Научная статья на тему 'Индикация микроорганизмов при гнойно-некротическом поражении основы кожи в области копытец у коров методом ПЦР'

Индикация микроорганизмов при гнойно-некротическом поражении основы кожи в области копытец у коров методом ПЦР Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
236
43
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КОРОВЫ / МИКРООРГАНИЗМЫ / ПЦР-ДИАГНОСТИКА / НЕКРОБАКТЕРИОЗ / COWS / MICROORGANISMS / PCR-BASED DIAGNOSTICS / NECROBACILLOSIS

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Марьин Евгений Михайлович, Ермолаев Валерий Аркадьевич

В данной статье приведены результаты выделения микроорганизмов, у больных гнойным пододерматитом коров при использовании метода ПЦР. Для проведения ПЦР использовался комплект для ПЦР-диагностики СЕПТОСКРИН и НУКЛЕАПОЛ. В пробах раневого экссудата методом Rial-Time PCR выделены следующие микроорганизмы: Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. Возбудителя некробактериоза В данной статье приведены результаты выделения микроорганизмов, у больных гнойным пододерматитом коров при использовании метода ПЦР. Для проведения ПЦР использовался комплект для ПЦР-диагностики СЕПТОСКРИН и НУКЛЕАПОЛ. В пробах раневого экссудата методом Rial-Time PCR выделены следующие микроорганизмы: Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. Возбудителя некробактериоза в течение всего экспериментального периода не обнаружено.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Марьин Евгений Михайлович, Ермолаев Валерий Аркадьевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Indication of microorganisms in purulent-necrotic lesions of the basics of the skin in the area of hooves in cows by PCR

A comparative analysis of microorganism content, found in cows with panaritium was carried out with Real Time PCR method. Experiment-clinical research was conducted on breed livestock farm of Ulyanovsk region, as for molecular biological research, it was carried out on the base of innovative enterprise LLC “Scientific research innovative centre of microbiology" of FSBEI HE Ulyanovsk SAA. Animals, selected for the experiment on the principle of identical pairs, were divided into 3 groups, each containing 10 head units at the age 4-6 years, with weight of 450-500 kg and with panaritium diagnosis. Molecular biological research was conducted before and at the end of treatment period. Sampling was carried out with the help of a special pin with cap made of hygroscopic material, the pin was used to smear the surface of nidus and then it was placed into sterile test tubes with normal saline solution. In order to diagnose necrobacillosis, research biological material was purulo-necrotic deposition, which was scraped with small curet from infected tissue up to non-infected tissue. “Package of reagents for DNA purification of biosamples"(Litech, Moscow) was used forDNA purification of hoof bio material, this method is based on bacterial cell lysis, DNA sorption on silica-gel and DNA washing with alcohol-salt buffer. Package for PCR-based diagnostics CEPTOSCREEN (Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp.) was used for the research as well as Package for PCR-based diagnostics NUCLEARPOL PB (Fusobacterium). The research results showed that there are the following microorganism associations: Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. in 30 samples (100%). After treatment there is a tendency of assay decrease: up to 7 (70%) in control group, up to 4 (40 %) in the 1s test group, 3 (30 %) in the second test group. Necrobacillosis agent was not found during the whole experiment period. Thus, experimental treatment in case of panaritium conduces to decrease of microbial content.

Текст научной работы на тему «Индикация микроорганизмов при гнойно-некротическом поражении основы кожи в области копытец у коров методом ПЦР»

УДК 619:617.57/58+636.22

DOI 10.18286/1816-4501-2016-4-135-139

ИНДИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ОСНОВЫ КОЖИ В ОБЛАСТИ КОПЫТЕЦ У КОРОВ МЕТОДОМ ПЦР

Марьин Евгений Михайлович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Хирургия, акушерство, фармакология и терапия»

Ермолаев Валерий Аркадьевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой «Хирургия, акушерство, фармакология и терапия»

ФБГОУ ВО Ульяновская ГСХА, 432017, г. Ульяновск, бульвар Венец, 1; тел.: (8422) 55-95-98; e-mail: [email protected], e-mail: [email protected]

Ключевые слова: коровы, микроорганизмы, ПЦР-диагностика, некробактериоз. В данной статье приведены результаты выделения микроорганизмов, у больных гнойным пододерматитом коров при использовании метода ПЦР. Для проведения ПЦР использовался комплект для ПЦР-диагностики СЕПТОСКРИН и НУКЛЕАПОЛ. В пробах раневого экссудата методом Rial-Time PCR выделены следующие микроорганизмы: Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. Возбудителя некробактери-оза в течение всего экспериментального периода не обнаружено.

