CC BY-ND
62
МАЙ №5 (2И)
41
г-Ь
УДК: 579.843.1:575.25:612.017.4:002.5/6
INDEL- И VNTR-ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE, ВЫДЕЛЕННЫХ В 2013 ГОДУ ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, И.П. Олейников, Б.Н. Мишанькин, В.Д. Кругликов, И.В. Архангельская, Д.А. Зубкова, М.И. Ежова
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, Россия
Представлены результаты разработки метода генотипирования штаммов Vibrio cholerae на основе определения «делеций-вставок» (INDEL-маркеров). Для генотипирования штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды, использовали комбинацию INDEL-типирования с мультилокусным анализом вариабельных тандемных повторов (MLVA) по пяти VNTR-локусам. MLVA- и INDEL-типирование позволили разделить все штаммы на 31 генотип. По результатам кластерного анализа все генотипы распределились между девяти различными кластерами. Для большинства кластеров была выявлена четкая географическая привязаность к определенным регионам. Ключевые слова: Vibrio cholerae; холера; VNTR-, MLVA-, INDEL-, генотипирование.
A.S. Vodopyanov, S.O. Vodopyanov, I.P. Oleynikov, B.N. Mishan'kin, V.D. Kruglikov, I.V. Arkhangelskaya, D.A. Zubkova, M.I. Yezhova □ INDEL- И VNTR- TYPING VIBRIO CHOLERAE STRAINS, ISOLATED IN 2013 FROM THE ENVIRONMENT OBJECTS IN THE RUSSIAN FEDERATION □ FSHE «Rostov-on-Don Anti-Plague Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Rostov-on-Don, Russia.
The aim of this work was to develop effective typing method of Vibrio cholerae strains, based on insertion-deletion markers (INDEL). We combined analysis of INDEL-markers with multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) for 5 VNTR-loci for genotyping of Vibrio cholerae strains isolated in 2013 from environmental sources. MLVA- and INDEL-typing allowed to group the strains into 31 genotypes. Genotypes were divided among 9 discrete clusters by results of a cluster analysis. A geographic attachment to specific regions was characteristic for most of the clasters. Key words: Vibrio cholera; cholera; VNTR-, MLVA-, INDEL-, genotyping.
В наши дни холера продолжает представлять угрозу для общественного здравоохранения, что обусловливает необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых средств диагностики и типирования для проведения мониторинга. Важное место в системе эпидемиологического надзора за холерой традиционно отводится бактериологическому исследованию воды поверхностных водоемов и сточных вод и комплексному изучению выделенных штаммов [5, 7, 12]. Одновременно с совершенствованием методики эпидемиологического надзора за холерой совершенствовалась и схема изучения биологических свойств холерных вибрионов, в том числе за счет использования методов молекулярной биологии, к числу которых относятся методы типирования, основанные на выявлении уникальных генетических особенностей вибрионов. Одним из востребованных приемов изучения штаммов холерного вибриона, выделенных от людей во время эпидемических вспышек и из объектов окружающей среды,
является метод VNTR-анализа, внедренный в практику за последние годы в нашей стране и за рубежом [1, 5, 8].
Стандартная методика VNTR-анализа включает в себя анализ по пяти локусам тандемных повторов, что обеспечивает высокую дискриминирующую активность метода [8, 10]. Однако апилированные штаммы вибрионов, циркулирующие в объектах внешней среды, утрачивают локус VcB, что несколько ограничивает чувствительность метода. Данное обстоятельство делает необходимым расширение числа молекулярных маркеров, используемых при проведении молекулярного типирования.
Известно, что некоторые гены живых организмов в результате спонтанных вставок/делеций (insertion/deletion) нескольких нуклеотидов отличаются по длине у различных особей. Данный феномен положен в основу нового метода — молекулярного INDEL-типирования, который с успехом применяется для генотипирования как микроорганизмов [11], так и человека [9].
42
ЗНиСО
МАЙ №5 (260
Сведений об использовании приема INDEL-типирования на модели холерного вибриона мы не встретили.
