CC BY
80
УДК 619:579
ИНДИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CITOBACTER С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА (РНФ)
Пульчеровская Лидия Петровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Золотухин Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
432017, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Email: [email protected]
Ключевые слова: диагностика, бактериофаги, бактерии рода Citrobacter, реакция нарастания титра фага (РНФ), патологический материал, объекты внешней среды.
В статье рассмотрены вопросы индикации бактерии рода Citrobacter в объектах внешней среды с помощью реакции нарастания титра фага. Указаны свойства специфических бактериофагов, возможность использования биопрепарата на их основе для индикации указанных микроорганизмов без необходимости выделения чистой культуры.
Несмотря на сравнительно большой срок существования в качестве отдельной систематической группы, относительно экологии о цитробактерах известно не очень много, что объясняется длительным отсутствием набора дифференцирующих тестов. Очевидно, бактерии широко распространены в окружающей среде, так как их обнаруживают в самых разнообразных пищевых продуктах, воде, почве различных стоках. Цитробактеры также выделяют из кишечника и мочевыводящих путей человека, лошадей, крупного рогатого скота, собак, грызунов, птиц, рептилий и насекомых [13-18]. Всё большее значение цитробактеры приобретают в качестве патогенов различных морских, а также тропических аквариумных рыб [19]. Парентеральное введение бактерий мышам, морским свинкам или кроликам приводит к развитию абсцессов.
Столь широкому распространению, очевидно, способствует устойчивость ци-тробактеров во внешней среде. В почве бактерии сохраняются более 6 мес, в навозе — до 11 мес, в воде — до 10 мес. Они хорошо переносят замораживание; при 60 °С погибают в течение 30 мин, при 100 «С — моментально; при использовании дезинфектантов (1-2% раствор хлорамина, 2,5%
раствор формалина, 5% раствор карболовой кислоты) — через 15 мин.
В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых цитро-бактерами, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятым тестам. Этот метод трудоемок, недостаточно чувствителен и требует затрат времени, питательных сред и реактивов. Поэтому перед исследователями стояла задача изыскания более простого и доступного для любых лабораторий метода индикации и идентификации названных микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды с использованием реакции нарастания титра фага РНФ.
Целью наших исследований явилось изучение возможности применения реакции нарастания титра фага (РНФ) при обнаружении бактерий рода СИгоЬасЬвг в патологическом материале и объектах ветеринарного надзора с помощью индикаторных бактериофагов: С66 УГСХА, С61 УГСХА, С52 УГСХА. Для этого мы провели исследования по индикации цитробактеров в искусственно контаминированных ими фекальных массах и мясе.
Материалы и методы.
Обнаружение бактерий рода
СИгоЬа^вг в исследуемых объектах проводили с помощью реакции нарастания титра фага. Реакцию нарастания титра фага ставили по методике В.Д. Тимакова и Д.М. Голь-дфарба (1962), В.Я. Ганюшкина (1988), С.Н. Золотухина (1994).
В опытах использовали индикаторные бактериофаги: С66 УГСХА (Титр фага 3х109 фаговых корпускул в 1 миллилитре. Размер негативных колоний 3,0-8,0 мм.), С61 УГСХА (Титр фага 4х109 фаговых корпускул в 1 миллилитре. Размер негативных колоний 0,5-1,0 мм.), С52 УГСХА (Титр фага 3х109 фаговых корпускул в 1 миллилитре. Размер негативных колоний 2,0-3,0 мм.) представляют собой специфические вирулентные фаги с широким спектром литического действия на штаммы бактерий рода СИгоЬасЬвг. Фаги не лизируют бактерии гетерологичных семейств и родов. Препараты бактериофагов представляли собой прозрачные светложелтого и желтого цвета лизаты патогенных штаммов. Пригодны для применения в течение одного года со дня изготовления при хранении в условиях температуры 2-4°С. [1,5]. Индикаторные культуры бактерий рода СИгоЬасЬвг, выращенные на скошенном МПА. В качестве объектов для исследования использовали искусственно конта-минированные бактериями рода СИгоЬасЬвг фекалии и мясо. Также при выполнении исследований использовали мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА),
0,04% спиртовый раствор генцианвиолета, физиологический раствор.
Индикация бактерий рода СИгоЬасЬвг в искусственно контаминированных фекальных массах с помощью РНФ.
Пробу фекалий весом 10-20 г вносили в две стерильные колбы объемом 100 мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. В опытные колбы вносили индикаторные культуры бактерий рода СИгоЬасЬвг в количестве от 101 до 104 м.к.
Содержимое колб встряхивали в шут-тель-аппарате, с последующим отстаиванием взвеси в течение 10 минут. Приготавливали для опытной и контрольной проб 6 широких пробирок (диаметр 20 мм) и нумеровали их (1, 2, 3 и соответственно 1к, 2к и
3к). В пробирки № 1, 2 и 1к, 2к вносили по 9 мл исследуемой взвеси фекалий, в пробирки № 3 и 3к-9 мл стерильного МПБ. Затем в пробирки №1, 3 и 1к и 3к добавляли 1 мл индикаторного фага в рабочем разведении, а в пробирки №2 и 2к вносили 1 мл МПБ (контроль на присутствие свободного фага).
