанолу, 1 мМ ванадилри-бонуклеозидних комплекйв чи 0,5 од/мкл РНКази, 1 мМ розчин ycix чотирьох dNTP, 100 мкг/мл пoлi(A)+PHK, 400-800 од/мл зворотно! транскриптази i [a-33P]-dCTP (800 Кю/мМ) [36, 40, 41].
Для нанесення 33РкДНК на ф1льтри ïï розчиняли в концентрацп 20 мкг/мл у буфе-pi 0,3 M NaCl — 0,03 M цитрату натрш, pH 7,0 (2XSSC) i для пбридизаци наносили 1 мл розчину [33Р]-кДНК на модифжоваш й активоваш целюлозш ф1льтри (Ватман 50, 2-амшофешлтаоеф1рний nanip, який утво-рюе ковалентш зв'язки з нанесеними ДНК чи РНК, на вщмшу вщ звичайних целюлоз-них або штроцелюлозних ф1льтр1в, що утво-рюють воднев1 зв'язки з ДНК чи РНК). Це дозволяв уникнути втрати нуклешових кислот тд час вщмивання ф1льтр1в [40, 42].
Для пбридизаци на ф1льтрах кДНК з мРНК вмщували у флакони для визначення радшактивноста, наповнеш розчином 2XSSC з десятикратним надлишком мРНК вщносно кДНК [40, 41]. У кожному дослда в oKpeMi флакони вмщували ф!пьтри з ДНК i3 генетично вщдаленого джерела для конт-
ролю на специф1чтсть пбридизацп, а також ф!пьтри, яш не м1стили ДНК, з метою оцш-ки величини неспециф1чно1 сорбци РНК на матер1ал1 ф1льтр1в. Флакони з ф1льтрами шДльно закривали i помщали в термостат для пбридизацп.
Пбридизащю проводили при 66 °С, однак пщ час роботи з нуклешовими кислотами з р1зних джерел брали до уваги, що молеку-ли РНК з б1льш стайкою вторинною структурою (завдяки вм1сту в нш б1льшо! шлькоста ГЦ-пар, що може бути в сумарному препарат! мРНК) потребують б1льш високих температур. Оптимальну температуру i макси-мальний р1вень йбридизаци тдбирали, вим1рюючи р1вень пбридизацп мРНК вщпо-вщно з гомологичною i гетеролопчною кДНК. Ибридизащю пор1внювали в pi3Hi часов! штервали упродовж доби.
Шсля зашнчення пбридизацп флакони з ф1льтрами охолоджували, ф1льтри вийма-ли i промивали у воронщ з кожного боку 50 мл 2XSSC. Шсля промивання ф1льтри помща-ли в розчин 2XSSC, що м1стив РНКазу в кон-центраци 20 мкг/мл. Шсля шкубаци з РНКазою за шмнатно! температури протя-гом 1 год ф1льтри знов промивали розчином 2XSSC, пот1м етиловим спиртом. Радюак-тивн1сть проб визначали на склоф1льтрах Millipore AP-15 в толуольному сцинтилятор1 в сцинтиляцшному л1чильнику LS 100C ф1рми Beckman.
Статистичну обробку отриманих даних проводили дисперсшним (за Стьюдентом) та кореляцшно-регресшним методами.
Результати та обговорення
У проведених лабораторних, тепличних i польових досл1дах було визначено, що комплексш пол1функщональш препарати Регоплант i Стампо значно тдвищують стш-KicTb рослин до небезпечних паразитав — нематод (цистоутворювальних i галових) та патогенного гриба (фузарюзного мшсомщета).
На рис. 1 представлено фотозшмки, що зроблеш в польових умовах, на яких зобра-жено шфшоваш цистоутворювальною нематодою Н. schachtii рослини цукрового буря-ку Beta vulgaris L., а також доросл1 самки та цисти ще! нематоди.
Як свщчать експериментальш дат, отри-ман1 в умовах теплищ (табл. 1), оброблення насшня регуляторами росту Регоплант i Стампо пригшчувало проникнення личинок буряково! нематоди в KopeHi цукрових буряшв у перший м1сяць вегетацп культури. Шльшсть личинок нематод, що потрапи-
Рис. 1.1нфгковат цистоутворювальною нематодою Н. schachtii рослини цукрового буряку Beta vulgaris L. та'1'xHi уражеш кореш (A i Б), 6rni й коричнев! цисти нематод (С)
ли в KopeHi тд впливом Стампо, зменшува-лась на 67,8%, а Регопланта — на 72,68%. Шдвищення концентрацп аверсектину зменшувало чисельшсть личинок, що проникли в KopeHi цукрових буряшв у pa3i 06-роблення двома препаратами (P < 0,05). Максимальне (80%) вщносно контролю зни-ження шлькоста личинок у коренях цукрових буряшв спостерпали за концентрацп 5 мкг/мл.
