CC BY
20
УДК 571.27
Индукция экспрессии ICAM-1 в эмбриональных фибробластах мыши при их культивировании на губчатых фиброин-желатиновых скаффолдах
М. А. Носенко1,2,4, Н. В. Малюченко1, М. С. Друцкая1,2, А. Ю. Архипова1, И. И. Агапов3, С. А. Недоспасов1,2,4, М. М. Мойсенович1*
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, лаборатория молекулярных механизмов иммунитета, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32
3Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России, лаборатория бионанотехнологий, 123182, Москва, Щукинская ул., 1
4Немецкий ревматологический исследовательский центр, 10117, Берлин, Шаритеплатц, 1, Германия
*E-mail: mmoisenovich@mail.ru Поступила в редакцию 01.12.2016 Принята к печати 26.05.2017
РЕФЕРАТ Культивирование клеток в трехмерных условиях на биорезорбируемых каркасах (скаффолдах) - важнейший этап создания тканеинженерных конструкций, предназначенных для использования в регенеративной медицине, а также в качестве модельных систем для исследования механизмов клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий. Искусственные субстраты могут модулировать фенотип и функциональную активность иммобилизованных на них клеток. Изучение таких изменений важно как для понимания фундаментальных процессов, лежащих в основе взаимодействия клеток в трехмерном микроокружении, так и для совершенствования тканеинженерных конструкций. В представленной работе исследована экспрессия молекулы адгезии ICAM-1 в эмбриональных фибробластах мыши (МЭФ), культивируемых в фиброин-желатиновых скаффолдах. Повышенный уровень экспрессии ICAM-1 в МЭФ детектировали исключительно в условиях трехмерного культивирования на уровне как мРНК, так и белка. При этом культивирование МЭФ на различных субстратах не влияло на экспрессию MAdCAM-1, что свидетельствует об избирательности воздействия созданных трехмерных условий на экспрессию ICAM-1. Один из возможных механизмов индукции ICAM-1 в МЭФ связан с активацией AP-1, поскольку экспрессия Fos и Junb (но не Jun и Jund) в 3D повышалась. При культивировании фибробластов в 2D условиях уровень экспрессии компонентов AP-1 не изменялся.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА МЭФ, биоинженерия, полимерный матрикс, стромальные клетки, ICAM-1, 3D. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2D - двумерные условия; 3D - трехмерные условия; МЭФ - эмбриональные фибро-бласты мыши; ФЖ - фиброиновый скаффолд, содержащий 30% желатина.
ВВЕДЕНИЕ
Ранее нами был создан фиброин-желатиновый губчатый скаффолд, формирующий субстрат для адгезии и пролиферации клеток различных типов [1]. Фрагменты этого скаффолда размером 200-400 мкм при подкожном введении в область, прилегающую к ране, способствовали регенерации полнослойной раны кожи мыши, по-видимому, из-за их иммуномо-дулирующей активности [2]. Одним из возможных ме-
ханизмов, лежащих в основе регенеративной активности фиброин-желатиновых скаффолдов, может быть усиление экспрессии фибробластами после их контакта с поверхностью скаффолдов молекул адгезии, вовлеченных в иммунные реакции. Одной из таких молекул является 1САМ-1. В норме 1САМ-1 представлена на фибробластах в небольшом количестве, а ее экспрессия может быть индуцирована в результате изменения микроокружения. Например, при воспа-
лении экспрессия ICAM-1 в тканеспецифичных фи-бробластах значительно возрастает и способствует миграции иммунных клеток к очагу воспаления [3, 4]. ICAM-1 важна для функционирования лимфоид-ных органов, где молекула обеспечивает контактные взаимодействия между клетками иммунной системы, стромальными и эндотелиальными клетками [5]. Воспроизведение этих и других взаимодействий, опосредованных трехмерным окружением, как in vitro, так и in vivo представляет важный этап в конструировании искусственной лимфоидной ткани [6].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Первичную культуру МЭФ и губчатые фиброиновые скаффолды, содержащие 30% желатина (3D ФЖ), получали как описано ранее [1]. Для 2D культивирования использовали скаффолды, выполненные в виде пленок из водного раствора того же состава, или культуральный пластик Nunc (Thermo Fisher Scientific, США).
