CC BY
18
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^OHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHoi' MegnuUHH Ta 6i0TexH0iroriH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
doi: 10.15421/nvlvet7820
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 619:616.993.192.6-076.616-071.577.2.08.636.2.636.7
1ндикац1я та видова диференщащя найпроспших роду Babesia за методом
ПЛР у клщах, знятих з тварин
Ю.О. Мокрий1, IM. Ксьонз1, П.Ю. Грубч1, Р.О. Касала2, ОМ. Лисак2 nabor_2008@i.ua, igor.ksyonz@ukr.net, gruba@i.ua, olvetlab@gmail.com
Институт свинарства i агропромислового виробництва НААН, вул. Шведська Могила, 1, м. Полтава, 36013, Украгна;
2Клшка ветеринарног медицини «ОлВет», вул. Молодiжна, 55, м. 1вано-Франк1вськ, 76000, Украгна
У статтi наведено результати до^джень щодо тдикацп та видово1 диференщацп найпростших роду Babesia в ор-ганiзмi m^iß, знятих, з собак та великог рогатог худоби. Дiагностичнi до^дження здшснювались за допомогою мультиплексной ПЛР-тест системи власног розробки, що дозволяе визначати у будь-яких бiологiчних зразках наявтсть ДНК пред-ставниюв 6 видiв роду Babesia, а саме: B. canis, B. divergens, B. caballi, B. major, B. bigemina, B. bovis, три з яких - видоспе-цифiчно, за розмiром бендiв на електрофореграмах продуктiв амплiфiкацii. Означена тест-система мiстить 2 прямих i 3 зворотних праймери, що фланкують фрагменти ДНК гена, який кодуе 18S rRNA найпростшихроду Babesia.
До^дженню тдлягали rn^i, знятi з 17 собак рiзних порiд i статевовжового статусу та 12 голiв великог рогатог худоби. В результатi ДНК бабезш виявлено у 11 зразках, вШм з яких диференцшовано як Babesia canis, два - як Babesia bovis та один - як Babesia divergens. Виходячи з отриманих результатiв до тварин, в miщах знятих з яких виявляли бабезш, вироблялась та чи тша стратегiя л^вально-профтктичних заходiв.
Пропонований у статтi пiдхiд дозволяе визначати можливi ризики твазування бабезiями на самих раншх стадiях за-хворювання. Наявтсть чи вiдсутнiсть найпростших роду Babesia в органiзмi клiщiв, що живилися кров'ю тварин, дають можливiсть не проводити досить токсичш для оргатзму л^вальш заходи, або ж провести упереджувальну тератю задовго до появи клШчних ознак бабезiозу. Особливе значення це мае для вагтних самиць та особливо чутливих до бабезiо-зу порiд собак. Перспективою подальших до^джень е розроблення ПЛР-тест-систем для тдикацп i диференщацй тших miщових тфекцш та твазт.
KrnKoei слова: Babesia, клгщ1, собаки, велика рогата худоба, мультиплексна ПЛР-тест-система, тдикащя, диференщащя.
Индикация и видовая дифференциация простейших рода Babesia методом
ПЦР у клещей, снятых с животных
Ю.А. Мокрый1, И.Н. Ксёнз1, П.Ю. Грубич1, Р.О. Касала2, О.Н. Лысак2 nabor_2008@i.ua, igor.ksyonz@ukr.net, gruba@i.ua, olvetlab@gmail.com
1 Институт свиноводства и агропромышленного производства НААН, ул. Шведская Могила, 1, г. Полтава, 36013, Украина;
2Клиника ветеринарной медицины «ОлВет», ул. Молодежная, 55, г. Ивано-Франковск, 76000, Украина
В статье изложены результаты исследований по индикации и видовой дифференциации простейшыхрода Babesia в организме клещей, снятых с собак и крупного рогатого скота. Диагностические исследования осуществлялись с помощью
Citation:
Mokryi, Yu.O., Ksyonz, I.M., Grubich, P.Yu., Kasala, P.O., Lysak, O.M. (2017). Indication and species differentiation of the Babesia genus protozoa by means of the pcr method in ticks taken off animals. Scientific Messenger LNUVMB, 19(78), 99-103.