У pa3i оброблення Бюланом максимальне зменшення шлькоста личинок, що проникли в KopeHi, становило 81% за концентрацп препарату 1 мкг/мл. Встановлено, що подальше шдвищення концентрацп препа-рат1в не впливало на проникнення личинок
Таблица 1. Ефектившсть оброблення насшня цукрових бурягав регуляторами росту проти буряково! нематоди H. schachtii
Препарат Концентращя, мкг/мл Зменшення кшькост1 личинок, що потра-пили у корен1, пор1вняно 3 контролем, %
0,05 49,75
0,5 70
Ст1мпо 1 71
5 80
10 69
0,05 52
0,5 69,7
Регоплант 1 81,5
5 80,25
10 79,75
нематод у кореш. Так, у раз1 оброблення рослин препаратами в концентрацп, яка пере-вищувала 10 мкг/мл, подальше зниження шлькоста личинок нематод, що проникли в кореш ще! мльськогосподарсько! культури, не вщбувалося (рис. 2).
Результати вивчення впливу регулятор1в росту в р1зних концентращях на два вказа-них види нематод та визначення летальних концентрацш 1_0501 1_090 цих препаратав подано в табл. 1, а також на рис. 3 1 4. Встановлено, що юнуе вщмшшсть м1ж д1ею регуля-тор1в Стампо 1 Регоплант на бурякову та галову нематоди. Регоплант зумовлюе 50%-ну смертшсть личинок галово! нематоди через 2 год у концентрацп, в 1,3 раза меншш, шж Стампо, а через 24 год — удв1ч1 меншш. Ще б!пьш вщчутну р1зницю в результатах було отримано для буряково! нематоди. Через 2 год 50% личинок гинуло за концентрацп регулятора росту Регоплант в 1,8 раза меншш, шж регулятора Олмпо, а через 24 год — у 6 раз1в меншш.
90%-ну смертшсть обох вид1в нематод спостерпали за дп регулятор1в росту Сймпо та Регопланта тальки через 24 год (табл. 2). Детальна концентращя 1-090 для буряково! нематоди була в 1,8 раза меншою, шж для галово!. Регоплант спричинював 90%-ну смертшсть личинок галово! нематоди в удвь ч1 меншш концентрацш, шж Стампо. Для буряково! нематоди 90%-ну смертшсть за-реестровано в раз1 застосування приблизно однаково! концентрацп препаратав.
Таким чином, результати експеримен-т1в, проведених в умовах теплищ, свщчать про те, що тд д1ею регулятор1в росту Регоплант 1 Стампо зменшуеться ризик проникнення та накопичення личинок ф1тогельмш-т1в у кореш цукрових буряшв на початку вегетацп культури.
ar
О CN
^ «
к g
K S «с
Я 0
к к Mi
К V £ О к:
а ¡в
ЕВ S 0 ¡Г ЭСй ■
S S
со ч ж: ■
СС
г ■ CTiMno — Регоплант
Концентращя аверсектину
14.4-4Y- И
1
4
5
я
ПримЬтка. НСР0 05 (найменша суттева р1зниця) 55.
2 3
BapiaHTH дослвдв
Рис. 2. Вплив оброблення насшня цукрових бурягав регуляторами росту з р1зною концентращею аверсектину на проникнення личинок буряково!' нематоди на початку вегетацп культури
к
Таблица 2. Концентрация LD50 i LDg0 регулятор1в росту для буряково'1 та галово'1 нематод
Препарат Коренева цистоутворювальна нематода Н. schachtii Галова нематода M. incognita
^^50(мкг/мл) ^90(мкг/мл) ^^50(мкг/мл) ^90(мкг/мл)
2 год 24 год 2 год 24 год 2 год 24 год 2 год 24 год
Олмпо 3,9 0,6 - 4 1,9 1 - 7
Регоплант 2,8 0,1 - 3,9 2 0,5 - 3,8
Примтка. Середш результаты з трьох дослвдв.
Результаты, отримаш в лабораторных до-слщах, свщчать про те, що галова нематода сприйнятлив1ша до дИ регулятор1в росту у перший першд теля оброблення ними, тимчасом як бурякова нематода стае б1льш сприйнятливою до дп цих регулятор1в у тз-тший перюд (рис. 3 1 4).
1
и
¡з ss
s a
H a
F S
® H
14 a
Ь Щ
V к
y - С « 6.7024« « 18.297
H. schachtii
Концентращя аверсектину Мкг/мл
H. schachtii
Концентращя аверсектину Мкг/мл Рис. 3. Вплив регулятор1в росту на личинки буряково'1 нематоди через 2 год теля оброблення регуляторами росту: 1 — Олмпо; 2 — Регоплант
На основ! даних, одержаних в умовах теплищ та в лабораторних екпериментах, зроблено висновок, що Регоплант мае 4iTKi-ше виражений нематоцидний ефект, шж Ст1мпо.