Интересным представлялась возможность использования нового метода INDEL-типирования в сочетании со ставшим уже традиционным VNTR-анализом, особенно учитывая сходность используемых методических приемов при проведении анализа.
Цель настоящего исследования — изучение коллекции штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 г. из объектов окружающей среды на территории России с помощью методов INDEL-типирования и VNTR-анализа.
Материалы и методы. В работе использовали 45 штаммов Vibrio cholerae O1, выделенных из объектов окружающей среды на территории России в 2013 г. Все штаммы были лишены гена холерного токсина (ctxAB) и являлись типичными по своим биохимическим и культуральным свойствам. Четыре штамма содержали ген токсин-корегулируемых пилей (tcpAB).
VNTR-анализ по пяти локусам вариабельных тандемных повторов и ПЦР со сконструирова-ными праймерами к четырем INDEL-локусам вибрионов (табл. 1) проводили по уже описанной ранее методике. [8]. Кластерный анализ распределения аллелей проводили по методу UPGMA с использованием геоинформационной системы «Холера. Штаммы —VNTR» [2, 3].
Результаты и обсуждение. Первый этап работы состоял в разработке компьютерной системы для сравнительного анализа данных полногеномного секвенирования различных штаммов путем сравнения по каждому гену в отдельности. Важная особенность разработанной программы — возможность работы с набором контигов различной длины при отсутствии полного собранного генома. Было выявлено свыше 80 генов, содержащих де-леции у разных штаммов вибрионов. Однако размер выявленных делеций варьировался от нескольких нуклеотидов (чаще трех) до сотен. Дальнейший отбор потенциальных мишеней проводили, учитывая необходимость выявления наличия вставок/делеций с помощью приема электрофореза. Результатом работы стала созданная и зарегистрированная в Роспатенте база данных, содержащая описание INDEL-генов, отличающихся по длине у различных штаммов холерного вибриона [4].
Таблица 1. Перечень использованных в работе INDEL-генов, позволяющих дискриминировать штаммы холерного вибриона
№ Ген Локализация гена (хромосома и позиция на хромосоме) Праймеры для проведения амплификации Размеры аллелей (п.о.)
1 ompU 2 хромосома, 674828-675880 AACAAGACTCTGATTGCTCTTGC CTTTCAGAGATAGGCGAGCTTC 133, 166
2 1606 2 хромосома, 1720423-1721853 ATGCCACACAAAACCTCAATCTA AATATCGCGTTCAGTGATGGTAG 194, 206
3 CoA 1 хромосома, 727580-728788 CATCATTTACAGCATTGCCAGT CTTCACCAATCGGCTTAATCG 83, 98
4 thi 1 хромосома, 2872051-2872102 CTTGGGCGATCTTTGGTAATAA AAGCTTGCAGTGCCTGTGTTA 64, 52
г-Ь
Второй этап работы заключался в конструировании виртуальных праймеров, фланкирующих каждый из выявленных полиморфизмов. Указанные структуры были проверены in silico в виртуальной ПЦР при помощи разработанной ранее программы с использованием базы данных нуклеотидных последовательностей штаммов холерного вибриона [1]. Для проведения INDEL-типирования из широкого круга потенциальных кандидатов отобрали четыре INDEL-гена с наибольшей степенью вариабельности. Важной особенностью было то, что величина вставки в указанных генах варьировалась в пределах от 8 до 30 пар оснований, что характерно и для VNTR-генов. Благодаря этому можно легко разрешать аллели с помощью электрофореза продуктов ПЦР. К указанным структурам были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, которые затем использовали для проведения INDEL-типирования (табл. 1). Результат анализа набора штаммов вибрионов в ПЦР показал полное совпадение полученных результатов с данными компьютерного моделирования.