Рабочее разведение фага содержало 1х104 корпускул в 1 мл. При титре фага, равном 2х108 частиц в 1 мл, фаг разводили 1:10000, при титре фага, равном 3-5х109 частиц в 1 мл - 1:100000.
Пробирки №1 и 1к, в которых находились взвеси фекалий и индикаторный фаг, являлись опытными. Пробирки №2 и 2к -без фага являлись контролем для выявления в пробах фекалий свободного фага. Пробирки №3 и 3к - контроль на титр индикаторного фага. Все три пробирки выдерживали в течение 16 часов при температуре 37°С. Допустимо исследование пробы после 5 часов инкубации. [3,4]
После культивирования при температуре 37°С содержимое каждой пробирки разводили бульоном (рН 7,4-7,6) так, чтобы при высеве 1 мл содержимого из пробирки №3 и 3к (контроль на титр фага) на чашках образовалось несколько десятков негативных колоний (зон лизиса) фага. В пробирке № 3 и 3к индикаторный фаг находился в концентрации нескольких тысяч корпускул в 1 мл. Для того чтобы получить в конечном разведении несколько десятков корпускул в 1 мл, содержимое пробирки № 3 разводили в 20 раз, т. е. 0,25 мл исследуемой смеси внести в 4,5 мл бульона. Содержимое опытных пробирок № 1, 1к и №2, 2к разводили аналогично.
Инактивацию микрофлоры разведенных смесей пробирок №1 и 1к, № 2 и 2к, №3 и 3к проводили путем прогревания в водяной бане при температуре 60°С в течение 30 минут. После этого содержимое пробирок исследовали на определение числа корпускул бактериофага методом агаровых слоев. [1,2]
Исследование методом агаровых слоев.
Использовали МПА, содержащий
1,5%-0,7% агара. Допустимо вместо 1,5%
Результаты РНФ с фагом 1
Объект исследования Контроль индика- торного фага Контроль свободного фага Опыт Увеличение (раз)
Количество негативных колоний фага
Интактные фекалии 8 - 13 1,6
Контаминированные фекалии в дозе: (м.к. в 1 г) 104 8 - Полный лизис
103 8 - Сливной рост
102 8 - 62 7,7
101 8 - 7 -
Интактное мясо 8 - 8 -
Контаминированное мясо в дозе (м.к. в 1г): 104 8 - Полный лизис
103 8 - Полный лизис
102 8 - Полный лизис
101 8 - 102 13,5
МПА использовать агар на рыбном гидролизате. Мясопептонный агар разливали в чашки по 25-30 мл.
Для подавления роста воздушной микрофлоры перед разливом добавляли к расплавленному агару 0,04%-ный спиртовой раствор генцианвиолета (0,1 мл на каждые 100 мл МПА). Чашки подсушивали в боксе или термостате в течение 3 часов.
Индикаторные культуры бактерий рода СйгоЬа^ег выращивали на скошенном МПА в течение 16 часов и смывали физиологическим раствором (в количестве 10 мл). [3,7]
МПА с 0,7%-ным содержанием агара заготавливали заранее в пробирках по 2,5 мл, расплавляли, охлаждали до температуры 46-48°С и помещали в водяную баню с такой же температурой. В пробирку добавляли 0,1 смыва эталонной культуры, 1 мл разведенной и прогретой исследуемой смеси, перемешивали и выливали вторым
слоем на чашки с 1,5%-ным МПА. Для определения количества корпускул фага в опытной пробе и в контроле титра(пробирки 1 и 3) использовали по две чашки, для пробы на свободный фаг (пробирка 2) -одну чашку. При проведении нескольких анализов ставили один контроль. Через 20-30 минут после застывания верхнего слоя агара чашки помещали в термостат на 16 часов.
Индикация бактерий рода Citrobacter в искусственно контаминиро-ванном мясе с помощью РНФ.
Две пробы мяса по 5 г измельчали в стерильной фарфоровой ступке и помещали в две стерильные колбы объемом 100 мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. В опытные колбы вносили индикаторные культуры бактерий рода СіїгоЬаС:ег в количестве от 101 до 104 м.к.
Дальнейшее исследования материала проводили по той же методике, что и с фекалиями.
Результаты исследований.
По данным В.Д. Тимакова и Д.М. Голь-дфарба (1962), известно, что при обнаружении бактерий в РНФ считается отрицательным, если увеличение количества фага в опытной пробе по сравнению с контрольной составляет до 3 раз. Увеличение количества фага от 3 до 5 увеличивается как слабо положительная реакция, от 5 до 10 раз - положительная.
В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул фага на чашке подсчитывали и вычитали из числа корпускул индикаторного фага в опытных чашках. Разницу сравнивали с контролем. При высоком титре свободного фага (сплошной лизис индикаторной культуры) реакция
не учитывалась. РНФ, оцененная как сомнительная, не имела диагностического значения. [9,10,11,12]
Результаты реакции отражены в таблице 1, 2 и 3, их учитывали через 18 часов инкубирования посевов в термостате при 37°С путем подсчета негативных колоний фага в опытных и контрольных чашках.