У проведених дослщах in vitro було також отримано результати (морфоф1зюлог1чш по-казники росту та розвитку проростшв цук-рового буряку), що пщтверджують високу ефектившеть дИ композицшних препаратав проти цистоутворювально! нематоди Н. schachtii. На рис. 5 наведено фото отриманих тд час вирощування на шфекцшному фот
(у присутност1 личинок Н. schachtii) 5-ден-них проростшв цукрового буряку, отриманих з обробленого регулятором росту Стампо в концентрацп 5 мкг/мл насшня (А) — дослщ та необробленого регулятором росту насшня (Б) — контроль. Як видно, дослщш рослини тд впливом регулятора росту Стампо добре ростуть та розвиваються на шфекцшному фот, тод1 як контрольт рослини гинуть на 5-й день теля пророщування.
Проводячи молекулярно-генетичш експе-рименти з вивчення мехатзму д1'х композицшних препаратав, ми виходили з того, що враження оргатзму р1зними типами пато-гетв чи паразитав шдукуе синтез специф1ч-нихдо'1хньо'1 структури мРНК пул si/miRNA, i що регулятори росту стимулюють синтез si/miRNA, завдяки чому тдвищуеться 1мун1тет рослин за наведеним мехатзмом д1'х si/miRNA. Отримання вщповщей на щ питания може сприяти створенню нового поколшня регулятор1в росту з властивостями виб1рково! активацп синтезу si/miRNA, специф1чних до мРНК того чи шшого патогена або паразита.
JF = О 2406. * 4 60Г9. » 16.552
M. incognita
2
Концентращя аверсектину Мкг/мл
M. incognita
Н м»
лас
И™ »о
S п
300
S ф 25 0
F F
HÜ
ч
10.0
у а -0.4867»- ♦ 6.8198« ♦
! К • Ч
й ^ Ь щ
СС о 4 '5 а 'С.
Концентращя аверсектину Мкг/мл Рис. 4. Вплив регулятор1в росту на личинки галово'1 нематоди через 24 год теля оброблення регуляторами росту:
1 — Олмпо; 2 — Регоплант
7
Рис. 5. 5-денш проростки цукрового буряку, вирощеш на шфекцшному фош
(в присутност1 личинок цистоутворювально1 нематоди Н. эсЬасЫН): А — дослщш рослини, отримаш з насшня, оброб-леного регулятором росту Стампо в концент-рацп 5 мкг/мл; Б — рослини, отримаш з не обробленого регулятором росту насшня (контроль)
Результи ПААГ-електрофорезу (рис. 6) свщчать, що отримаш препарати si/miRNA високо1 чистоти мали розм1р 21-25 нуклео-тид1в, що вщповщае класичним параметрам цих титв РНК.
Подаш в табл. 3 дат свщчать про значне тдвищення синтезу власне кл1тинних si/miRNA за шфшування рослин цукрового буряку личинками нематод, 1 навпаки, про значне тдвищення синтезу антинематодних si/miRNA тд впливом композицшних пре-паратав Стампо, Регоплант з бюзахисними властивостями 1, як результат, зменшення ураження нематодами кл1тин рослин тд впливом цих препарайв.
a JU-
Ib:
i ■
с.
7 11-
1
2 3
Рис. 6. ПААГ-електрофорез si/mi RNA з npopocTKÍB цукрового буряку: маркерш полшуклеотиди (цифрами позначено довжину
в нуклеотидах) та препарат si/miRNA на дор1жках гелю (в1дпов1дно 1 та 2) були насичеш етид1умбром1дом; радюавтограф 33P м1чених si/mi RNA з гелю (дор1жка 3)
У проведених лабораторних досл1дах з визначення сортоспециф1чно1 дп композицшних препаратав з бюзахисними властивостями (Бюген, Ст1мпо, Регоплант) на pi3-них сортах озимо! пшенищ (Ятрань 60, Володарка, Смуглянка та Подолянка) досль джували ф1зюлопчш та морфогенетичш по-казники росту та розвитку: енергп пророс-тання насшня, густини проростшв, швидкоста росту, довжини й об'ему корене-во1 системи та надземно! частини — стебла i листшв npopocTKÍB, стшкоста npopocTKÍB рослин до полягання.