Введение

Для увеличения количества продукции животноводства в настоящее время особое внимание уделяется вопросам интенсификации производства и выведению высокопродуктивных пород крупного рогатого скота. Как известно, высокопродуктивные коровы болеют намного чаще, это обусловлено выведением из организма с молоком большого количества питательных веществ и микроэлементов, что и влияет на снижение резистентности и реактивности организма [1].

Проведенный мониторинг и ортопедическая диспансеризация поголовья крупного рогатого скота показали, что за период проводимой работы на хирургические заболевания приходилось 45...57% от поголовья, а в некоторых хозяйствах - 57.75%, при этом на болезни дистального отдела конечностей приходилось 65.70% среди хирургических патологий [2, 3, 4, 5, 6].

При болезнях конечностей пораженный орган постоянно контактируется с почвой и другими объектами окружающей среды, и наличие небольших повреждений целостности кожного покрова приводит к обсеменению раны различной бактериальной флорой и возникновению воспалительного процесса [7].

Целью данной работы явился сравнительный анализ состава микроорганизмов, выделяемых у больных гнойным пододерматитом коров методом Rial -Time PCR. Объекты и методы исследований Экспериментально-клинические исследования проводили в племенном хозяйстве ООО ПСК «Красная Звезда» с. Большие Ключищи Ульяновского района Ульяновской области, а молекулярно-биологические исследования осуществляли на базе малого инновационного предприятия ООО «Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии» ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА.

Животных, подобранных для эксперимента, по принципу парных аналогов раздели на 3 группы - по 10 животных в каждой, возраст 4.6 лет, масса 450.500 кг, с диагнозом «гнойный пододерматит».

Животным первой группы (далее в работе - контрольная) - после хирургической обработки накладывалась стерильная салфетка с порошком Островского, после чего проводилось наложение бинтовой повязки, с последующей ее заменой через каждые 3 дня, до исчезновения гнойных выделений и образования крупнозернистой грануляции. Во второй фазе на стерильную салфетку наносили 3% тетрациклиновую мазь, вплоть

Рис. 1 - Гнойный пододерматит

до выздоровления животного. Лечение проводилось до полного клинического выздоровления животного.

Во второй группе (далее в работе первая опытная) - также после хирургической обработки накладывалась стерильная салфетка с опытным порошком, состоящим из природного сорбента - диатомита, сульфата цинка, стрептоцида и борной кислоты, далее накладывалась бинтовая повязка. Осмотр проводился через каждые 3 дня, после осмотра происходила смена повязок, после окончания фазы гидратации применялась мазь Левомеколь. Перевязки проводились до полного клинического выздоровления животного.

В третьей группе (далее в работе вторая опытная) - после хирургической обработки накладывалась стерильная салфетка с опытным порошком, состоящим из природного сорбента - диатомита, сульфата меди, перманганата калия и фурациллина, далее накладывалась бинтовая повязка. Осмотр проводился через каждые 3 дня, после осмотра происходила смена повязок, после окончания фазы гидратации применялась мазь Левомеколь. Перевязки проводились до полного клинического выздоровления животного.

Молекулярно-биологические исследования проводили до начала лечения и

в конце лечения. Отбор проб проводили при помощи специального стержня с наконечником из гигроскопичного материала, которым делали мазок с поверхности патологического очага и затем помещали в стерильные пробирки с физиологическим раствором.

Для диагностики некробактериоза биологическим материалом для исследований являлись гнойно-некротические наложения, которые соскабливали ложкой Фолькмана с пораженных тканей до здоровых слоев ткани. Отбор проб осуществляли согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике некробактериоза» [8].

Для выделения ДНК с отобранного с копытец биоматериала использовали «Комплект реагентов для выделения ДНК из биопроб» (Литех, г. Москва), в основе метода лежит лизис бактериальных клеток, сорбция ДНК на силикагеле и отмывка ДНК спиртово-солевым буфером. Для исследований использовался комплект для ПЦР-диагностики СЕПТОСКРИН (Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp.) и комплект для ПЦР-диагностики НУКЛЕАПОЛ - РВ (Fusobacterium).