мультиплексной ПЦР-тест системы собственной разработки, позволяющей определять в любых биологических образцах наличие ДНК представителей 6 видов рода Babesia, а именно: B. canis, B. divergens, B. caballi, B. major, B. bigemina, B. bovis, три из которых - видоспецифически, по размеру бэндов на электрофореграммах продуктов амплификации. Данная тест-система содержит 2 прямых и 3 обратных праймера, фланкирующих фрагменты ДНК гена, кодирующего 18S rRNA простейших рода Babesia.
Исследованию подлежали клещи, снятые с 17 собак различных пород и половозрастного статуса и 12 голов крупного рогатого скота. В результате ДНК бабезий обнаружено в 11 образцах, восемь из которых дифференцированно как Babesia canis, два - как Babesia bovis и один - как Babesia divergens. Исходя из полученных результатов к животным, в клещах снятых из которых обнаруживали бабезий, применялась та или иная стратегия лечебно-профилактических мероприятий.
Предлагаемый в статье подход позволяет определять возможные риски инвазирования бабезиями на самых ранних стадиях заболевания. Наличие или отсутствие простейших рода Babesia в организме клещей, питающихся кровью животных, дают возможность не проводить достаточно токсичные для организма лечебные мероприятия или же провести упреждающую терапию задолго до появления клинических признаков бабезиоза. Особое значение это имеет для беременных самок и особенно чувствительных к бабезиозу пород собак. Перспективой дальнейших исследований является разработка ПЦР-тест-систем для индикации и дифференциации других клещевых инфекций и инвазий.
Ключевые слова: Babesia, клещи, собаки, крупный рогатый скот, мультиплексная ПЦР-тест-система, индикация, дифференциация.
Indication and species differentiation of the Babesia genus protozoa by means of
the pcr method in ticks taken off animals
Yu.O. Mokryi1, I.M. Ksyonz1, P.Yu. Grubich1, P.O. Kasala2, O.M. Lysak2 nabor_2008@i.ua, igor.ksyonz@ukr.net, gruba@i.ua, olvetlab@gmail.com
institute of Pig Breeding and Agroindustrial Production NAAS, Shvedska Mohyla Str., 1, Poltava, 36013, Ukraine; 2 Veterinary Medicine Clinic «OlVet», Molodizhna Str., 55, Ivano-Frankivsk, 76000, Ukraine
The article presents the study results on the indication and species differentiation of the Babesia genus protozoa in the organism of ticks taken off dogs and cattle. Diagnostic tests were performed using a multiplex PCR test system, being a self-engineering product, which allows to determine the DNA presence of 6 Babesia genus species in any biological samples, namely: B. canis, B. divergens, B. caballi, B. major, B Bigemina, B. bovis, three of them being species-specific, by the bands' size at the amplification products' electrophoregrams. The above test system contains 2 direct and 3 reverse primers flanking the DNA fragments of the gene encoding the 18S rRNA of the Babesia genus protozoa.
The subject of the study were ticks obtained from 17 dogs of different breeds and sex-age status and 12 units of livestock (cattle). As a result, the babesial DNA was detected in 11 samples, eight of which were differentiated as Babesia canis, two as Babesia bovis and one as Babesia divergens. Based on the results obtained, the animals, whose ticks, taken off them, had babesia detected, one or another strategy was developed for treatment and prophylaxis measures.
The approach suggested in the present article permits identifying the possible risks of babesia invasion at the earliest stages of the disease. Presence or absence of the Babesia genus protozoa in the body of sanguivorous ticks permits avoiding treatments rather toxic for the organism, or to carry out preventive therapy long before the babesiosis clinical symptoms' manifestation. It is vitally important for pregnantfemales and especially sensitive to babesiosis dog breeds.
The prospect offurther research is development of the PCR test systems for indicating and differentiating other tick-borne infections and invasions.
Key words: Babesia, ticks, dogs, cattle, multiplex PCR test system, indication, differentiation.