Таблица 3. Ступшь (%) ввдмшностей за р1внем пбридизацп популяцш цитоплазматичних 33Р-мРНК з гомолопчними si/miRNA з рослин цукрового буряку, оброблених пол1функщональними композицшними регуляторами та нематодою Н. schachtii ввдносно контрольних рослин
(як контроль використовували % пбридизацп 33Р-мРНК з гомолопчною si/miRNA з рослин, що ix не обробляли регуляторами та нематодами)
Назва регулятор1в Контроль В1дсоток аверсекти- Вар1анти дослдав
híb до регулятор1в Регулятори росту Регулятори росту + нематоди
BioreH (ем1стим + аверсектини) 0,2 96±0,54** (2%) 86±0,46** (12%)
2,5 94±0,72** (4%) 88±0,58** (10%)
5,0 91±0,66**(7%) 92±0,62**(6%)
Олмпо (бюлан + аверсектини) 0,2 97±0,58**(1%) 82±0,64**(16%)
98* 2,5 93±0,84**(5%) 84±0,72**(14%)
5,0 92±0,62**(6%) 87±0,68**(11%)
Регоплант (радос-тим + аверсектини) 0,2 94±0,38**(4%) 86±0,48**(12%)
2,5 92±0,73**(6%) 88±0,52**(10%)
5,0 88±0,68**(10%) 90±0,38**(8%)
ПримЬтки: 1. ** — Наявшсть достов1рних в!.дмш ввд контролю, Р < 0,05, п =3.
2. * — Наявшсть достов1рних в!.дмш власне в контроле Р < 0,05, п = 3.
3. Стушнь (%) ввдмшностей вивчали за допомогою методу дот-блот-г1бридизацп. У досл1дах використовували 7-денш проростки цукрового буряку; в дослвдш проби (чашки Петр!.) додавали 20 мкл розчину кожного з композицшних препарапв регулятор1в росту. Практично вс1 проростки буряку, оброблеш нематодами без регуля-тор1в росту, гинули на 5-й день шкубацп.
Визначення вщсотка гомологи у попу-лящях (наборах) цитоплазматичних мРНК-транскрип'йв, через яш геном реал1зуе програму синтезу структурних та функщо-нальних елементав, процеси росту й розвит-ку рослин упродовж усього 1х онтогенезу, методом дот-блот-пбридизацп Р33-кДНК одного сорту з мРНК вйх шших сортав показало достов1рш вщмшноста в популяцшних складах («спектрах»), а також р1зницю в змшах популяцшних показнишв мРНК у сорйв пщ впливом композицшних препа-ратав регулятор1в росту (табл. 4).
Одержан! результата щодо вщмшностей (р1знищ) в штегральних ф1зюлопчних та морфогенетичних показниках проростшв р1зних сортав пшенищ разом 1з зазначеними молекулярно-генетичними вщмшностями, а також рашше встановленими нами карди-нальними сортовими вщмшностями у сшв-вщношенш (баланс!) ф1тогормошв та тд впливом регулятор1в росту [1], свщчать про наявшсть можливо незворотних процемв перепрограмування геном1в у доотджених сортав, а також зворотних процейв тд впливом зовтшшх регуляторних чиннишв (за р1зними мехашзмами обох процемв).
Таблица 4. Стутнь (%) вщмшностей популяцшних характеристик цитоплазматичних мРНК р1зних сорив озимо'1 пшенищ, що були не оброблеш й оброблеш регуляторами росту
з бшзахисними властивостями
В!дсоток Регулятори росту
пбриди-
зацп кДНК сорту Ят- Бюген (ем1стим + аверсектини) Олмпо (бюлан + аверсектини) Регоплант (радостим + аверсектини)
рань 60
Сорти пшениц! з гомо-лопчною (контроль) та з гетеро-лопчни- ми (ДОСЛВДи) мРНК 0,2 2,5 5,0 0,2 2,5 5,0 0,2 2,5 5,0
Ятрань 60 98±0,63* 96±0,48** (2%) 94±0,44** (4%) 91 ±0,54** (7%) 97±0,62** (1%) 96±0,46** (2%) 94±0,72** (4%) 96±0,42** (2%) 93±0,46** (5%) 91±0,76** (7%)
Воло-дарка 89±0,56** (11%) 97±0,82** (1%) 86±0,78** (12%) 88±0,47** (10%) 90±0,48** (8%) 86±0,66** (12%) 84±0,54** (14%) 86±0,58** (12%) 84±0,98** (14%) 82±0,8** (16%)
Смуглянка 91±0,52** (9%) 88±0,96** (10%) 87±0,63** (11%) 82±0,43** (16%) 88±0,56** (10%) 90±0,54** (8%) 86±0,48** (12%) 87±0,76** (11%) 88±0,84** (10%) 84±0,78** (14%)
Подо-лянка 83±0,78** (15%) 82±0,65** (16%) 79±0, 74** (19%) 78±0,86** (20%) 77±0,68** (21%) 81 ±0,53** (17%) 76±0,84** (22%) 80±0,68** (18%) 77±0,82** (21%) 75±0,96** (23%)
ПримЬтки: 1. ** — Достов1ршсть ввдмшностей ввд контролю, Р < 0,05, п = 3.
2. Стушнь (%) ввдмшностейвивчали задопомогою методу дот-блот-г1бридизаци. У дослвдахвикористовували 7-денш проростки пшениц!., у дослвдш проби (чашки Петр!.) додавали по 20 мкл розчину кожного з композицшних препарапв регулятор1в росту, цифров1 значения 0,2; 2,5; 5,0 — % аверсектишв в1дносно регулятор1в росту.