В 2013 г. из объектов окружающей среды на территории семи регионов Российской Федерации было выделено 45 штаммов Vibrio cholerae. Все указанные штаммы принадлежали к серовару О1 и были лишены гена холерного токсина (ctxAB). По результатам VNTR-типирования по пяти локусам VcA, VcB, VcI, VcD и VcG было выявлено 27 VNTR-генотипов. В случае анализа апилированных штаммов, утративших островок патогенности VcB [6], их рассматривали как несущие нулевую аллель VcB. Проведенный на этих же штаммах INDEL-анализ идентифицировал все исследованные штаммы и позволил выявить 12 различных INDEL-генотипов, что
МАЙ №5 (2И)
43
Таблица 2. Результаты INDEL и VNTR-типирования штаммов ИЬпо екв1егае, выделенных в 2013 г. из объектов окружающей среды на территории России
Ростовская область А1 А2 А3 А4 А5 C1 G1
Калмыкия C2 C3 E1 E10 E11 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 H1 H2
Краснодарский край D1
Забайкальский край B1 B4 F1
Республика Бурятия B2
Республика Коми B3 B5
Хабаровский край I1 I2
свидетельствовало о принципиальной возможности проведения INDEL-типирования, но, на первый взгляд, свидетельствовало о меньшей дискриминирующей силе INDEL-типирования по сравнению с VNTR-типированием. Сочетание двух методов, VNTR- и INDEL-типирования, позволило в итоге выявить 31 генотип. Например, штаммы Vibrio cholerae № 62 и № 68, выделенные в Республике Калмыкия, были идентичны по VNTR-генотипам, но отличались по INDEL-маркерам. Таким образом, можно прийти к заключению о том, что метод INDEL-типирования в ряде случаев позволяет дискриминировать штаммы, идентичные по своим VNTR-локусам. На основании полученных данных был сделан вывод о необходимости сочетания результатов INDEL- и VNTR-типирования. При объединении результатов INDEL- и VNTR-типирования все изученные штаммы сформировали 31 генотип. По результатам кластерного анализа генотипы
ЕЮ
Рис. Дендрограмма, построенная на основании кластерного распределения УЫТЯ- и INDEL-аллелей у штаммов V. екокгав, выделенных в 2013 г. на территории России
распределились между девяти кластерами, обозначенными от A до I.
Важно отметить, что штаммы, содержащие ген токсинкорегулируемых пилей, четко дискриминировались от апилированных штаммов как по результатам INDEL-типирования, так и по результатам VNTR-типирования и составили два четко дискриминируемых независимых кластера H и I (рис.). Причем в кластер H вошли штаммы из Калмыкии, а в кластер I — из Хабаровского края. На наш взгляд, это указывает на существование двух географически обособленных популяций ctx- tcp+^таммов холерного вибриона.
Распределение штаммов по итогам INDEL- и VNTR-типирования выявило четкую географическую привязанность (табл. 2). Так, штаммы кластера А выделялись исключительно на территории Ростовской области, штаммы кластеров E и Н — только на территории Калмыкии. Штаммы кластера С циркулировали как в пределах границы Ростовской области, так и на территории Калмыкии, что, судя по всему, объясняется географической близостью регионов. Единственный штамм, выделенный в Новороссийске (Краснодарский край), составил кластер D и при этом существенно отличался по распределению INDEL- и VNTR-маркеров от всех других штаммов. Штаммы, выделенные в Забайкальском крае, Бурятии и Республике Коми оказались весьма схожими и составили отдельный кластер B (рис.).
Заключение. В результате проведенной работы на основе компьютерного анализа полногеномных сиквенсов идентифированы гены Vibrio cholerae, содержащие вставки/делеции. На основании анализа указанных генов разработана система INDEL-типирования, включающая в себя четыре гена и систему специфических праймеров. Важно, что использование предложенного варианта INDEL-типирования не требует внедрения особых лабораторных приемов и полностью совместимо с паралельным прове-
44
ЗНиСО
МАЙ №5 (2И)
дением VNTR-типирования, поскольку размеры амплифицированных фрагментов у изучаемых INDEL- и VNTR-генов совпадают.
