CC BY
84
Индукция антибиотикообразования при глубинном культивировании штаммов редких родов актиномицетов
*Н. Г. КУЛИКОВА, Л. П. ТЕРЕХОВА
НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, Москва
Induction of Antibiotic Formation of Strains of Rare Actinomycetes in Depth Cultivation
N. G. KULIKOVA, L. P. TEREKHOVA Gause Intitute of New Antibiotics, Moscow
Были проведены испенеследования по биосинтезу антибиотиков у культур редких родов актиномицетов, которые представляют интерес как потенциальные продуценты новых антибиотических веществ. В связи с тем, что отобранные штаммы были неактивными при глубинном культивировании на жидких питательных средах, была поставлена цель подбора условий индукции антибиотикообразования у данных культур актиномицетов. Поставленная цель была достигнута при использовании адреналина и калиевой соли индолил-3-уксусной кислоты в качестве активаторов антибиотикообразования.
Ключевые слова: биологически активные соединения, антибиотики, актиномицеты, биосинтез, адреналин, индолил-3-уксусная кислота.
The research was carried out on the biosynthesis of antibiotics in cultures of rare actinomycetes, which are of interest as potential producers of new antibiotic substances. Due to the fact that the selected strains were inactive during deep cultivation on liquid nutrient media, the goal was to select the conditions for induction of antibiotic formation in these cultures of actinomycetes. The goal was achieved with the use of adrenaline and potassium salt of indole-3-acetic acid as activators of antibiotic formation.
Keywords: biologically active compounds, antibiotics, actinomycetes, biosynthesis, adrenaline, indole-3-acetic acid.
Введение
При первичном скрининге штаммов-антагонистов, выделенных из природных источников, антибиотические свойства в отношении набора тест-бактерий проверяются на агаровых средах, затем проводят культивирование продуцентов на жидких питательных средах с целью химического выделения антибиотика, а также микробиологические и химические исследования по определению антибиотического вещества [1]. Однако на практике значительная часть активных на агаровых средах штаммов оказывается биологически неактивной при глубинном культивировании на жидких питательных средах, в связи с чем дальнейшее их изучение не проводится. Известно, что большинство актиномицетов могут синтезировать антибиотики, для этого необходимо подобрать условия культивирования, обеспечивающие биосинтез антибиотика.
Нами были проведены исследования по биосинтезу антибиотиков у культур редких родов актиномицетов (не принадлежащих к роду Streptomyces), которые представляют интерес как потенциальные
© Н. Г.Куликова, Л. П.Терехова, 2017
*Адрес для корреспонденции: 119021, г. Москва, ул. Большая Пироговская, д. 11. НИИНА им. Г. Ф. Гаузе
продуценты новых антибиотических веществ. В связи с тем, что отобранные штаммы были неактивными при глубинном культивировании на жидких питательных средах была поставлена задача подбора условий индукции антибиотикообразования у данных культур актиномицетов.
Материал и методы
Биосинтез антибиотиков при глубинном культивировании проводился у 15 штаммов актиномицетов (6 штаммов почвенных и 9 штаммов эндофитных актиномицетов), которые принадлежали к культурам редких родов порядка Actinomycetales — Nonomuraea spp., Nocardiopsis spp. и Actinoplanes spp.; на основании изучения антибиотических свойств на агаровых средах отобранные штаммы были активны в отношении грамположительных тест-бактерий, включая метициллинорезистентный стафилококк Staphylococcus aureus ИНА 00761 (MRSA).
Глубинное культивирование культур проводили на жидких питательных средах, представленных в табл. 1 [2]. Культуры выращивались в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл, содержащих 150 мл жидкой питательной среды, при постоянном качании при 180 об/мин и температуре 28°С.