РНК из МЭФ выделяли по стандартному протоколу с использованием TRI Reagent (Sigma Aldrich, США), наборов для обратной транскрипции (Thermo
Scientific, EN0521 и K1621) и ПЦР в реальном времени («Синтол», М-440), руководствуясь при этом рекомендациями производителей. Качество реакций оценивали по кривой плавления и электрофорезу в 1.8% агарозном геле продуктов амплификации. Снимки гелей проводили с помощью GelDoc™XR+System (BioRad, США). В качестве положительного контроля при анализе экспрессии гена Madcaml использовали суммарную РНК, выделенную из лимфатических узлов мыши. Работу проводили на приборе 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, США).
Иммунофлуоресцентный анализ проводили с применением антител aICAM1-Cy5 (KAT1), ядерного красителя SYTOX orange, конъюгата фаллоидин-ФИТЦ для визуализации полимеризованного актина. Образцы заключали в Aqua-Poly/Mount (Polysciences, Inc., США). Полученные препараты исследовали с использованием электронного микроскопа Camscan Series II (Cambridge Instruments) в режиме SEI и на микроскопе Nikon Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 (Nikon Corp., Япония) и объективом Apo TIRF 60Х/1.49 Oil или CFI Plan Apo VC 20Х/0.75.
/
Рис. 1. Микроструктура скаффолдов и анализ цитоскелета МЭФ в условиях 3D культивирования. Изображения скаффолда получены на сканирующем электронном микроскопе (А, Б); в водной среде с использованием конфокальной системы в проходящем свете (DIC, В); проекция 150 оптических срезов с интервалом 1.2 мкм (Г). Материал скаффолда выявлен ТРИТЦ. Объектив CFI Plan Apo VC 20Х/0.75. Д-Д'' - трехмерная реконструкция в виде горизонтальной проекции 242 оптических срезов с интервалом 281 нм (68.002 мкм). Е-Е'' -оптические срезы на расстоянии 0, 20 и 40 мкм от первого оптического среза. Зеленым показан цитоскелет клеток (фаллоидин-ФИТЦ), красным - ядра (SYTOX orange). Объектив Apo TIRF 60Х/1.49 Oil
л
-D I
<U
to -
О У
аз
100
10
1
ICAM-Cy5 SYTOX orange
" в '
„ 4 « *
* ч&кГ *V' ¿L ч,ш ту1 ч ' ■■■ # 1 * «
3 »
в *
¥ ■ •»
Наложение
Icaml
K- 7 10 13 Дни культивирования
:МЭФ в 3D ШЭФ в 2D
ICAM-Cy5
Наложение
» if 1*; ' ■'s -^fv't3 f.. * T 'V ■ ® .1 V« , A f * W i $ « , ^
• . % " ~ ■ ■■ J** ж Л".. v- . 50 мкм
Д
Дни культивирования
10
13
Actb
Madcaml
K+
K-
200 п.н. 100 п.н. 200 п.н. 100 п.н.
