CC BY
57
Это в свою очередь запускает защитную антиоксидантную систему организма животных, которая берет участие в уничтожении активных форм кислорода. Действие 0,1%-ного раствора сулемы в дозе 5 мг/кг массы тела животного привела к снижению глутатионпероксидазной активности, по сравнению с контролем , не зависимо от вида солевой нагрузки. 3% солевая нагрузка призводит к незначительным изменениям показателей активности антиоксидантного фермента - глутатионпероксидазы в разных слоях почек, по сравнению с показателями контрольной группы. При 0,75% нагрузке раствором №01 отмечено снижение глутатионпероксидазной активности у всех отделах почки, у сравнение с контролем.
Ключевые слова: почки, глутатионпероксидаза,
солевая нагрузка, сулема, антиоксидантная система.
Стаття надійшла 28.05.2012 р.
macromolecules. It activates antioxidant defense system of the animal organism, which is responsible for
decontamination of active form of oxygen. Effect of 0,1 %
sulema (mercurius corrosivus) solution in dose of 5 mg/kg of the body weight of animals causes lowering of
glutationperoxydasa activity in comparison with control not depending on the type of salt loading. 3% salt loading leads to minor indexes alteration of antioxidant enzyme activity -glutationperoxydasa in different kidneys layers in
comparison with indexes of the control group. Lowering of glutationperoxydasa activity in all parts of the kidney in comparison with control under 0,75% loading with NaCl is registered.
Key words: kidneys, glutationperoxydasa, salt loading, sulema (mercurius corrosivus), antioxidant system.
УДК 616-003.972:616.33:616-006.66:616-091.8-036.1
ІМУНОГІСТОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ЕКСПРЕСІЇ ЦИТОКЕРАТИНІВ ТА
КАРЦИНОЕМБРІОНАЛЬНОГО АНИГЕНУ ПРИ КИШКОВІЙ МЕТАПЛАЗІЇ ШЛУНКА
На основі імуногістохімічного аналізу гастробіопсій вивчено особливості експресії цитокератинів 7, 20 та карциноембріонального антигену при кишковій метаплазії СОШ. Встановлено, що позитивна експресія СК7 та CEA в ділянках кишкової метаплазії свідчить про її незрілий, неповний або гастроінтестинальний фенотип, проте експресія СК20 є більш характерної для повного, зрілого/тонкокишкового фенотипу метаплазії СОШ.
Ключові слова: цитокератини, карциноембріональний антиген, кишкова метаплазія, шлунок.
Робота є фрагментом науково-дослідної роботи «Морфогенез та патоморфоз захворювань шлунково-кишкового тракту, сечостатевої, нейроендокринної та імунної системи», № державної реєстрації 0111U010551.
Визнаними імуногістохімічними маркерами епітелію є цитокератини — білки проміжних філаментів (цитоскелету) епітеліальних клітин. [1]. Відомо близько 20 різних цитокератинів, що відрізняються за амінокислотним складом, молекулярною вагою та ізоелектричною точкою. Їх поділяють на дві великі групи -кислі або І тип А, сюди відносять 12 цитокератинів (CK9-CK20), інші 8 (CK1-CK8) - це основні/нейтральні або ІІ тип В [6]. Кератини кодуються генами великого мультигенного сімейства (на хромосомах 11, 12 і 17). Для різних типів епітелію характерні певні групи цитокератинів [9]. В практичній роботі для імуноцитохімічного визначення епітеліальної природи атипових клітин в пунктатах та біоптатах новоутворень достатньо використовувати антитіла проти певного цитокератину, або антитіла до широкого спектру цитокератинів (Рап-CK). Відомо також, що малігнізація епітеліальних клітин може призводити до зміни спектру цитокератинів, притаманного епітелію певної локалізації [2]. Цей феномен міг би бути використаний в якості маркеру неопластичної трансформації. Так, аденокарциноми звичайно експресують цитокератини епітеліального типу CK8, CK18, CK19 та, часто СК7. Типовим для колоректальних аденокарцином є експресія специфічних інтестинальних цитокератинів СК20 та відсутність СК7. За Schwerer M. J. та Baczako K. [10] найбільш характерним для зрілого інтестинального епітелію є експресія СК20.