Вступ
Бабезюзи e групою сезонних трансмюивних захво-рювань ссавщв р1зних вид1в, що викликаеться най-простшими роду Babesia (Staykov, 2007). Ц збудники е одними з найбшьш поширених гемоспоридш ссавщв (Boustani and Gelfand, 1996). У ветеринарнш практищ бабезюзи тварин д1агностуються переважно за етюло-пчними чинниками (сезон, знаходження на твариш клща-переносника тощо), клшчними проявами та м1кроскошею мазшв, приготованих 1з перифершно! кров1 на предмет виявлення бабезш у еритроцитах (CLSI, 2000). Проте щ методи мають достатню досто-в1ршсть лише у випадках значного розвитку типових клшчних прояв1в захворювання - на раншх стад1ях або за атипового переб1гу швазп вони е малоефектив-ними. З врахуванням же важких наслщшв при вже
розвиненому патолопчному процеа та досить високо! токсичносп х1мютерапевтичних препарапв проблема ранньо!, високочутливо! та специф1чно! д1агностики е актуальною. Нараз1 до таких метод1в слад ввднести молекулярно-генетичш, зокрема пол1меразну ланцю-гову реакцш (ПЛР) (Morozov, 2010).
У зв'язку з цим нами була поставлена мета апро-бувати можливють виявлення найпростших роду Babesia в оргашзм1, знятих з тварин клщ1в за допомо-гою мультиплексно! ПЛР-тест-системи власно! розро-бки.
MaTepia™ i методи дослвджень
Дослвдження проводились в умовах лабораторп генетики 1нституту свинарства та агропромислового виробництва НААН та ПЛР-лабораторп клшши вете-
ринарно! медицини «ОлВет» м. 1вано-Франшвська.
Матерiалом для дослвджень слугували зразки ДНК, видшет i3 21 клiща, знятого i3 17 собак та 8 Ki^iB - з 8 голiв велико! рогато! худоби. Для цього клiщiв, що живились кров'ю одше! тварини, розтира-ли у фарфоровш ступцi з додаванням стерильного фiзiологiчного розчину NaCl з подальшим освгтлен-ням отримано! суспензй' на центрифузi при 3000 об/хв впродовж 30 с. Супернатант суспензй використовува-ли для видшення ДНК за допомогою комерцшно доступного комплекту реагенпв «ПРОБА-РАПИД» ви-робництва ООО «НПО ДНК Технология» (Россия). Ступки й товкачики тсля зашнчення роботи ретельно ввдмивали й обробляли препаратом «Chelex-100».
Iндикацiю та диференцiацiю бабезiй здшснювали за допомогою мультиплексно! ПЛР-тест-системи власно! розробки (Mokryi et al., 2017). Означена ПЛР-тест-система мiстить синтезоваш на наше замовлення у фiрмi «Thermo Electron Corporation» (Germany) два прямих (BCANF: 5'- GTGACC-
CAAACCCTCACCAGA -3'; BSPF: 5'-
CCATTGGAGGGCAAGTCTGGT -3') i три зворотних (BDIVR: 5'- TCCCAAAAGCGAAGTGCAATCTCG -3'; BBOVR: 5'- CCAAAGTCAACCAACGGTACGACA -3'; BSPR: 5'- ACGAATGCCCCCAACCGTT -3') олк-о-нуклеотидних праймери, що фланкують фрагменти гена 18S рРНК найпростших роду Babesia, а також реагенти для ПЛР виробництва фiрми «Fermentas UAB» (Lithuania).
Параметри реакцшно! сумiшi становили: 2,5 мкл 10-кратного буферу (670 мМ Трiс-HCI, pH 8,8 за тем-ператури 25 °С, 20 мМ БСА, 166 мМ амонш арчано-кислого (NH4)2SO4, 100 мМ 2-ß-меркаптоетанол) («Fermentas UAB», Lithuania), 2,5 мкл 2,5 mM dNTP(«Fermentas UAB», Lithuania), 2 мкл 50 mM MgCl2 («Fermentas UAB», Lithuania), 2-3 од. Taq-пол1мерази (Thermus aquaticus) («Fermentas UAB», Lithuania), 0,5 мкл (0,1 опт. один.) кожного з п'яти праймерiв та зразок дослвджувано! ДНК - до шнцево! концентраций в сушш. 1 мкг/см3, деюшзовановано! води до об'ему 25 мкл. На амшлфжацшну сумiш на-шаровували 25 мкл мiнерально! оли. Параметри амп-лiфiкацi!' становили: перший цикл - 93 °С впродовж 60 с, наступш 35 циклiв - 93 °С, 60 °С та 72 °С по 30 с кожний та останнй 37 цикл - 72 °С впродовж 60 с.