Определение антибиотического спектра действия куль-туральной жидкости исследуемых штаммов проводили каждые 48 ч методом диффузии в органический агар 2 Гаузе (триптон — 3,0 г; NaCl — 5,0 г; пептон — 5,0 г; агар — 20,0 г; глюкоза — 10,0 г; вода — 1000 мл; pH 7,2—7,4) [2] по отношению к грамположительным тест-бактериям — Staphylococcus aureus ИНА 00985 (FDA 209Р), Staphylococcus aureus ИНА 00761 (MRSA), Staphylococcus aureus ИНА 00762,
Таблица 1. Состав жидких питательных сред, используемых в работе
Название питательной Состав
среды
Органическая среда 2 Гаузе с мелом Триптон — 3,0 г; №С1 — 5,0 г; пептон — 5,0 г; СаС03 — 2,5 г; глюкоза — 10,0 г; вода — 1000 мл; рН 7,2 — 7,4
Среда А4 соя — 10,0 г; ШС1 — 5,0 г; глюкоза — 10,0 г; СаС03 — 2,5 г; вода — 1000 мл; рН 7,2—7,4
Среда 330 Крахмал — 20,0 г; №С1 — 0,5 г; горох — 0,5 г; СаС03 — 5,0 г; сахароза — 0,5 г; вода — 1000 мл; NN0, — 5,0 г; рН 7,0
Среда 6613 КК03 — 4,0 г; №С1 — 0,5 г; СаС03 — 5,0 г; дрожжевой экстракт — 2,5 г; крахмал — 20,0 г; вода — 1000 мл; рН 7,0
Среда 2663 Соя — 15,0 г; №С1 — 2,0 г; глицерин — 30,0 г; СаС03 — 5,0 г; вода — 1000 мл; рН 7,0
Среда 5339 Соя — 5,0 г; №С1 — 3,0 г; глицерин — 20,0 г; СаС03 — 2,0 г; ^Н4)2804 — 1,5 г; вода — 1000 мл; рН=6,8
Среда 11654 Соя — 20,0 г; №С1 — 3,0 г; глюкоза — 30,0 г; СаС03 — 3,0 г; вода — 1000 мл; рН 7,4
Среда «сах» Сахароза — 20,0 г; ШС1 — 3,0 г; соя — 10,0 г; СаС03 — 3,0 г; ™03 — 2,0 г; вода — 1000 мл; рН 7,0
Среда «тобрекс» Глюкоза — 40,0 г; КС1 — 0,5 г; пептон — 10,0 г; — 3,0 г; Мв804 — 1,5 г; Бе804 — 10,0 мг; КН2Р04 — 2,0 г; вода дистиллированная — 1000 мл; рН 5,2
Micrococcus luteus ATCC 9341, Bacillus subtilis ATCC 6633; гра-мотрицательным тест-бактериям — Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и дрожжеподоб-ным грибам — Saccharomyces cerevisiae ИНА S-1. Суспензия тест-бактерий для посева на чашки Петри содержала 107— 109 КОЕ/мл. Суспензию каждого штамма тест-бактерии засеивали «газоном» на чашку Петри. В лунки вносили по 100 мкл культуральной жидкость исследуемого штамма. Затем чашки помещали в термостат при температуре 28°С на 48 ч, после чего по зонам подавления роста тест-бактерий устанавливали антибиотический спектр действия изучаемого штамма. Диаметр зон угнетения роста тест-микробов измеряли при помощи линейки с точностью до 1 мм.
В качестве индукторов антибиотикообразования были использованы адреналин и калиевая соль индолил-3-уксус-ной кислоты (ИУК). Известно, что адреналин и ИУК представляют собой биологически активные соединения животного (адреналин) и растительного (адреналин, ИУК) происхождения, которые активизируют биохимические процессы, регулируют метаболические и энергетические процессы в клетках [3, 4]. В работе использовали синтетический адреналин, лекарственное средство под торговым названием Адреналин (эпинефрин) (Московский эндокринный завод, Россия). Ввиду того, что ИУК плохо растворима в воде, была использована водорастворимая калиевая соль ИУК, которая является действующим веществом препарата Гетероауксин (ООО «Ортон», Россия).
Подбор оптимальных концентраций действия адреналина и калиевой соли ИУК проводили на органической среде 2 Гаузе с мелом в отношении грамположительной тест-бактерии Micrococcus luteus ATCC 9341. Раствор адреналина брали в концентрациях 0,0005, 0,001, 0,0015 и 0,002 мг/л, калиевой соли ИУК — 0,005, 0,01, 0,015, 0,02 и 0,025 мг/л. Растворы биогенных аминов добавляли в жидкие питательные среды с первого дня культивирования актиномицетов, пропуская через стерильный мембранный фильтр диаметром пор 0,22 мкм во избежание контаминации культуральной жидкости.
Изучение чувствительности тест-бактерий к растворам биогенных аминов проводили методом градиентных пластин. В стерильные чашки Петри, поставленные наклонно, наливали слой органического агара 2 Гаузе. После того, как застывал нижний слой агара, чашку ставили в горизонтальное положение и наливали второй слой питательного агара, содержащего раствор биогенного амина (биомедиатора): адреналина в концентрациях 0,0005, 0,001, 0,0015, 0,002 мг/л и/или калиевой соли ИУК — 0,005, 0,01, 0,015, 0,02 и 0,025 мг/л. В качестве контроля служили чашки с двумя слоями агара без растворов биомедиаторов. На поверхность агара наносили суспензию спор изучаемого организма в виде штриха по направлению к краю чашки с наибольшей концентрацией раствора адреналина или калиевой соли ИУК. Чашки инкубировали при 28°С
в течение 5—7 сут., после чего определяли антибактериальное действие изучаемых биогенных аминов в отношении используемых тест-бактерий. Опыты проводили в трёхкратной по-вторности.