Б
7
Рис. 2. Экспрессия ICAM-1 в МЭФ. А - распределение GFP+ МЭФ при культивировании на 3D скаффолдах. Материал скаффолда выявлен ТРИТЦ. Б - экспрессия Icaml в культуре МЭФ в 2D (на пластике) и в 3D ФЖ. Значения рассчитаны относительно уровня экспрессии генов в МЭФ до начала эксперимента (обозначен К-). Данные репрезентативны для трех независимых экспериментов. * - p < 0.05; *** - p < 0.001; ns - незначимая разница. В, Г - иммунофлуоресцентное окрашивание ICAM-1 в культуре МЭФ в 3D условиях (В), а также на 2D подложке из фиброина (Г, верхний ряд) и поверхности культурального пластика (Г, нижний ряд). Объектив - CFI Plan Apo VC 20х/0.75. Д - экспрессия гена Madcaml в культуре МЭФ в 3D ФЖ. Представлены результаты электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. Положительный контроль (К+) - материал лимфатических узлов мыши, в отрицательном контроле (К-) отсутствовала матрица для ПЦР
х у
и и <и
а □
и X
т л I
v
а
0
а
> X X
1 X
с
<и
н у
и
0
1
12
10
Fos
I
10
13
12 10 8 6 4 2 0
Jun
— .1
10
13
12
10
Junb
0 12 10 8 6 4 2 0
Jund
МЭФ в 3D МЭФ в 2D
7
10
13
Рис. 3. Экспрессия генов AP-1. Экспрессия генов транскрипционного фактора AP-1 в культуре МЭФ при культивировании на пластике (2D) и на фибро-иновых скаффол-дах (3D). Значения рассчитаны относительно уровня экспрессии генов на седьмой день в МЭФ в 3D условиях. * - p < 0.01; *** - p < 0.001
Дни культивирования
8
8
6
6
4
4
2
2
0
7
7
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3D ФЖ скаффолд имеет трехмерную пористую структуру со сложной внутренней и внешней топографией (рис. 1А—Г). Важно, что при культивировании МЭФ на скаффолдах взаимодействие клеточных структур с субстратом осуществляется в различных плоскостях (рис. 1Д,Е'). Распределение клеток на поверхности трехмерного скаффолда также представлено на рис. 2А.
Поскольку молекулы адгезии играют важнейшую роль во взаимодействии клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом, для изучения влияния условий культивирования на свойства МЭФ была проанализирована экспрессия гена молекулы адгезии ICAM-1 в 3D и 2D культурах. Известно, что цито-плазматический домен молекулы ICAM-1 взаимодействует с актиновым цитоскелетом [7], а кластеризация ICAM-1 индуцирует ассоциацию ICAM-1
с актинсвязывающими адаптерными белками и связывает ICAM-1 с F-актиновым цитоскелетом [8]. Мы предположили, что перестройки цитоскелета, вызванные культивированием МЭФ в трехмерных фиброиновых скаффолдах, могут приводить к изменению экспрессии ICAM-1. Действительно, при длительном культивировании МЭФ на фиброиновых скаффолдах, но не на культуральном пластике, наблюдается значительное увеличение экспрессии гена 1сат1 (рис. 2Б). В соответствии с данными по экспрессии гена интенсивное окрашивание МЭФ антителами к ICAM-1 наблюдали только в условиях 3Б культивирования (рис. 2В). При этом при 2D культивировании фибробластов на ФЖ-пленках или на стекле сигнал практически отсутствовал (рис. 2Г). Наличие очень слабого сигнала, по-видимому, обусловлено базовым уровнем экспрессии мРНК 1сат1 в 2D культуре (рис. 2Б).
Чтобы убедиться в специфичности наблюдаемого эффекта и отсутствии его связи с общим повышением уровней экспрессии различных генов в процессе культивирования на 3D субстратах, была проанализирована экспрессия гена другой молекулы адгезии - MAdCAM-1. MAdCAM-1, как и ICAM-1, экспрессируется на стромальных и эндотелиальных клетках и является одним из ключевых участников в миграции иммунных клеток в лимфоидные органы, а также в барьерные ткани, однако для нее характерна специфическая индукция при активации некоторых цитокиновых рецепторов [9].
Продукты экспрессии гена Madcam1 в культуре МЭФ на скаффолдах не были выявлены, что свидетельствует об избирательности влияния трехмерных условий культивирования на экспрессию генов молекул адгезии (рис. 2Д).