Пол1меразну ланцюгову реакцш проводили в по-лiпропiленових мiкроцентрифужних пробiрках об'емом 0,6 см3 на термоциклерi «Biometra TRIO-Thermobloсk» (Germany) в 25 мкл ПЛР-сумшг
Фракцiювання продукпв амплiфiкацi! здiйснювали методом горизонтального електрофорезу у 2,0% ага-розному re!i в електрофоретичнiй камерi «Cleaver Scientific Ltd.» (UK) iз вiзуальною оцшкою на УФ-трансiлюмiнаторi виробництва НВО «Прогрес» (Укра!на), пiсля фарбування бромистим етидiем.
Продуктами ПЛР виступають фрагменти гена 18S рРНК представник1в роду Babesia, що мають розмiри ввд 268 до 298 пар нуклеотидiв, консервативний для бабезш шести видiв (B. canis, B. caballi, B. divergens, B. major, B. bigemina та B. bovis), яш е патогенними для собак, коней, худоби та людей, а також фрагменти
розм1рами 325, 233 та 146 пар нуклеотид1в, специф1ч-Hi для трьох вид1в бабезш (B. canis, B. bovis, B. divergens) (Mokryi et al., 2017).
Як позитивш контролi використовували зразок ДНК B. Canis, видшений i3 периферiйноï кровi собаки та зразок ДНК B. Bovis, видшений i3 периферiйноï кровi телицi, що хворiли на бабезюз. Негативним контролем виступала стерильна деюшзована вода. Як маркер розмiру ДНК використовували pUC19/MspI («Fermentas UAB», Lithuania).
Результата та ïx обговорення
Мультиплексна ПЛР-тест-система створювалась не стшьки як альтернативний мiкроскопiчному методу дiагностики бабезiйних iнвазiй, а як метод, що дозволяе не лише виявляти ДНК бабезiй у будь-якому бюлопчному матерiалi, а й проводити ïx видову ди-ференцiацiю. В процеа ж практичного застосування означеного дiагностика визначилась ще одна його суттева перевага, а саме можливiсть щдикацд ДНК бабезiй в кл1щах, що практично неможливо у будь-який iнший доступний спосiб лабораторноï дiагности-ки. Перевага полягае в тому, що наявшсть чи вадсут-шсть найпростiшиx роду Babesia в органiзмi клiща дозволяе оцiнити ризики зараження ними тварин на доклiнiчнiй стадп. Ввд результатiв досл1джень iснуе пряма залежшсть щодо вироблення стратегiï лшуван-ня.
Дослвдженню пвдлягав 21 клщ, знятий iз 17 собак. При цьому по одному клiщу було знято з 14 собак, по 2 ^r^i з трьох i 3 ^r^i з двох тварин, зокрема: клщ знятий з пса породи шмецька вiвчарка (м. Полтава) (1); клщ знятий з цуценяти породи лабрадор (м. Полтава) (2); ^r^i (два), знятi з вагггшн суки породи росiйський спашель (м. Полтава) (3); клiщ, знятий з пса породи середньоазшська вiвчарка (м. Полтава) (4); клщ, знятий з суки породи шмецька вiвчарка (м. Полтава) (5); клад (два), знят з пса породи ротвейлер (м. Полтава) (6); клщ, знятий з суки породи хасш (м. 1вано-Франшвськ) (7); ^r^i (три), зняп з пса породи iрландський сеттер (м. 1вано-Франшвськ) (8); клiщ, знятий з пса породи алясшнсь-кий маламут (м. 1вано-Франшвськ) (9); клiщ, знятий з вагiтноï суки породи англiйський кокер-спашель (м. 1вано-Франк1вськ) (10); кл1щ, знятий з пса породи кавказька вiвчарка (м. 1вано-Франшвськ) (11); клiщ знятий, з пса породи лабрадор (м. 1вано-Франшвськ) (12); клщ, знятий з суки породи стафордширський тер'ер (м. 1вано-Франшвськ) (13); клщ, знятий з цуценяти породи шмецька вiвчарка (м. 1вано-Франшвськ) (14); ^r^i (два), знятi з вагiтноï суки породи кавказька вiвчарка (м. 1вано-Франшвськ) (15); клiщi (три), знятi з пса породи чау-чау (м. 1вано-Франшвськ) (16); кл1щ, знятий з суки поди хасш (м. 1вано-Франшвськ) (17). Уа клiщi були вдентифшо-ванi як представники роду Dermacentor. Ктщ, знятi з кожно" собаки, розтирали в окремiй xiмiчно чистш фарфоровiй ступцi зi стерильним фiзiологiчним роз-чином. З отримано1' суспензй' видели ДНК i проводили ПЛР з детекщею продуктiв амплiфiкацiï в агаро-зному гелi (рис. 1).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 + - М
325 п.н / \
N У
298 п.н.