Первоначально метод INDEL-типирования был апробирован в формате in silico на полногеномных сиквенсах вибрионов, а затем успешно использован in vitro для типирования набора из 45 штаммов вибрионов, выделенных в различных регионах Российской Федерации в 2013 г. INDEL-типирование может быть самостоятельным методом несмотря на то, что по дискриминирующей способности оно несколько уступает VNTR-анализу, хотя в ряде случаев метод INDEL-типирования показал большую дискриминирующую способность. Для достижения максимальной дискриминирующей способности целесообразно сочетать методы INDEL- и VNTR-типирования. Результаты проведенного анализа подтверждают полученные ранее данные [5] о географической привязанности различных штаммов холерного вибриона. Очевидно назрела необходимость разработки геоинформационной системы, содержащей данные о молекулярных генотипах холерных вибрионов, циркулирующих в различных регионах Российской Федерации. Такой инструмент в перспективе позволит оперативно отслеживать возможные заносы холерных вибрионов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Водопьянов А.С. Алгоритм компьютерного VNTR-типирования на основе неполных сиквенсов ДНК штаммов Vibrio cholerae, выделенных на Гаити в 2010 / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишань-кин, И.П. Олейников //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 3. С. 28—31.
2. Водопьянов А.С. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio cholerae / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, М.Б. Мишанькин, И.Ю. Сучков [и др.] //Биотехнология. 2001. № 6. С. 85.
3. Водопьянов А.С. и др. База данных «Холера. Штаммы -VNTR» (свидетельство о государственной регистрации № 2007620389) / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин. Ростов-на-Дону, 2007.
4. Водопьянов А.С. База данных «Гены, позволяющие дифференцировать токсигенные и нетоксигенные штаммы Vibrio cholerae и проводить внутривидовое
типирование» (свидетельство о государственной ^ регистрации № 2014620308) / А.С. Водопьянов, "— С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников ж— Ростов-на-Дону, 2014.
5. Водопьянов А.С. и др. VNTR-генотипирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных из объектов внешней ^^ среды на территории Российской Федерации в 2012 году / А.С. Водопьянов, А.Б. Мазрухо, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин [и др.] //Микробиология. 2014. № 2. С. 46—51.
6. Водопьянов А.С. и др. Корреляция области вариабельного тандемного повтора (VNTR VCB) и гена токсин-корегулируемых пилей (tcpA) у возбудителя холеры: компьютерный анализ / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников //Здоровье населения и среда обитания. 2014. № 4 (253). С. 14—16.
7. Водопьянов С.О. и др. Вариабельный тандемный повтор VcA Vibrio cholerae / С.О. Водопьянов, И.П. Олейников, Е.К. Гончаров, О.В. Дуванова //Молекулярная биология. 2002. № 36 (6). С. 1074—1079.
8. Мишанькин Б.Н. и др. Мультилокусное VNTR-типирование культур холерных вибрионов, выделенных в г. Казань во время вспышки холеры летом 2001 года / Б.Н. Мишанькин, А.С. Водопьянов, Ю.М. Ломов //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 6. С. 11—15.
9. Larsson P. et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis / P. Larsson, K. Svensson, L. Karlsson, D. Guala [et al.] //Emerg Infect Dis. 2007; Vol. 13 (11). P. 1725—32.
10. Danin-Poleg Y. et al. Vibrio cholerae strain typing and phylogeny study based on simple sequence repeats / Y. Danin-Poleg, L.A. Cohen, H. Gancz, Y.Y. Broza [et al.] //J. Clin. Microbiol. 2007. Vol. 45. P. 736—746.
11. Oka K. et al. Genotyping of 38 insertion/deletion polymorphisms for human identification using universal fluorescent PCR / K. Oka, M. Asari, T. Omura, M. Yoshida [et al.] //Mol Cell Probes. 2014. Vol. 28(1). P. 13—8.
12. Stine O.C. et al. Seasonal cholera from multiple small outbreaks, rural Bangladesh / O.C. Stine, M. Alam, L. Tang, G.B. Nair [et al.] //Emerg. Infect. Dis. 2008. Vol. 14. P. 831—833.
Контактная информация:
Водопьянов Алексей Сергеевич, тел.: 8 (903) 402-07-02, е-mail: alexvod@gmail.com
Contact information: Vodopyanov Alexey, phone: 8 (903) 402-07-02, е-mail: alexvod@gmail.com