Карциноембріональний антиген (СЕА) є онкофетальним білком, що виробляється переважно тканинами шлунково-кишкового тракту та підшлункової залози ембріону в першому триместрі вагітності а потім стає складовою частиною поверхневих клітинних мембран [11]. Після народження синтез його пригнічується. У дорослих людей він практично не виявляється. Вміст його збільшується при карциномах шлунково-кишкового тракту, легень, молочної залози, яєчників і матки. Найбільш часто його використовують як маркер колоректального раку. При пухлинах товстої кишки рівень СЕА корелює зі стадією процесу, тривалістю безрецидивного періоду та прогнозом. У зв’язку з високим вмістом вуглеводів (до 60%) в його молекулярній структурі та властивістю вироблятися переважно у фетальному періоді було доцільним прослідити його експресію в ділянках кишкової метаплазії (КМ) слизової оболонки шлунка (СОШ).
Експресія цитокератинів та СЕА при передракових змінах, зокрема при КМ залишається не вивченою та потребує додаткових досліджень [5, 10, 11].
Метою роботи було вивчити особливості експресії цитокератинів 7, 20 та карциноембріонального антигену в ділянках метаплазованого епітелію при різних типах кишкової метаплазії слизової оболонки у хворих з передраковими станами та раком шлунка.
Матеріал та методи дослідження. Упродовж 6 років було обстежено 336 пацієнтів, які були направлені в ендоскопічні відділення та кабінети для уточнення клінічного діагнозу. Чоловіків серед них було 192 (57%), жінок - 144 (43%). За основну групу було прийнято 68 хворих на хронічний атрофічний гастрит (ХАГ) з КМ із-за переважної асоціації останньої з цим захворюванням. Група порівняння включала 30 осіб, хворих на ХАГ без КМ. Середній вік пацієнтів, що були обстежені в динаміці, склав 52,96±1,13, середня тривалість захворювання на момент встановлення діагнозу метаплазії - 2,6±0,63 років. Розподіл обстежених пацієнтів представлений в таблиці 1.
Таблиця 1
Розподіл пацієнтів залежно від віку та нозології______________________________
Нозологія до 25 n=14 26-44 n=69 45-59 n=109 60>n=144 Всього
абс. к-ть абс. к-ть абс. к-ть абс. к-ть абс. к-ть %
Нормальна СОШ 3 7 6 5- 21 6
ХНГ 6 19 18 5 48 14
ХАГ без КМ 1 8 7 14 30 9
ХАГзКМ - 7 30 31 68 20
Кукса ОШВХ - 2 3 1 6 2
Хронічна виразка 1 10 11 12 34 10
Ерозії шлунка 2 9 5 5 21 6
Поліпи 1 3 9 5 18 6
Аденоми - 2 13 21 36 11
Рак шлунка - 2 7 45 54 16
Всього 14 69 109 144 336 100
Примітки. ХНГ - хронічний неатрофічний гастрит, ХАГ хронічний атрофічний гастрит, КМ - кишкова метаплазія, кукса ОШВХ - кукса оперованого шлунка з приводу виразкової хвороби.
В процесі фіброезофагогастродуоденоскопії та хромоендоскопії з 0,5% водним розчином метиленового синього виконували множинні біопсії (по 2 біоптата з тіла та антрального відділу шлунка та 1 з ділянки кута шлунка) з урахуванням вимог модифікованої Сіднейської системи та з профарбованих ділянок СОШ з наступним гістологічним вивченням біоптатів. Біопсійний матеріал фіксували у 10 % нейтральному формаліні і після загальноприйнятої обробки виготовляли парафінові блоки, а з них - зрізи 5-7 мкм завтовшки. Для визначення метапластичних змін СОШ використовували наступні методики: загальногістологічні (фарбування гематоксиліном і еозином та за ван Гізоном), гістохімічні (забарвлення залозистим діаміном за Спайсером, орсеїном в поєднанні з альціановим синім, альдегід фуксином за Гоморі, альціановим синім при pH 1,0 та 2,5 в поєднанні з ШИК-реакцією.
Визначення персистенції Н.руїогі у СОШ проводилося швидким уреазним тестом, цитологічно за Папенгеймом та гістологічно - забарвленням за Романовським-Гімза і толуїдиновим синім.