Для проведения ПЦР использовали

13Т

Таблица 1

Исследование видового состава микроорганизмов у ортопедически больных коров

До лечения В конце лечения

Идентификатор пробирки 1 - опытная группа 2 - опытная группа Контрольная группа 1 - опытная группа 2 - опытная группа Контр гр ольная уппа

Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат Cp, Fam Результат

1 Strep - - - - - -

1 Staph - 36,2 + 35,4 + - - -

1 Enteroc 18,3 + 35,0 + 34,2 + - - -

1 Pseu aer - - 35,4 + 19,3 + - -

1 Serr - - - - - -

1 Prot - - - - - -

1 Ent, Kleb 14,5 + 36,1 + 36,4 + - - -

1 E.coli 36,2 + 35,7 + - - - -

2 Strep - - 29,3 + - - -

2 Staph - - 34,0 + - - 22,3 +

2 Enteroc - 26,5 + 22,1 + - - -

2 Pseu aer - - 29,8 + - - -

2 Serr - - - - - -

2 Prot 23,1 + - 34,0 + - - 20,1 +

2 Ent. Kleb - - - - - -

2 E.coli - 32,3 + 36,1 + - - -

3 Strep 26,1 + - 28,8 + - - -

3 Staph 23,1 + 28,5 + 34,5 + - - -

3 Enteroc 30,3 + 34,6 + 28,4 + 21,3 + - -

3 Pseu aer - 27,7 + 30,5 + - - -

3 Serr - - - - - -

3 Prot 31,1 + 34,5 + - - - -

3 Ent. Kleb - - 36,3 + - - -

3 E.coli 35,5 + 34,8 + 35,3 + - - -

4 Strep - - - - - -

4 Staph 28,4 + 26,9 + - - - 26,8 +

4 Enteroc - 28,3 + 17,8 + - - -

4 Pseu aer - - 25,8 + - - -

4 Serr - - - - - -

4 Prot - 27,8 + - - - -

4 Ent. Kleb - - - - - -

4 E.coli - - 31,2 + - - -

5 Strep 27,3 + - - - - -

5 Staph 34,1 + 34,8 + - 20,6 + - 17,7 +

5 Enteroc 22,5 + 19,0 + - - - 18,3 +

5 Pseu aer 34,6 + 32,2 + 19,7 + - - -

5 Serr - - - - - -

5 Prot 31,3 + 32,9 + 25,1 + - - -

5 Ent. Kleb - - - - - -

5 E.coli 32,7 + - - - 36,8 + 22,3 +

6 Strep - - - - - -

6 .Staph - - - - - -

6 Enteroc - 14,3 + 21,7 + - - -

6 Pseu aer - 13,3 + - - - -

6 Serr - - - - - -

6 Ent. Kleb 30,0 + - - - -

6 E.coli 24,1 + 15,8 + 24,9 + - - 24,6 +

6 Prot - - - - - -

7 Strep - - - - - -

7 Staph 33,8 + 29,3 + - - -

7 Enteroc - 21,2 + 22,3 + - - -

7 Pseu aer 26,7 + 32,7 + - - - -

7 Serr - - - - - -

7 Prot - - - - - -

7 Ent. Kleb - - - - - -

7 E.coli - - 23,7 + - 37,2 + 16,8 +

8 Strep 35,5 + 25,7 + - - - -

8 Staph - 24,5 + - - - -

8 Enteroc - 20,6 + - - - -

8 Pseu aer 33,7 + 28,4 + - - - -

8 Serr - - 18,4 + - - -

8 Prot - 33,7 + 25,3 + 20,8 + - -

8 Ent. Kleb - - 16,8 + - - -

8 E.coli - 36,6 + 21,4 + - - -

9 Strep 35,3 + 27,3 + - - - -

9 Staph - 28,0 + - - 36,8 + -

9 Enteroc - 25,7 + 17,5 + - - 19,3 +

9 Pseu aer - 24,5 + - - - -

9 Serr 34,6 + - - - - -

9 Prot - - 29,1 + - - 19,7 +

9 Ent. Kleb 34,8 + 36,6 + 17,3 + - - -

9 E.coli - 34,7 + - - - -

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

10 Strep 36,1 + - - - - -

10 Staph - 35,0 + 27,5 + - - -

10 Enteroc - 34,4 + - - - -

10 Pseu aer 19,1 + 33,7 + - - - -

10 Serr 29,6 + - - - - -

10 Prot - - 26,0 + - - 15,8 +

10 Ent. Kleb - - - - - -

10 E.coli 33,6 + 33,0 + 23,8 + - - -

К+ Strep 31,4 + 24,2 + 23,6 + 14,6 + 33,8 + 20,8 +

К+ Staph 23,5 + 23,8 + 21,2 + 20,9 + 34,8 + 26,5 +

К+ Enteroc 23,3 + 21,6 + 20,8 + 21,0 + 34,6 + 24,8 +