Одшею з можливостей виявлених сорто-вих р1зниць може бути перегрупування (перепрограмування) гешв 1 виключення з ро-боти (наприклад, в результат! мутацп тд час створення сортав) активних гешв, що функщонували у вихщних батьшвських формах рослин, та включения рашше неак-тивних, але близьких за функщею гешв у мультигенних ймействах або суперймейст-вах гешв, у яких кожен член (вар1ант) ймейства дещо вщр1зняеться за нуклеотид-ною послщовшстю в регуляторних, коду-вальних та некодувальних делянках в !хшх структурах, мае р1зш призначення в адап-тацшних процесах 1 регулюеться р1зними факторами [37]. Таку можливють шдтверд-жують 1 одержан! нами результати за р1внем пригшчення бюсинтезу полшептид1в у без-кл1тинних системах проте'шового синтезу малими регуляторними РНК (si/miRNA), 1зольованими з р1зних сортав пшенищ (рис. 7). Сукупшсть цих результатав слугуватиме основою для подальшого визначення моле-кулярно-генетичних мехашзм1в вщмшнос-тей у чутливоста р1зних сортав озимо! пшениц! до регулятор1в росту рослин.
ill
к/
к'
к
к ju-
к
й rti ■
м
^ -
ю
к ji-
tt-
?г ■
п<
и
1
2
и
3
4-
4
Рис. 7. Вщсоток шпбування в безкл1тинних системах протешового синтезу i3 проростгав пшенищ бюсинтезу полшептид1в на матрицях мРНК з кл1тин сорт1в озимо'1 пшенищ Ятрань 60
за допомогою малих регуляторних РНК (si/miRNA), 1зольованих з кл1тин пшенищ сорив: Ятрань 60 (1); Володарка (2); Смуглянка (3) та Подолянка (4)
Як було показано, спостер1гаеться наяв-н1сть залежноста вщ структури сортово! спе-циф1чност1 сайленсорно! (шпбувально!) дИ si/miRNA на процеси трансляци мРНК сорт1в.
У ход1 експерименйв з вивчення молеку-лярно-генетичних мехашзм1в антипатоген-но1 дИ регулятор1в росту ми враховували
отримаш рашше в польових умовах даш [1, 17] про значне шдсилення захисних власти-востей р1зних сортав яро! пшенищ сорту Гр1зо до патогенного мшромщета Fusarium oxysporum graminearum.
У лабораторних дослщах, проведених на оброблених регуляторами росту з бшзахис-ними сполуками (BioreH, Стампо, Регоплант) рослинах яро! пшенищ сорту Гр1зо, було от-римано результати, яш свщчать про р1зке шдвищення стшкосй цих рослин (до 35-70%) до патогенного мшромщета Fusarium oxysporum graminearum. Методом дот-блот-йбридизацп препарайв цитоплазма-тичних мРНК (через кДНК) i попередшм визначенням гормонального складу у конт-рольних та дослщних рослин [17] встановле-но, що шдвищення врожайноста та стшкоста культур до шшднишв пов'язано i3 суттеви-ми змшами популяцшних характеристик (набор1в) мРНК та малих регуляторних si/miRNA, можливо, за рахунок виб1рково-го переключения активное^ гешв у вщпо-вщних мультиймействах гешв (табл. 5).
Таким чином, за допомогою молекуляр-но-генетичного методу дот-блот-йбриди-зацп вперше встановлено р1зницю в популяцшних характеристиках si/miRNA м1ж
Таблица 5. Стутнь (%) ввдмшностей за р1внем пбридизацп популяцш цитоплазматичних Р33-мРНК з гомолопчною si/miRNA з проростшв яро'1 пшенищ сорту Tpieo, що були вирощеш з насшня, обробленого регуляторами росту та мжромщетом Fusarium oxysporum graminearum, вщносно контрольних (одномшячних) рослин (як контроль використовували % пбридизацп Р33-мРНК з гомолопчною si/miRNA з рослин, не шфшованих патогенним мшромщетом Fusarium oxysporum
graminearum та мшромщетом Fusarium oxysporum)
Вар1анти дослдав
Назва регулятор1в Контроль Вщсоток аверсек-тин1в до регулятор1в Рослини, оброблеш регуляторами росту Рослини, шфшоваш Fusarium oxysporum graminearum та оброблеш регуляторами росту
BioreH 0,2 95±0,54**(3%) 82±0,46**(18%)
(ем1стим + аверсектини) 2,5 92±0,72** (6%) 88±0,58** (10%)
5,0 91±0,66**(7%) 92±0,62**(6%)
Ст1мпо (бюлан + аверсектини) 0,2 97±0,58**(1%) 80±0,64**(18%)
98* 2,5 93±0,84**(5%) 89±0,72**(9%)
5,0 90±0,62**(8%) 90±0,68**(8%)
Регоплант 0,2 94±0,38**(4%) 86±0,48**(12%)
(радостим + аверсектини) 2,5 89±0,73**(9%) 90±0,52**(8%)
5,0 87±0,68**(11%) 92±0,38**(6%)
Примики: 1. ** — Наявшсть достов1рних BiflMiH в1д контролю, Р < 0,05, n =3.