Імуногістохімічні дослідження виконували на парафінових зрізах з використанням стрептавідин-біотинового методу (“DAKO”, Данія, LSAB2 Systems, HRP). Демаскування антигену проводили в цитратному буфері з рН 6,0. В якості первинних антитіл застосовували мишачі моноклональні антитіла. Ядра клітин дофарбовували гематоксиліном Майера впродовж 15-60 сек. Експресію цитокератинів оцінювали за допомогою мишачих моноклональних антитіл СК 20 та 7 (клон Ks20.8 і OV-TL 12/30, “DAKO”, Данія), карциноембріонльний антиген визначали з використанням антитіл CEA (клон II-7, “DAKO”, Данія). Для оцінки експресії CK 20, 7 та CEA в СОШ використовувалася напівкількісна шкала оцінки інтенсивності забарвлення: 0 (відсутня) - відсутність позитивної реакції в клітинах, 1 (слабка) - до 30% клітин, що відреагували позитивно, 2 (помірна) - 31-60%, 3 (сильна) - 60% і більше забарвлених клітин [4].
Результати дослідження та їх обговорення. В групі з морфологічно незміненою СОШ, у хворих на хронічний неатрофічний гастрит (ХНГ) та ХАГ без КМ ми не спостерігали експресію CK20 в шлункових епітеліоцитах. При імуногістохімічному аналізі випадків з повною КМ (ПКМ) нами було встановлено виражену експресію CK20 як в стовпчастих епітеліоцитах, так і в келихоподібних екзокриноцитах, при цьому маркування переважало у верхньому компартменту СОШ, а саме в поверхневому епітелію папіломатозно змінених шлункових валиків (табл. 2, 3).
За Nardelli J. гістохімічний склад епітелію при КМ ІІІ типу нагадує в більшій мірі епітелій кишечнику не дорослої людини а дванадцятипалої кишки плода. Дійсно вже з 11 тижня розвитку плода цитокератин 20 знаходять в кишковому епітелії [7,8]. В нашому дослідженні було виявлено більш виражену експресію СК20 у випадках з І та ІІІ гістохімічним типом кишкової метаплазії та слабку експресію СК20 у випадках з КМ ІІ типу, що свідчить про незрілість даного варіанту (рис. 1). При порівняні групи хворих на ХАГ з КМ з наявною хелікобактерною інфекцією (H.pylori +) та H.pylori негативних (-) пацієнтів не було виявлено достовірних відмінностей в експресії CK20.
Поряд з цитокератином 20, ми вивчили експресію СК7, який не визначався в групі з морфологічно незміненою СОШ, у хворих на ХНГ та хронічний ХАГ без КМ. Особливістю даного цитокератину є знаходження його в недиференційованих клітинах шлунка у плодів [5]. Ми дослідили шлунки трьох 14-тижневих плодів в яких виявили позитивну експресію CK7 в цитоплазмі та мембранах недиференційованих клітин (рис. 2). Найбільш сильна експресія СК7 нами спостерігалася в ділянках неповної КМ, епітелії кістозно
розширених залоз та в дрібних залозах, які формували трубчасті структури (96% хворих на ХАГ з НКМ). В ділянках повної КМ експресія СК7 була слабка у 67% та у 33% хворих на ХАГ з КМ відсутня. Проте з часом (у період від 2 до 6 років) при зміні/появі неповного типу КМ у хворих на ХАГ відмічали посилення експресії CK7. Також нами було відмічено посилення експресії CK7 у 57% H. pylori (+) хворих на ХАГ з різними типами КМ, проте різниця між ними та H. pylori (-) хворими була не достовірною (p>0,05). Слід зазначити, що маркування СК7 достовірно посилювалося (p<0,05) як в ділянках дисплазії шлункового епітелію, так і КМ, які були прилеглими до раку (рис. 3).