К+ Pseu aer 31,6 + 21,3 + 23,5 + 25,4 + 34,5 + 30,0 +

К+ Serr 22,9 + 23,8 + 23,7 + 24,0 + 36,7 + 29,8 +

К+ Prot 24,6 + 23,6 + 23,5 + 30,2 + 34,7 + 21,0 +

К+ Ent. Kleb 23,9 + 23,5 + 14,2 + 27,2 + 34,6 + 19,9 +

К+ E.coli 15,2 + 15,1 + 22,4 + 17,6 + 35,9 + 22,6 +

K- - - - - - -

детектирующий амплификатор ДТ-96 («ДНК-Технология», Москва). Постановку полиме-разной цепной реакции проводили в микропробирках емкостью 0,2 мл, использовали готовые реакционные смеси СЕПТОСКРИН и НУКЛЕАПОЛ - РВ, к которым добавляли по 10 мк ДНК-матрицы. Пробирки с готовой ПЦР-смесью встряхивали на смесителе, все капли со стенок осаждали центрифугированием в течение 5-10 сек.

Переносили пробы в амплификатор и проводили реакцию. Параллельно с исследуемыми образцами ставили отрицательный контрольный образец (с деионизиро-ванной водой). Учет результатов осуществляли отдельно по каждому из каналов, в соответствии с инструкцией к прибору. Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на соответствующем уровне (0,05) пороговой линией (treshhold) значения порогового цикла «СЪ>. Образец считали отрицательным, если значение «СЪ> по каналу Fam отсутствовало.

Результаты исследований

При исследовании видового состава микроорганизмов, выделяемых с гнойно-некротических очагов в области копытец, установлено (таблица 1), что в начале лечения в контрольной группе обнаружено Streptococcus spp. - в 2 пробах (20%), Staphylococcus aureus в 5 пробах (50%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 5 пробах (50%), Pseudomonas aeruginosa в 7 пробах (70%), Serratia spp. в 1 пробе (10%), Proteus spp. в 5 пробах (50%), Enterobacter spp., Klebsiella spp. в 4 пробах (40%), Escherichia coli в 7 пробах (70%).

Было идентифицировано 2 вида и 3 вида микроорганизмов у 3 животных соответственно. 4 вида и 6 видов микроорганизмов было обнаружено соответственно у 2 ортопедически больных коров.

п « "

В первой опытной группе до начала использования экспериментальной схемы лечения обнаружено Streptococcus spp. 6 пробах (60%), Staphylococcus aureus в 3 пробах (30%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 2 пробах (20%), Pseudomonas aeruginosa в 4 пробах (40%), Serratia spp. в 2 пробах (20%),

и

Sä es »1

Si

р Ü ш SS Hi ■ i

00 s!

Proteus spp. в 3 пробах (30%), Enterobacter spp., Klebsiella spp. в 3 пробах (30%), Escherichia coli в 5 пробах (50%).

У 3 животных идентифицирован 1 вид микроорганизмов, у 3 коров - 2 вида микроорганизмов, у 2 животных - 3 вида микроорганизмов и по 5 видов и 6 видов микроорганизмов выделено у одного животного соответственно.

Во второй опытной группе до начала лечения обнаружено Streptococcus spp. 2 пробах (20%), Staphylococcus aureus в 8 пробах (80%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 10 пробах (100%), Pseudomonas aeruginosa в 7 пробах (70%), Proteus spp. в 4 пробах (40%), Enterobacter spp., Klebsiella spp. в 2 пробах (20%), Escherichia coli в 7 пробах (70%). Serratia spp. не выявлены.