2. * — Наявшсть достов1рних в1дмш власне в контрол!., Р < 0,05, n =3.
3. Стушнь (%) ввдмшностей вивчали за допомогою методу дот-блот-п.бридизацп. У досл1дах використовували доросл1 (2-мк:ячш) рослини яро! пшенищ сорту Tpiso, вирощеш з насшня, що його не обробляли та обробляли регуляторами росту на шфекцшному фош з мшромщета Fusarium oxysporum graminearum.
контрольными проростками цукрового буряку та рослинами, що !х обробляли композицш-ними препаратами — регуляторами росту з бшзахисними властивостями, а також рослинами, що 1х обробляли регуляторами на штучно створеному нематодою Н. зсЬа-сЬ^И шфшованому фош. Результата свщчать про 1снування гнучко! системи пе-репрограмування геному кл1тин рослин тд д1ею р1зних зовшшшх регуляторних чиннишв.
Суттев1 змши в популяцшних характеристиках si/miRNA проростшв рослин яро! пшенищ сорту Гр1зо виявили, визначаючи вщсоток гомологи si/miRNA до мРНК у до-
рослих рослин, вирощуваних з насшня, об-робленого регуляторами росту рослин, не шфшованих та шфшованих мшромщетом Fusarium oxysporum graminearum. При цьо-муспостершали змши, що залежали вщ кон-центраци регулятор1в росту.
Уперше встановлено також популяцшш, залежш вщ дози регулятор!в росту, сортов! вщмшноста цитоплазматичних мРНК рослин пшенищ методом дот-блот-пбридизацп та з використанням безкл1тинно1 системи про-те'шового синтезу, яш можна пояснити гене-ТИЧНОЮ природою pi3HO'i СТШКОСЙ COpTiB рослин до бштичних та абютичних зовшш-Hix чиннишв.
Л1ТЕРАТУРА
1. Понотаренко С. П., Терек О. И., Грицаенко 3. М. и др. Биорегуляция роста и развития растений. - Глава 4 монографии «Биорегуляция микробно-растительных систем» / Под. ред. Путинской Г. А. и Пономаренко С. П. — К.: Ничлава, 2010. - 464 с.
2. Fuller V. L, Lilley C. J., Urwin P. E. Nematode resistance // New Phytol. — 2008. — V. 180. — P. 27-44.
3. Зиновьева С. В. Молекулярные механизмы взаимодействия растений и паразитических нематод: теоретические и прикладные аспекты / Паразитические нематоды растений и насекомых (К 50-летию фитопаразитоло-гических исследований в Институте паразитологии РАН). — М.: Наука, 2004. — С. 50-85.
4. Чижов В. Н. Диагностика галловых нематод рода Meloidogyne (Nematode: Tylenchida) в защищенном грунте / Там же. — М.: Наука, 2004. — С. 253-276.
5. Stevens M., May M. J. Pests, diseases and weeds review 2009 // British Sugar Beet Review. — 2010. — V. 78, N 1. — P. 7-10.
6. Стефановская Т. P. Агроэкологическое обоснование регуляции численности комплекса нематод сахарной свеклы.: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — К., 1992. — 29 с.
7. Stefanovska Т., Pidlisnyuk V. Challenges to grow oilseed rape Brassica napus in sugar beet rotations // Commun. Agricult. Appl. Biol. Sci. — 2009. — V. 74, N 2. — P. 573-579.
8. Faske T. R., Starr J. L. Sensitivity of Meloidogyne incognita and Rotylenchulus reniformis to Abamectin // J. Nematol. — 2006. — V. 38, N 22. — P. 240-244.
9. Garabedian S, Van Gundy S. D. Use of aver-mectins for the control of Meloidogyne incognita on tomatoes // Ibid. — 1983. — V. 15. — P. 503-519.
10. Jansson R. K., Rabatin S. Curative and residual efficacy of injection applications of avermectins for control of plant-parasitic nematodes on banana // Ibid. — 1997. — V. 29. — P. 695-702.
11. Faske T. R., Starr J. L. Cotton root protection from plant-parasitic nematodes by aba-mectin-treated seed // Ibid. — 2007. — V. 39.— P. 27-30.
12. Nordmeyer D., Dickson D. W. Management of Meloidogyne javanica, M. arenaria, and M. incognita on flue-cured tobacco with organophosphate, carbamate, and aver-mectin nematicides // Plant Disease. — 1985. — V. 69. — P. 67-69.
13. Roberts P. A, Matthews W. C. Disinfection alternatives for control of Ditylenchus dip-saci in garlic seed cloves // J. Nematol. — 1995. — V. 27. — P. 448-456.