Рис. 1. Електрофореграма ПЛР-продуктiв 17 зразшв бiологiчного матерiалу вiд к. liiniii, знятих з собак, дослiджених за допомогою мультиплексно'1 ПЛР-тест-системи для шдикаци та видовоТ диференщаци найпростiших роду Babesia. Доргжки: 1, 3, 6, 9-10, 12, 15 - смуги розм1ром 325 п.н. (B. canis) та 298 п.н. (рвд Babesia)', 2, 4-5, 7-8, 11, 13-14, 16-17 - негативний результат; «+» - позитивний контроль; «-» - негативний контроль; М - маркер розм1ру ДНК pUC19/MspI («Fermentas UAB», Lithuania).
Дослщженню також тдлягало 12 клщ1в, знятих i3 12 голiв велико! рогато! худоби, зокрема: клщ, знятий з корови ДП «ДГ iм. 9 сiчня» Хорольського р-ну Пол-тавсько! обл. (1); R^^i знятi з телицi (2) та корови (3) приватних власнишв с. Лючки Коавського р-ну 1ва-но-Франшвсько! обл.; клiщi, знятi з корiв приватних власник1в с. Коростовичi Галицького р-ну 1вано-Франшвсько! обл. (4, 5); клщ, знятий з корови приватного власника с. Медуха Галицького р-ну 1вано-Франшвсько! обл. (6); клщ, знятий з корови приватного власника с. Гришвщ Тлумацького р-ну 1вано-Франк1всько! обл. (7); клщ, знятий з теляти приватного власника с. Колшщ Тлумацького р-ну 1вано-
Франшвсько! обл. (8); клщ^ знятi з корiв приватного власника с. Тучапи Снятинського р-ну 1вано-Франкiвсько! обл. (9, 10); клщ^ знятi з теляти (11) та корови (12) приватних власнишв с. Кодобна Калусь-кого р-ну 1вано-Франк1всько! обл. Клщ^ зняп з велико! рогато! худоби, також були iдентифiкованi як представники роду Dermacentor.
Клiщi, знятi з кожно! тварини, як i зняп з собак, розтирали в ступщ зi стерильним фiзiологiчним роз-чином. З отримано! суспензi! видiляли ДНК i проводили ПЛР з детекщею продуктiв амплiфiкацi! в агаро-зному гелi (рис. 2).
1 234 56 7 89 10 11 12 + - М
298 п.н.
325 п.н.
233 п.н.
146 п.н.
Рис. 2. Електрофореграма ПЛР-продукив 12 зразкчв бiологiчного матерiалу в1д к. liiniii, знятих з великоТ рогатоТ худоби, дослiджених за допомогою мультиплексно'1 ПЛР-тест-системи для шдикацп та видовоТ диференщаци найпростiших роду Babesia. Дорiжки: 2, 5, 8, 10 - смуги розмiром 298 п.н. (рвд Babesia); 2, 10 - смуги розмiром 233 п.н. (B. bovis); 5 - смуга розмiром 146 п.н. (B. divergens); 8 - смуга розмiром 325 п.н. (B. canis); 1, 3-4, 6-7, 9, 11-12 - негативний результат; «+» - позитивний контроль (смуги розмiром 298 п.н. (рщ Babesia) та 233 п.н. (B. bovis)); «-» - негативний контроль; М - маркер розмiру ДНКpUC19/MspI
(«Fermentas UAB», Lithuania).
Дослщження проводились у кожному випадку безпосередньо тсля зняття кл1щ1в з тварин, а попм було продубльовано уа 17 зразк1в кл1щ1в, знятих з собак, та 12 - знятих з худоби, у трьох повторах. Результата були аналопчними.