С целью индукции антибиотикообразования штаммы актиномицетов редких родов Actmoplanes Брр., Nocardiopsis Брр. и Nonomuraea Брр. выращивали на жидких питательных средах (табл. 1) с добавлением растворов адреналина и калиевой соли ИУК с первого дня культивирования.
Результаты и обсуждение
Известно, что индуцировать антибиотикооб-разование у актиномицетов возможно посредством ауторегуляторов — физиологически активных соединений различной химической природы. Эти соединения играют сигнальную роль в изменении количественного (скорость роста) или качественного (цитодифференцировка) состояния микробной культуры [5, 6]. Также известно, что биомедиаторы влияют на биохимические и метаболические процессы в клетках [3]. Для выполнения поставленной задачи по подбору условий индукции биосинтеза антибиотиков у отобранных культур актиномицетов нам было необходимо подобрать ауторегуляторы, которые влияли бы на метаболические процессы в микробных клетках актиномицетов и посредством которых активизировался бы биосинтез антибиотических веществ. В ранее проведённых исследованиях по влиянию адреналина и калиевой соли ИУК на прорастание спор актиномицетов установлено, что данные соединения оказывают стимулирующее действие на прорастание спор актинобакте-рий при выделении их из почвенных и растительных образцов, а также способствуют выделению большего количества антибиотически активных штаммов актиномицетов из природных источников [7, 8]. Предположив, что растворы биогенных аминов могут оказать инициирующее действие на биосинтез антибиотиков посредством влияния на экспрессию генов и метаболические пути антибиотикообразования у актиномицетов, мы провели серию экспериментов по подбору их действующих концентраций при глубинном культивиро-
Зоны подавления роста Micrococcus luteus ATCC 9341 штаммами редких родов актиномицетов, культивируемых на жидкой питательной среде 2 Гаузе с мелом.
Примечание. SA - почвенные актиномицеты; EA - эндофитные актиномицеты. Неактивные культуры были исключены из диаграмм. Достоверность различий соответствует р<0,05.
вании штаммов на жидкой питательной среде 2 Гаузе с мелом в отношении M.luteus ATCC 9341. После культивирования исследуемых актиномицетов на жидких средах с биологически активными веществами в концентрациях адреналина — 0,001, 0,0015 и 0,002 мг/л, калиевой соли ПУК — 0,015 и 0,02 мг/л на 5—9-е сутки у некоторых культур наблюдалось появление антибактериального действия в отношении тест-бактерии (рисунок). В контроле исследуемые штаммы были не активны. В результате проведённых экспериментов были установлены оптимальные концентрации действия адреналина — 0,001 мг/л и калиевой соли ПУК — 0,02 мг/л.
Появление антибактериального действия у исследуемых штаммов при культивировании на жидких питательных средах с добавлением биогенных аминов может быть связано с двумя фак-
торами — чувствительностью тест-бактерий к растворам андреналина и/или ИУК или индукцией образования антибиотиков биогенными аминами. Для того, чтобы понять за счёт каких факторов наблюдалось появление антибиотической активности, была изучена чувствительность тест-бактерий к адреналину и калиевой соли ИУК. Проверка чувствительности тест-бактерий к биомедиаторам показала, что к установленным концентрациям биогенных аминов тест-бактерии не чувствительны. Ввиду того, что антибактериальная активность у биогенных аминов не была обнаружена, влияние внесённых в питательную среду биомедиаторов нельзя объяснить их антибиотическим действием на тест-бактерии.
В результате проведённых экспериментов по индукции биосинтеза антибиотиков путём добавления в жидкие питательные среды био-
Таблица 2. Результаты изучения индукции антибиотикообразования неактивными культурами актиноми-цетов редких родов на различных жидких питательных средах
№ активного штамма Название жидкой питательной Зона подавления тест-бактерий, мм
среды с добавлением Staphylococcus aureus Micrococcus luteus
адреналина/гетероауксина MHA 007б2 ATCC 9341
52SA Среда 2663 20+1 18+0,85
Среда 11654 22+1,1 15+0,75
Органическая среда 2 Гаузе с мелом 22+1,1 15+0,73
19EA Среда 2663 18+0,85 18+0,85
Среда 11654 22+1,1 1б+0,8
Органическая среда 2 Гаузе с мелом 20+1 18+0,85
20EA Среда 2663 1б+0,8 н/а
83EA Среда 2663 21 + 1,05 18+0,85
Среда 11654 20+1 12+0,б
85EA Среда 2663 1б+0,8 н/а
90EA Среда 2663 15+0,75 н/а
97EA Среда 11654 18+0,85 12+0,б
109EA Среда 11654 20+1 н/а
Примечание. Указаны номера антибиотически активных штаммов на жидкой питательной среде. Достоверность различий соответствует р<0,05.