14. Monfort W. S., Kirkpatrick T. L, Long D. L, Rideout S. Efficacy of a novel nematicidal seed treatment against Meloidogyne incognita on cotton // Ibid. — 2006. — V. 38, N 2. — P. 245-249.
15. Бшявсъка Л. О, Козирицъка В. 6, Валагу-рова В. О, 1утинсъка Г. О. Аверком — но-вий в1тчизняний препарат нематоцидно! i ф1тостимулюючо1 дп // С1льськогоспо-дарська мшроб1олопя (М1жвщ. тематич. наук. зб1рник). — 4epHÍrÍB! ЦНТЕ1, 2008. — Вип. 7. — С. 22-29.
16. Иутинская Г. А., Валагурова Е. В., Козы-рицкая В. Е. и др. Аверком - новый антипаразитарный препарат. - Глава 1 монографии «Биорегуляция микробно-растительных систем» / Под. ред. Путинской Г. А. и Пономаренко С. П. — К.: Ничлава, 2010. -464 с.
17. Tsygankova V. A, Galkin A. P., Galkina L. O. et al. Gene expression under regulators' stimulation of plant growth and development. — Chapter 3 of the Monograph «New
plant growth regulators: basic research and technologies of application» / Ed. Ponomarenko S. P., lutynska H. O. — K.: Nichlava, 2011. — 211 p.
18. Циганкова В. А, Андрусевич Я. В., Блюм Я. Б. Видьлення з клггин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною актив-шстю // Доп. АН Украши. — 2011. — № 9. — С. 159-164.
19. Elbashir S. M, Lendeckel W., Tuschl Т. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs // Genes Dev. — 2001. — V. 15. — P. 188-200.
20. Hamilton A., Voinnet O., Chappell L., Baulcombe D. Two classes of short interfering RNA in RNA silencing // EMBO J. — 2002. — V. 21, N 17. — P. 4671-4679.
21. Lee Y, Ahn C., Han J. et al. The nuclear RNase Ill Drosha initiates microRNA processing // Nature. — 2003. — V. 425. — P. 415-419.
22. Mourelatos Z, Dostie J., Paushkin S. et al. miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs // Genes Dev. — 2002. — V. 16. — P. 720-728.
23. Leung R. K. M, Whittaker P. A. RNA interference: from gene silencing to gene-specific therapeutics // Pharmacol. Therap. — 2005. — N 107. — P. 222-239.
24. Aravin A., Tuschl T. Identification and characterization of small RNAs involved in RNA silencing // FEBS Lett. — 2005. — V. 579. — P. 5830-5840.
25. Bakhetia M, Charlton W. L, Urwin P. E. et al. RNA interference and plant parasitic nematodes // Trends Plant Sci. — 2005. -V. 10, N 8. — P. 362-367.
26. Gheysen G, Vanholme B. RNAi from plants to nematodes // Trends Biotechnol. — 2006. — V. 25, N 3. — P. 89-92.
27. Knox D. P, Geldhof P, Visser A, Britton C. RNA interference in parasitic nematodes of animals: a reality check? // Trends Para-sitol. — 2007. — V. 23, N 3. — P. 105-107.
28. JianX., ZhangL., Li G. etal. Identification of novel stress-regulated microRNAs from Oryza sativa L. // Genomics. — 2010. — V. 95. — P. 47-55.
29. Chen R., Hu Z., Zhang H. Identification of microRNAs in wild soybean (Glycine soja) // J. Integrat. Plant Biol. — 2009. — V. 51, N 12. — P. 1071-1079.
30. Park W, Li J, Song R. et al. CARPEL FACTORY, a dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana induced silencing complex (RISC), which targets homologous RNAs for degradation // Curr. Biol. — 2002. — V. 12. — P. 1484-1495.
31. Llave C., Kasschau K. D., Rector M. A., Carrington J. C. Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants // Plant Cell. — 2002. - V. 14. — P. 1605-1619.
32. Padmanabhan Ch., Zhang X., Jin H. Host small RNAs are big contributors to plant innate immunity // Currf. Opin. Plant Biol. — 2009. — V. 12. — P. 465-472.
33. Yang T., XueL, An L. Functional diversity of miRNA in plants // Plant Sci. — 2007. — V. 172. — P. 423-432.
34. Oostenbrink M. Estimating nematode populations by some elected methods. Nematology / Ed. by Sasser J.N., Jenkins W.R. — Chapel Hill, NC; University of North Carolina Press, 1960. — P. 85-102.
35. Vrain T.C. A technique for the collection of larvae of Meloidogyne spp. and a comparison of eggs and l arvae as i nocu la // J. Nematol. — 1977. — V.9. — P. 249-251.
36. Tsygankova V. A., Blume Ya. B. et al. An unusual minor protein appearing in embryonic axis cells of haricot bean seeds fol lowing germination process stimulated by 6-methylthiouracil // Biopolymers and cell. — 1998. — V. 14, N 5. — P. 438-448.