Таблиця 2
__________________________________Хронічний атрофічний гастрит з ПКМ_______________________________
Назва антитіла Специфічність
ПЯЕ ШМ ГЕ ПЕ ПлЕ КЕ СЕПО
CK7 + - - - ++ ++
CK20 +++ - - - +++ +++
CEA +++ - - - - +++*
Примітки: ПЯЕ поверхневі епітеліоцити ямок та валиків, ШМ- шийкові мукоцити, ГЕ - головні екзокриноцити, ПЕ - парієтальні екзокриноцити, ПлЕ - пілоричні екзокриноцити КЕ - келихоподібні екзокриноцити, СЕПО - стовпчасті епітеліоцити з посмугованою
облямівкою. + слабка експресія, ++ помірна, +++ сильна експресія, - відсутня.
Т аблиця 3
_______________________________________Хронічний атрофічний гастрит з НКМ_______________________________________
Назва антитіла Специфічність
ПЯЕ ШМ ГЕ ПЕ ПлЕ КЕ СЕПО
CK7 +++ ++ - - + ++ +++
CK20 - + - - - ++ ++
CEA - - - - - ++ +++
Примітки: ПЯЕ поверхневі епітеліоцити ямок та валиків, ШМ - шийкові мукоцити, ГЕ - головні екзокриноцити, ПЕ - парієтальні екзокриноцити, ПлЕ - пілоричні екзокриноцити КЕ - келихоподібні екзокриноцити, СЕПО - стовпчасті епітеліоцити з посмугованою облямівкою. + слабка експресія, ++ помірна, +++ сильна експресія, - відсутня.
Рис. 1. а) Помірна експресія СК20 в поверхневих Рис 2. Помірна експресія СК7 в
епітеліоцитах та слабке маркування СК20 в ділянках неповної недиференційованих епітеліоцитах шлунка. Шлунок плоду
метаплазії (ІІ тип). Хронічний атрофічний гастрит з повною та (14 тижнів гестації). Імуногістохімічне забарвлення СК7 х
неповною КМ. б) Сильна експресія СК20 в поверхневих епітеліоцитах. 200.
Хронічний атрофічний гастрит з повною КМ (І тип). в) Помірна та слабка експресія СК20 в стовпчастих епітеліоцитах. Хронічний атрофічний гастрит з неповною кишковою метаплазією (ІІІ тип) і формуванням мікроаденоми. Імуногістохімічне забарвлення СК20, а) х 100, б) х 400, в) х 200.
У 98 % хворих з аденокарциномами шлунка різного ступеня диференціювання експресія СК7 була позитивною з перевагою сильного маркування у випадках з помірно та низькодиференційованою аденокарциномою (рис. 4). Проте у хворих на перснеподібний рак частіше спостерігалася слабка та помірна експресія даного маркеру та виявлялася у 39% спостережень.
Порушення координації між процесами клітинної проліферації та диференціювання з появою незрілих клітин в спеціалізованому епітелії СОШ свідчить про суттєві зсуви в системі внутрішньо- та зовнішньоклітинних механізмів регуляції клітинного оновлення при ХАГ. Цитокератини можуть слугувати додатковими маркерами у визначенні повної (простої з переважно тонкокишковим фенотипом) КМ та неповної (гіперпроліферативної з переважно гастроінтестинальним фенотипом) КМ, зокрема експресія СК20 переважала у випадках з ПКМ з більш зрілим епітелієм і вже сформованим кишковим фенотипом, в той час як експресія СК7 значно посилювалася у пацієнтів з НКМ, для якої характерним був гастроінтестинальний фенотип з перевагою незрілих клітин як в ділянках з метаплазованим епітелієм так і прилеглих до них недиференційованих шлункових епітеліоцитів. В групі з морфологічно незміненою СОШ, у хворих на ХНГ та на ХАГ без КМ експресія карциноембріонального антигену не спостерігалася. При імуногістохімічному дослідженні СЕА, останній виявлявся переважно в посмугованій облямівці
стовпчастих епітеліоцитів у випадках з повною КМ (87%) та на люмінальний поверхні і в цитоплазмі призматичних клітин (74%) у випадках з неповною КМ (рис. 5, див, табл. 2, 3).
Рис. 3. Помірна та сильна експресія СК7 в ділянках неповної КМ, прилеглих до низькодиференційованої аденокарциноми (а, б). Імуногістохімія СК7 х 400.
Рис.4. Сильна експресія СК7 в цитоплазмі та мембранах клітин низькодиференційованої аденокарциноми (а, б). Імуногісто хімічне забарвлення СК7 х 400.