Як видно з електрофореграм, результати досль джень 29 вищезазначених бюлопчних зразк1в при застосуванш мультиплексно! ПЛР-тест-систем демон-струють И адекватшсть.
Результати дослвджень кл1щ1в, знятих з собак, було використано для розроблення стратеги лшування у кожному випадку. Десять тварин, у клщах знятих з яких не було виявлено ДНК бабезш, не тдлягали будь-яким лшувальним заходам. Стосовно тварин, у клщах знятих з яких було виявлено ДНК Babesia canis, вироблялась стратепя р1зна стратепя.
Зокрема за псами порвд шмецька в1вчарка (1), ротвейлер (6) та лабрадор (12), а також валтних сук порвд росшський спашель (3), англшський кокер-спашель (10) та кавказька в1вчарка (м. 1вано-Франшвськ) (15) проводилось клшчне спостереження з перюдичним ввдбором периферично! кров1 з вушно! вени для вияв-лення бабезш, метою якого було надання ветеринар-но! допомоги на раншх етапах паразитемп. При цьому бабезп в еритроцитах було виявлено на четверту добу в кров1 пса породи ротвейлер (6) та на шосту добу в кров1 суки породи росшський спашель (3). У шших собак шваз1я була ввдсутня.
Пса породи маламут (9) було пвддано упереджува-льнш терапи, оск1льки собаки ще! породи е надзви-чайно чутливими до бабезюзу i лщувальт заходи, зазвичай е ефективними лише на найбыльш раннiй стадй' захворювання.
Стосовно велико! рогато! худоби, у клщах знятих з яких було виявлено ДНК Babesia bovis та Babesia divergens (2, 5, 10), то !х власникам було рекомендовано звернутись до мюцевих фахiвцiв ветеринарно! медицини при виникненш перших ознак бабезюзу. Стосовно ж теляти, у ^i^i знятому з яко! було виявлено ДНК Babesia canis, така рекомендац!я не надава-лась, оскшьки цей збудник не е швазивним для худо-би.
Висновки
Розроблена мультиплексна ПЛР-тест-система, до складу яко! входять 2 прямi та 3 зворотш олйонукле-отиднi праймери, що фланкують рiзнi за розмiром
фрагменти ДНК гена, який кодуе 18S rRNA найпрос-тiших роду Babesia, дае можливють виявляти ДНК та диференцшвати видову належнiсть бабезiй у будь-якому бiологiчному матерiалi, зокрема в суспензiях, приготованих з клiщiв роду Dermacentor, знятих з собак.
Можливють виявлення ДНК найпроспших роду Babesia в органiзмi клiщiв, знятих з тварин, дозволяе прийняти рiшення щодо необхiдностi проведення лiкувальних заходiв до прояву клiнiчних ознак бабезь озу.
Перспективою подальших до^джень е розроблення ПЛР-тест-систем для шдикацп i диференщаци шших клщових шфекцш та швазш (борелiоз, туля-ремiя, ржетсюзи тощо).
Бiблiографiчнi посилання
Boustani, M.R., Gelfand, J.A. (1996) «Babesiosis». Clinical Infectious Diseases, 22(4), 611-615. doi: 10.1093/clinids/22.4.611. CLSI (2000) Laboratory Diagnosis of Blood-borne Parasitic Diseases; Approved Guideline. CLSI document M15-A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. ISBN 1562384015. Mokryi, Yu.O., Ksyonz, I.M., Pochernyayev, K.F., Kur-man, A.F. (2017) «Indication and species differentiation of the babesia protozoan genus by the polymerase chain reaction». Veterinary medicsine, biotechnology and biosafety. 3(1), 5-11. Morozov, Y.N. (2010) «Perspektivy primeneniya metodov molekulyarnoy parazitologii v monitoringe za sotsial'no-znachimymi parazitozami». Molekulyarnaya diagnostika. sb. tr. VII Vseros. nauchno-prakt. konferentsii s mezhdunar. uchastiyem. 2, 304-307 (in Russian). Staykov V.V. (2007). Babezioz. Veterinariya sel'skokhozyaystvennykh zhivotnykh. 7, 23-25 (in Russian).
Received 25.09.2017 Received in revised form 10.10.2017 Accepted 16.10.2017
