Імуногістохімічне дослідження експресії CD44 у хворих на колоректальний рак з перитонеальними метастазами Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

© 1Ревура А. П., 1Фецич Т. Г., 2Боднар Л. В., 2Чуба В. Я.

УДК: 616.345-006.6-089.169.1-06:616.381-033.2]-074-078.73

1Ревура А. П., 1Фецич Т. Г., 2Боднар Л. В., 2Чуба В. Я.

1МУНОГ1СТОХ1М1ЧНЕ ДОСЛ1ДЖЕННЯ ЕКСПРЕСЙ" CD44

У ХВОРИХ НА КОЛОРЕКТАЛЬНИЙ РАК

З ПЕРИТОНЕАЛЬНИМИ МЕТАСТАЗАМИ

1Львiвський нацiональний медичний ушверситет iMeHi Данила Галицького (м. Львiв) 2Державний патологоанатомiчний Центр УкраГни (м. Хмельницький)

a.revura@gmail.com

Дане дослiдження е фрагментом науково-до-слiдноI роботи кафедри онкологи та медично! рад^ ологiI Львiвського нацiонального медичного уывер-ситету iменi Данила Галицького «lндивiдуалiзацiя лiкування та вивчення прогностичних факторiв у хво-рих на мюцево-поширений та метастатичний рак: шлунково-кишкового тракту, репродуктивно! сис-теми, молочно!залози, щитовидно! залози, легень та нирки» (2012-2016 рр., № державно! реестрацп 0112и000164).

Вступ. Колоректальний рак (КРР) е одним iз най-поширенiших онкологiчних захворювань в Украшг Розвиток вiдцалених метастазiв пiсля радикального хiрургiчного чи комбiнованого лiкування свщчить про вiдносно несприятливий прогноз. Окрiм печiнки, яка уражаеться найчастiше, Ышою звичною локалiзацi-ею метастазiв е очеревина у 19-25% па^етчв [7,12].

Останым часом, в наукових до^дженнях все бiльше уваги придiляють вивченню особливостей злоякiсних пухлин, зокрема i КРР на молекулярному рiвнi. Встановлено, що генетична нестабiльнiсть призводить до змши експресi! ряду молекул, функ-цiонування яких визначае широкий спектр ефекпв. До них вщносять афесивнють iнвазивного росту пухлини, !! здатнiсть до метастазування, чутливiсть до рiзних видiв медикаментного лiкування [2,13].

Важливе значення в розвитку КРР мають моле-кули адгезi!, серед яких 0044 розглядають як по-тенцiйно корисний прогностичний фактор. Рiвень його експресi! в пухлинi товсто! кишки пов'язаний iз глибиною швазм, ураженням лiмфатичних вузлiв та метастазуванням в леген [10,15]. Окрiм цього, виявлено достовiрний негативний вплив надмiрно! експресi! 0044 на загальне виживання хворих на КРР [14]. Вважають також, що 0044 вщповщае за формування контакпв мiж iнтраперитонеально дис-емiнованими злоякiсними клiтинами та мезотел^ ем очеревини, однак роль цього маркеру клггинно! адгезi! для розвитку карциноматозу очеревини за-лишаеться не цтком з'ясованою [4]. На даний час е небагато наукових даних про кгмычне значення 0044 у хворих на КРР з карциноматозом очеревини.

Мета дослщження. Оцшити експресю маркера 0044 в первиннiй пухлин у хворих на КРР та проана-

л1зувати иого вплив на имов1рнють розвитку карциноматозу очеревини.

Об'ект i методи досл1дження. Для доотджен-ня експресИ CD44 вобрано г1столог1чниИ матер1ал 12 хворих на КРР яких подшили на дв1 групи. У першу (дослщну) групу вв1Ишли 6 пац1ент1в, як1 мали про-гресування захворювання у вигляд1 карциноматозу очеревини п1сля радикального х1рурпчного чи комб1нованого л1кування. Другу (контрольну) групу склали 6 хворих на КРР, в яких не було д1агностовано карциноматозу очеревини пюля радикальних х1рур-г1чних операц1И на протяз1 диспансерного спостере-ження тривалютю 23-37 м1с.