Рис.5. Слабка експресія CEA в ділянці повної КМ (а) та сильна в неповній КМ (б). Імуногістохімічне забарвлення CEA х 400.
Рис. 6. Помірна експресія CEA на люмінальній поверхні клітин аденокарциноми. Імуногістохімічне забарвлення CEA х 200.
Нами не було встановлено вірогідної різниці між H. pylori (+) та негативними хворими на ХАГ з різними типами КМ та експресією CEA. Також експресія CEA не відрізнялася в ділянках неповної КМ та в аденокарциномах (р>0,05), при цьому слід відзначити біль виражене маркування СЕА в помірно та низькодиференційованих аденокарциномах (рис. 6), проти слабкої експресії у високодиференційованих. У випадках перснеподібного раку відзначали слабку та помірну експресію СЕА.
Таким чином, експресія CEA спостерігалася у випадках з повною КМ переважно в посмугованій облямівці, в той час як з неповною КМ відмічали позитивне маркування СЕА в цитоплазмі стовпчастих епітеліоцитів, що свідчить про незрілість даних клітин та незавершений тип метаплазії.
Експресія СК 20 характерна для ПКМ з більш зрілим епітелієм і вже сформованим кишковим фенотипом, в той час як експресія СК7 значно посилюється (p<0,05) у пацієнтів з НКМ, для якої характерним був гастроінтестинальний фенотип з перевагою незрілих клітин як в ділянках з метаплазованим епітелієм так і прилеглих до них недиференційованих шлункових епітеліоцитів. Позитивне маркування СК7 в аденокарциномах та перснеподібному раку шлунка свідчить про неопластичну трансформацію клітин саме з незрілих або недиференційованих епітеліоцитів та може бути використано для визначення гістогенетичного походження карцином. Експресія CEA в цитоплазмі стовпчастих епітеліоцитів вказує на незрілість даних клітин та неповний (незавершений тип) КМ.
Перспективи подальших досліджень в даному напрямку. СК 20/7 і CEA можуть слугувати додатковими імуногістохімічними маркерами у визначенні повної (зрілої) КМ та неповної (незрілої) КМ.
1.Божок Ю.М. Цитологічна діагностика новоутворень щитовидної залози / Ю.М. Божок - Монографія. ТОВ “Міжнародна фінансова агенція”. - Київ, 1997. - 116 с.
2.Иммуногистохимическое исследование опухолей молочной железы человека с помощью моноклональных антител к белкам промежуточных филаментов. Рак молочной железы / Гельштейн В. И., Чипышева ТА., Ермилова В. Д., [и др.] // Архив патологии. — 1986. — вып. 8. — С. 14—22.
3.Порханова Н.В. Значение биомаркеров для формирования групп риска и ранней диагностики опухолей (на примере рака яичников и рака молочной железы) / Н.В. Порханова // Практическая онкология - Т. 12, №4 - 2011.
4.Cassaro M. Indefinite for non-invasive neoplasia lesions in gastric intestinal metaplasia: the immunophenotype/ Cassaro M., Rugge M., Tieppo C. et al. // J Clin Pathol. - 2007. - Vol. 60. - P. 615-621.
5.Kirchner T. Metaplasia, intraepithelial neoplasia and early cancer of the stomach are related to dedifferentiated epithelial cells defined by cytokeratin-7 expression in gastritis / Kirchner T., Müller S., Hattori T. et al. // Virchows Arch. - 2001. - Vol. 439, №4. -P. 512-522.
6.Moll R. Cytokeratins as markers of differentiation in the diagnosis of epithelial tumors / R.Moll // Subcellular Biochemistry.
Intermediate Filaments. Hermann & Harris (eds.), Plenum Press. - 1998. - Vol. 31. - P. 205-62.
7.The human gene encoding cytokeratin 20 and its expression during fetal development and in gastrointestinal carcinomas /Moll R., Zimbelmann R., Goldschmidt M.D. et al. // Differentiation. - 1993.- Vol. 53., № 2. - P. 75-93.
8.Nardelli J. Fetal gastric and small intestine pattern of intestinal mucus antigens in human gastric carcinomas / Nardelli J., Loridon-
Rosa B., Bara J., Burtin P. // Cancer Res. 1984. - Vol. 44, № 9. P. 4157-63.