Известно, что промоторная область гена 1сат-1 содержит три сайта связывания транскрипционного фактора АР-1, который участвует в его регуляции [10]. Один из возможных механизмов индукции ICAM-1 в МЭФ может быть связан с изменением активности фактора АР-1. Анализ экспрессии генов, кодирующих субъединицы АР-1 (Fos, Jun, Jund, JunЪ) (рис. 3) показал значимое увеличение уровня экспрессии Fos и JunЪ в условиях 3D культивирования по сравнению с 2D. Экспрессия генов Jun и Jund не зависела от условий культивирования и не изменялась статистически значимо.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Moisenovich M.M., Arkhipova A.Y., Orlova A.A., Drutskaya M.S., Volkova S.V., Zacharov S.E., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P. // Acta Naturae. 2014. V. 6. № 1. P. 96-101.
2. Архипова А.Ю., Носенко М.А., Малюченко Н.В., Зварцев Р.В., Мойсенович А.М., Жданова А.С., Васильева Т.В., Горшкова Е.А., Агапов И.И., Друцкая М.С., Недоспасов С.А., Мойсенович М.М. // Биохимия. 2016. Т. 81. № 11. C. 1494-1504.
3. Couture P., Paradis-Massie J., Oualha-Morin N., Thibault G. // Exp. Cell Res. 2009. V. 315. № 13. P. 2192-2206.
4. Zandvoort A., van der Geld Y.M., Jonker M.R., Noordhoek J.A., Vos J.T., Wesseling J., Kauffman H.F., Timens W., Postma D.S. // Eur. Respir. J. 2006. V. 28. № 1. P. 113-122.
5. Randall T.D., Carragher D.M., Rangel-Moreno J. // Annu. Rev. Immunol. 2008. V. 26. P. 627-650.
В дальнейшем предстоит понять, какие сигнальные пути, начиная с механорецепции трехмерного скаффолда или межклеточных взаимодействий, приводят к экспрессии АР-1 и затем, по-видимому, к появлению ICAM-1. Также нельзя исключать участия других транскрипционных факторов в индукции экспрессии ICAM-1. Так, например, известно, что в этот процесс вовлечено семейство транскрипционных факторов NF-xB [11].
ВЫВОДЫ
Культивирование МЭФ в трехмерных фиброин-желатиновых скаффолдах приводит к существенному повышению экспрессии ICAM-1.
Усиление экспрессии ICAM-1 связано с трехмерной организацией скаффолда, а не с влиянием продуктов деградации фиброина, так как культивирование на двумерном фиброиновом матриксе не влияло на экспрессию молекулы.
Увеличение экспрессии ICAM-1 сопряжено с усилением экспрессии генов АР-1 - Fos и JunЪ, но не Jun и Jund.
Работа осуществлена при поддержке РФФИ (грант № 15-29-04903) и гранта Президента РФ для ведущих научных школ (НШ-10014.2016.4).
6. Nosenko M.A., Drutskaya M.S., Moisenovich M.M., Nedospasov S.A. // Acta Naturae. 2016. V. 8. № 2. P. 10-23.
7. Carpen O., Pallai P., Staunton D.E., Springer T.A. // J. Cell. Biol. 1992. V. 118. P. 1223-1234.
8. Schaefer A., Te Riet J., Ritz K., Hoogenboezem M., Anthony E.C., Mul F.P., de Vries C.J., Daemen M.J., Figdor C.G., van " Buul J.D., Hordijk P.L. // J. Cell. Sci. 2014. V. 127. № 22.
P. 4470-4482.
9. Ando T., Langley R.R., Wang Y., Jordan P.A., Minagar A., Alexander J.S., Jennings M.H. // BMC Physiol. 2007. V. 14. № 7. P. 10.
10. Voraberger G., Schafer R., Stratowa C. // J. Immunol. 1991. V. 147. № 8. P. 2777-2786.
11. Roebuck K.A., Finnegan A. // J. Leukoc. Biol. 1999. V. 66. № 6. P. 876-888.