логически активных соединений выявлено, что при ферментации культур на жидких питательных средах — среде 2663, органической среде 2 Гаузе с мелом и среде 11654 с адреналином (0,001 мг/л) и/или калиевой соли ИУК (0,02 мг/л) у 8 штаммов из 15 инициируется образование антибиотических веществ, активных в отношении грамположительных тест-бактерий Staphylococcus aureus ИНА 00762 и Micrococcus luteus ATCC 9341. Вероятнее всего, адреналин и гетероауксин, являясь биогенными аминами, могут стимулировать активацию ферментов синтеза вторичных метаболитов посредством активизации биохи-ЛИТЕРАТУРА
1. Гаузе Г.Ф. Пути изыскания новых антибиотиков. Изд-во Академии наук СССР, М.: 1961. — 174 с. / Gauze G.F. Puti izyskaniya novykh antibiotikov. Izd-vo Akademii nauk SSSR, M.: 1961; 174. [in Russian]
2. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.Л., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М.: Наука, 1983. — 245 с. / Gauze G.F., Preobrazhenskaya T.P., Sveshnikova M.L., Terekhova L.P., Maksimova T.S. Opredelitel' aktinomitsetov. M.: Nauka, 1983; 245. [in Russian]
3. Рощина ВВ. Нейротрансмиттеры — биомедиаторы и регуляторы растений: Учебное пособие. [Электронный ресурс]. Пущино: Институт биофизики клетки РАН. — 2010. — Режим доступа: http://window.edu.ru/resource/504/68504/files/neirotransmitters.pdf / Roshchina V.V. Nejrotransmittery — biomediatory i regulyatory rastenij: Uchebnoe posobie. [EHlektronnyj resurs]. Pushchino: Institut biofiziki kletki RAN. — 2010. — Rezhim dostupa: http://window.edu.ru/ resource/504/68504/files/neirotransmitters.pdf [in Russian]
4. Herbert E. J, Donald G. C. Indole-3-acetic Acid. Org Synth Coll 1964, 44: 64: 5: 654.
5. Черногор Н. П, Винников А. И., 2004. Ауторегуляторы роста микроорганизмов [Электронный ресурс]. Днепропетровский нацио-
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Куликова Нина Георгиевна — к. б. н., н. с. лаборатории таксономического изучения и коллекции культур микроорганизмов, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
мических и метаболических процессов в клетках (табл. 2) [3, 4].
Можно заключить, что, по-видимому, внесение биогенных аминов инициирует биосинтез антибиотических веществ у некоторых культур актиномицетов. Полученные результаты предполагают возможность применения адреналина и калиевой соли ИУК в качестве ауторегуляторов индукции образования антибиотиков у культур редких родов актиномицетов, что будет способствовать наиболее полному выявлению потенциальных продуцентов антибиотических веществ с новыми ценными свойствами.
нальный университет. — 2004. — Режим доступа: http://www.stat-tionline.org.ua/biolog/47/5832-autoregulyatory-rosta-mikroorganiz-mov.html / Chernogor N. P, Vinnikov A. I., 2004. Autoregulyatory rosta mikroorganizmov [Ehlektronnyj resurs]. Dnepropetrovskij natsional'nyj universitet. — 2004. — Rezhim dostupa: http://www.stattionline.org.ua/ biolog/47/5832-autoregulyatory-rosta-mikroorganizmov.html [in Russian]
6. Ефременкова O.B. Ауторегуляторы группы A-фактора. Биоорганическая химия, 2016. — №5. — С. 508-525. / Efremenkova O.V. Autoregulyatory gruppy A-faktora. Bioorganicheskaya khimiya 2016; 5: 508-525. [in Russian]
7. Мачавариани Н.Г., Кустова H.A., Талатенко O.A. Выделение акти-номицетов — продуцентов антибиотиков из почвы селективными методами, основанными на активации прорастания спор. Химическое и нефтегазовое машиностроение. — 2010. — С. 21. / Machavariani N.G., Kustova N.A., Galatenko O.A. Vydelenie aktinomit-setov — produtsentov antibiotikov iz pochvy selektivnymi metodami, osnovannymi na aktivatsii prorastaniya spor. Khimicheskoe i neftega-zovoe mashinostroenie 2010; 21. [in Russian]
8. Machavariani N. G, Ivankova T. D, Sineva O. N, Terekhova L.P. Isolation of Endophytic Actinomycetes from Medicinal Plants of the Moscow Region, Russia. World Applied Sciences J 2014; 30 (11): 1599—1604.
Терехова Лариса Петровна — д. б. н., п рофессор, зав. лабораторией таксономического изучения и коллекции культур микроорганизмов, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