9.Schaafsma H.E. Cytokeratin subtyping in normal and neoplastic epithelium: basic principles and diagnostic applications / H.E. Schaafsma, F.C.S. Ramaekers // Pathol. Annu.- 1994. - 29, (Part I). - P. 21-62.
10.Schwerer M. J. Immunohistochemical evaluation of keratin 20 expression in intestinal metaplasia types I to III / M. J. Schwerer, K. Baczako // J. Clin. Pathol. - 1996. - Vol. - 49. - P. 791-794.
11.Expression of cytokeratins in Helicobacter pylori-associated chronic gastritis of adult patients infected with cagA+ strains: An immunohistochemical study / Todorovic V., Sokic-Milutinovic A., Drndarevic N. et al. // World J. Gastroenterol. - 2006. - Vol. 12(12). - P. 1865-1873.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ЦИТОКЕРАТИНОВ И КАРЦИНОЭМБРИОНАЛЬНОГО АНИГЕНА ПРИ КИШЕЧНОЙ МЕТАПЛАЗИИ ЖЕЛУДКА Вернигородский С. В.
На основе иммуногистохимического анализа гастробиопсий изучены особенности экспрессии цитокератинов
7, 20 и карциноэмбрионального антигена при кишечной метаплазии СОЖ. Установлено, что позитивная экспрессия СК7 и CEA в участках кишечной метаплазии свидетельствует о ее незрелом, неполном или гастроинтестинальном фенотипе, а экспрессия СК20 является более характерной для полного, зрелого/тонкокишечного фенотипа метаплазии СОЖ.
Ключевые слова: цитокератины, карцино-
эмбриональный антиген, кишечная метаплазия, желудок.
Стаття надійшла 13.06.2012 р.
IMMUNOHISTOCHEMICAL FEATURES OF CYTOKERATINS AND CARCINOEMBRYONAL ANTIGEN EXPRESSION IN GASTRIC INTESTINAL METAPLASIA Vernygorodskyi S.V.
The features of cytokeratins and carcinoembryonal antigen expression in gastric intestinal metaplasia was studied on the basis of immunohistochemical analysis. A positive expression of CK7 and CEA in areas of intestinal metaplasia are evidence of its immature, incomplete or gastrointestinal phenotype, but expression of CK20 is more distinctive for complete, mature/solely small-intestinal phenotype of gastric intestinal metaplasia.
Key words: cytokeratins, carcinoembryonal antigen, intestinal metaplasia, stomach.
УДК 616.71-018:[614.876+613.632]
ГІСТОМОРФОМЕТРИЧНІ ОСОБЛИВОСТІ РЕАКЦІЇ ДОВГИХ КІСТОК СКЕЛЕТА В УМОВАХ
СПОЖИВАННЯ СОЛЕЙ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ
В роботі вивчений вплив солей цинку, хрому та свинцю на ріст та будову довгих кісток скелету. Вивчалась остеометрія кісток, гістологічна будова середини діафізу та проксимального наросткового хряща з наступною їхньою морфометрією яка проводилась за стандартною методикою. Виявлені зміни свідчать про затримку повздовжнього росту кісток та зміни їх будови у вигляді появи дистрофічних та деструктивних змін. В період реадаптації не відбувається повного відновлення ростових та гістологічних показників кісткової тканини.
Ключові слова: довгі кістки, гістоморфометрія, хімічний склад, солі важких металів
Робота є ініціативною.
В умовах сьогодення велике значення набуває вивчення стану навколишнього середовища та вплив шкідливих факторів та організм людини. На даний час доведений зв'язок розвитку патології дихальної, серцево-судинної, сечовидільної та інших систем організму із станом екології певних регіонів. Наряду з цим відбувається ріст захворюваності опорно-рухового апарату, зокрема остеопоротичних змін кісток та їх наслідків у вигляді компресійних переломів хребців, переломів шийки стегна, тощо [1,2,3]. Все це призводить до величезних економічних збитків та втрати працездатності чи інвалідизації суб'єктів. Особливе занепокоєння викликає ріст даної патології серед осіб працездатного віку, що спонукає до пошуку причин даної патології та