У 1 животного идентифицировано 2 вида микроорганизмов, у 3 животных - 3 вида микроорганизмов и 4 вида микроорганизмов соответственно. 5 видов микроорганизмов выделено у 1 коровы, больной гнойным пододерматитом, и 6 видов микроорганизмов у 2 животных.

В результате проведенного лечения в контрольной группе были выявлены Staphylococcus aureus в 3 пробах (30%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 2 пробах (20%), Proteus spp. в 3 пробах (30%), Escherichia coli в 3 пробах (30%). У 4 животных идентифицирован 1 вид микроорганизмов, у 2 животного 2 вида микроорганизмов и у 1 животного - 3 вида микроорганизмов.

п « "

В первой опытной группе после проведенной терапии гнойных пододерматитов были обнаружены: Staphylococcus aureus в 1 пробе (10%), Enterococcus faecalis и Е. faecium в 1 пробе (10%), Pseudomonas aeruginosa в 1 пробе (10%) и Proteus spp. в 1 пробе (10%). У 4 животных идентифицирован 1 вид микроорганизмов.

Во второй опытной группе в конце экспериментального лечения обнаружено Staphylococcus aureus в 1 пробе (10%) и Escherichia coli в 2 пробах (20%). У 3 животных опытных групп идентифицировано по 1 виду микроорганизмов.

Исследование проб на наличие бактерий рода Fusobacterium показало отсутствие

возбудителя некробактериоза у подопытных животных как до лечения, так и после.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что в 30 пробах, или 100%, отобранных с пораженных гнойно-некротических участков основы кожи копытец у всех подопытных больных коров до начала лечения, присутствуют следующие ассоциации микроорганизмов: Enterobacter spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis и Е. faecium, Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. После проведенного лечения отмечается снижение количества проб: в контрольной группе до 7, или 70%, в первой опытной группе до 4 проб, или 40% и во второй опытной группе до 3, или 30%. Возбудителя некробактериоза в течение всего экспериментального периода не обнаружено. Таким образом, использование экспериментального лечения при гнойных пододерматитах способствует снижению микробной обсеме-ненности.

Библиографический список

1. Лабкович, А.В. Клинико-гематологи-ческий статус коров с язвенными поражениями кожи в дистальном участке конечностей при применении комплексного лечения / А.В. Лабкович // Ученые записки УО ВГАВМ, т.52, вып.1, 2016. - С. 53-56.

2. Болдырев, Д.Н. Ортопедическая и акушерско-гинекологическая патология у коров в условиях привязного содержания / Д.Н. Болдырев, В.А. Толкачев, А.Н. Елисеев // В сборнике: Актуальные вопросы инно-

вационного развития агропромышленного комплекса материалы Международной научно-практической конференции, 2016. - С. 80-83.

3. Гимранов, В.В. Этиология, характер распространенности и особенности патологий в области пальцев у коров голшти-но-фризской породы / Гимранов В.В., Утеев Р.А., Гилязов А.Ф. // Аграрный вестник Урала. 2010. - № 3 (69). - С. 77-79.

4. Журба, В. А. Микробиоценоз гнойных пододерматитов у коров / В. А. Журба // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2014. - №4 - С. 110-113.

5. Марьин, Е. М. Болезни копытец у коров различных пород / Е. М. Марьин, В. А.Ермолаев. // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. -

2011. - №30/1 - том 2. - С. 104-105.

6. Стекольников А.А. Профилактика и лечение специфической язвы подошвы у крупного рогатого скота препаратами Т-HEXX / А.А. Стекольников, М.А. Ладанова // Современные проблемы ветеринарной хирургии: Международнаянаучно-практическая конференция, посвященная 90-летию кафедры общей, частной и оперативной хирургии УО ВГАВМ, Витебск, 3-4 ноября 2016 г. / УО ВГАВМ; ред. кол: А.И. Ятусевич (гл. ред.) [и др.]. - Витебск, 2016. - С. 116-119.

7. Макаев, Х.Н. Профилактическая эффективность различных средств и методов лечения некротических поражений копытец крупного рогатого скота / Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин, Р.М. Потехина, Н.А. Мухамметшин // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана,

2012. - Т. 209. - С.202-205.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.