Таким образом, доказано, что: Разработанная нами схема постановки РНФ с фагами бактерий С'^гоЬа^ег является высокоспецифичной и обладает достаточной чувствительностью для обнаружения указанных микроорганизмов при их концентрации от 10 и более м.к. в 1 грамме исследуемого материала. Количество негативных колоний фагов при этом повышается в 7,7 и более раз.
Используя «реакцию нарастания титра фага» с фагами, полученными авторами, можно провести индикацию бактериальных культур СИгоЬасЬвг в объектах внешней среды, патологическом материале и пищевом сырье без выделения чистой
Результаты РНФ с фагом 3
Результаты РНФ с фагом 2
Объект исследования Контроль индикаторного фага Контроль свободного фага Опыт Увели- чение (раз)
Количество негативных колоний фага
Интактные фекалии 4 - 6 1,5
Контами-нирован-ные фекалии в дозе: (м.к. в 1 г) 104 4 - Пол- ный лизис
103 4 - 61 15,2
О тН 4 - 9 2,2
101 4 - 5 2,1
Интактное мясо 7 - 8 1,1
Контами-нирован-ное мясо 104 7 - Слив- ной рост
103 7 - 15 2
102 7 - 2 -
101 7 - 1 -
Таблица 3
Объект исследования Контроль индикаторного фага Контроль свободного фага Опыт Увеличение (раз)
Количество негативных колоний фага
Интактные фекалии 12 - 14 1,1
Контаминированные фекалии в дозе: (м.к. в 1 г) 104 12 Полный лизис
103 12 - 95 7,9
102 12 - 19 1,5
101 12 - 12 -
Интактное мясо 17 - 18 1,1
Контаминированное мясо в дозе (м.к. в 1 г): 104 17 Полный лизис
103 17 - 1300 76
О тН 17 - 16 -
101 17 - 12 -
культуры в течение 16-18 часов.[1,2,6,8]
Библиографический список
1. С.Н.Золотухин, Пульчеровская Л.П., Д.А.Васильев, Л.С.Каврук «Методические рекомендации по индикации и идентификации энтеробактерий рода СИгоЬасЬвг в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов» Утверждены Отделом ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года. ВНИИВСГиЭ, Москва, 2005 г.
2. Адамс М. Бактериофаги. - Москва, 1961. - с. 15-44.
3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. // -М.: Медгиз. -1961. -297С.
4. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии.. -Ульяновск, 1988. - с. 45-49.
5. Колпикова Т.И., Бакулов И.А., Котля-ров В.М. Фаготипирование листерий // Ветеринария. - 1990. - №6. - С.31-32.
6. Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов СИгоЬасЬвг и их применение в диагностике
7. Золотухин С.Н. Бактериофаги М.тогдапИ и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят // Автореферат дис. Канд. вет. наук. - Ульяновск, 1994.
8. Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. «Выделение и селекция бактериофагов рода Citrobacter». «Вестник ветеринарии». Выпуск V. Сборник научных работ. Оренбург, 2002 г. С. 85-88.
9. Тимаков В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ)/В.Д.Тимаков, Д.М.Гольдфарб. -М., Мир, 1962, с.68-71.
10. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Escherichia coli и их применение в диагностике // Автореферат дис. канд. вет. наук. - Саратов, 2004.
11. Феоктистова Н.А. // Автореферат дис. канд. вет. наук. - Саратов, 2004.
12. Ляшенко Е. // Автореферат дис. канд. вет. наук. - Саратов, 2004.
13. J. Sedlak // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1973. - Vol. 62. -P. 41-59.
14. Z. Filipkowska // Acta Microbiol. Pol. -
2003. - Vol. 52. - P. 57-66.
15. C.S.W. Kueh, P. Kuratsky, M. Brunton //J. Appl. Bacteriol. - 1992. -Vol. 73. - P. 412420.
16. S. Okada, DM. Gordon // Mol. Ecol. -2001. - Vol. 10. -P. 2499-2513.
17. E.J. Goldstein [et al.] //J. Clin. Microbiol. - 1981. - Vol. 13. -P. 954-956.
18. N. Chaichanawongsaroj [et al.] // Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. -
2004. - Vol. 35. - P. 681-684.
19. A.E. Toranzo [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - Vol. 60. - P. 1789-1797
УДК 619:611
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОРФОГЕНЕЗ НЕЙРОЦИТОВ КРАНИАЛЬНОГО ШЕЙНОГО И ЗВЕЗДЧАТОГО ГАНГЛИЕВ СОБАКИ
Хохлова Светлана Николаевна, кандидат биологических наук, доцент Симанова Надежда Германовна, кандидат биологических наук, доцент Степочкин Александр Алексеевич, кандидат ветеринарных наук, доцент Фасахутдинова Алсиня Набиуловна, кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1 Тел.:8(8422)55-95-31
Ключевые слова: краниальный шейный и шейно-грудной ганглии, симпатический отдел нервной системы, нейроциты, ядерно-нейроплазменное отношение.