37. Tsygankova V. A. Concerning the peculiarities of gene expression changes in plant leaf cells during twenty-four-hour period // Б1отехнолопя. — 2010. — Т. 3, № 4. — С. 86-95.
38. Tsygankova V. A., Musatenko L. I., Ponomarenko S. P. et al. Change of functionally active cytoplasmic mRNA populations in plant cells under growth regulators action and biological perspectives of cell-free systems of protein synthesis // Там само. — 2010. — Т. 3, № 2. — С. 19-32.
39. Locker J. Analytical and preparative electrophoresis of RNA in agarose-urea // Anal. Biochem. — 1979. — V. 98, N 2. — P. 358-367.
40. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual. — New York: Cold Spring Harbor Lab, 1982. — 480 p.
41. Promega protocols and applications guide. Second edition. — USA: Promega Corporation, 1991. — 422 p.
42. Методы биологии развития / Под ред. Дет-лафа Т. А., Бродского В. Я., Гаузе Г. Г. — М.: Наука. — 1974. — 619 с.
ИНДУКЦИЯ РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТА БИОСИНТЕЗА si/miPHK С АНТИПАТОГЕННЫМИ И АНТИПАРАЗИТАРНЫМИ СВОЙСТВАМИ В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ
В. А. Цыганкова? Т. Р. Стефановская2 Я. В. Андрусевич1 С. П. Пономаренко3 А. П. Галкин4 Я. Б. Блюм4
1 Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев Межведомственный научно-технологический центр «Агробиотех» НАН и МОН Украины, Киев
4Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев
E-mail: vTsygankova@ukr.net
В условиях лабораторных экспериментов показано, что композиционные поликомпонентные препараты с биозащитными свойствами Биоген, Стимпо и Регоплант по показателям прорастания и скорости роста проростков существенно повышают устойчивость растений (до 35-70%) сахарной свеклы к корнепарази-тирующей нематоде Heterodera shcachtii и галловой нематоде Meloidogyne incognita, а также яровой пшеницы к патогенному микромицету Fusarium oxysporum graminearum. Установлено, что максимальное уменьшение (~80%) количества личинок нематоды H. schachtii в корнях сахарной свеклы происходит при обработке семян регуляторами роста в наиболее эффективных концентрациях: Стимпо — 5 мкг/мл, Регоплант — 1 мкг/мл и Биоген — 1 мкг/мл.
С помощью дот-блот-гибридизации мРНК с кДНК и исследованием функциональной активности si/mi RNA в бесклеточной системе протеинового синтеза впервые показано, что устойчивость растений сахарной свеклы к нематодам H. schachtii и M. incognita, а также растений яровой пшеницы к патогенному микромицету Fusarium oxysporum graminearum достигается путем стимуляции синтеза малых регуляторных si/miPHK.
Ключевые слова: регуляторы роста растений, малые регуляторные РНК (si/miRNA), устойчивость растений к вредителям, бесклеточная система протеинового синтеза из проростков пшеницы.
INDUCTION OF si/miRNA BIOSYNTHESIS WITH ANTIPATHOGEN IC AND ANTIPARASITIC PROPERTIES BY GROWTH REGULATORS IN PLANT CELLS
V. A. Tsygankova1 T. R. Stefanovska2 Ya. V. Andrusevich S. P. Ponomarenko3 A. P. Galkin4 Ya. B. Blume4
1Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 2National University of Life and Environmental
Science of Ukraine, Kyiv 3National Enterprise Interdepartmental Science & Technology Center «Agrobiotech» of National Academy of Sciences and MES of Ukraine, Kyiv 4Institute of Food Biotechnology and Genomics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: vTsygankova@ukr.net
It was shown in laboratory experiments that compositional polycomponential preparations with bioprotective properties Biogen, Stimpo and Regoplant according to indexes of sprouting and speed of sprout growth considerably increase resistance (to 35-70%) of sugar beet plants to parasitic nematode Heterodera shcachtii and root-knot nematode Meloidogyne incognita and spring wheat to pathogenic micromycete Fusarium oxysporum graminearum. It was reveled that maximal reduction (on 80%) of H. schachtii larvae amount in the sugar beet roots takes place at application of growth regulators in the most effective concentrations: Stimpo — 5 |ag/ml, Regoplant — 1 |ag/ml and Biogen — 1 |ag/ml.
Using DOT-blot hybridization of si/miRNA with mRNA and testing inhibitory activity si/miRNA in cell free system protein biosynthesis is set that resistance of sugar beet against parasitic nematodes H. schachtii and M. incognita as well as resistance of spring wheat to pathogenic micromycete Fusarium oxysporum are reached through enhancement of synthesis of small regulatory si/miRNA.
Key words: plant growth, regulators, small regulatory RNA (si/miRNA), plant resistance to wreckers, cell-free system of wheat germ protein-synthesis.