Р1вень експресИ CD44 визначали ¡мунопстох1м1ч-ним методом. Для цього зразки тканини первинно! пухлини, фксовано! у формал1н1, заливали в пара-ф1н. За допомогою роторного м1кротому Microm HM 325 (Thermo Scientific, США) 1з параф1нових блоюв виготовляли зр1зи товщиною 4 мкм. Зр1зи тканин наносили на предметы скельця, проводили депара-ф1нування, регщратац1ю та демаскування антиген1в. Для 1мунно! реакц1! з антигеном використовували первинн моноклональн1 мишин1 антит1ла до CD44 (клон 1C11H1, Sino Biological Inc, Китай). В1зуал1-зацю реакц1! виконували за допомогою перокси-дазно! системи детекци PolyVue з DAB хромогеном (Diagnostic BioSystems, США).

Готов1 препарати переглядали на свггловому м1-кроскоп1 Olympus CX31 (OLYMPUS Corp., Япон1я). Експрес1ю CD44 вважали позитивною при наявнос-т1 мембранно! ¡муног1стох1м1чно! реакцп в популяц1! пухлинних кл1тин. Р1вень експрес1! маркеру харак-теризували нап1вкшькюно. Враховувалася ¡нтен-сивн1сть накопичення хромогену та частка клггин ¡з позитивною реакц1ею: низький р1вень - менше 10% кл1тин, пом1рний - 10-50% та високий - бшьше 50%.

Статистичний анал1з проводили в програмному забезпеченн GraphPad Prism 6.05. Статистичну в1-рог1дн1сть в1дм1нностей експрес1! маркеру CD44 м1ж пор1внюваними групами визначали методом точного критерю Ф1шера.

Результати дослiдження та 'Гх обговорення

Проанал1зовано результати ¡мунопстох1м1чно-го дослщження експрес1! CD44 в тканин1 первинно! пухлини товсто! кишки (рис. 1). У перший груп1

5

4

3

"З2

1

0

хворих на КРР з карциномато-зом очеревини спостеркала-ся позитивна реак^я на 0й44 у злояюсних клiтинах в 5 (83,3%) випадках. Переважав низь-кий рiвень експресií маркеру (рис. 2). Натомють, в другiй групi, у 5 (83,3%) хворих на КРР без розвитку карциноматозу очеревини iмуногiстохiмiчна ре-ак^я на 0й44 була негативною в пухлинних кл^инах (рис. 3) i лише в одного (16,7%) хворого - позитивною. В жодному iз дослiджених препаратiв не вщ-мiтили високого рiвня експресп маркеру. Позитивну реакцiю на маркер у стромi та клiтинах запального шфтьтрату до уваги не приймали. Таким чином, виявлена вщмшнють в експресп 0й44 у хворих на КРР з карциноматозом очеревини та без нього, яка е статистично вiрогiдною (р = 0,04).

Процес метастазування злояюсних пухлин - це складний багатоступеневий процес, опосередко-ваний багатьма молекулярними чинниками, серед яких важливу роль в^грають молекули кл^инно'|' ад-гезп [1,2]. В нормi молекули адгезií вщповщають за утворення щiльних мiжклiтинних зв'язюв. У пухлинi цi зв'язки е дестаб^зоваы внаслiдок змiни експресп молекул адгезií, а дисемiнованi злояюсы клiтини таким чином набувають здатност формувати новi контакти у мюцях розвитку метастазiв [4]. Поверх-невий мембранний глкопротеш 0й44 е типовим представником молекул адгезií. Ряд наукових пу-блiкацiй засвiдчують, що експреая 0й44 зумовлюе великий метастатичний потен^ал клiтин пухлини товстоí кишки та корелюе з iмовiрнiстю розвитку лiмфогенних та гематогенних метастазiв [11,14,16]. Результати нашого дослiдження показали, що роз-виток карциноматозу очеревини також асоцмова-ний iз функцiонуванням даноí молекули кл^инно!'

а

4

Ж 1 1

1 Г 0 0

■ ЕкспреЫя вщсутня

С Низький р1вень експрес Т

■ Пом1рний р1вень експресп

■ Високий р1вень експресп'

I група II група

Рис. 1. Розподiл хворих першо'Г та друго'Г груп за рiвнем експресГГ СР44

адгезií, яка, очевидно, вiдповiдае за контакт з мезо-телiем очеревини.

Враховуючи останн досягнення у розробцi ком-бшованого лiкування на основi циторедуктивних операцм з приводу iнтраперитонеальних рецидивiв КРР, варто вщм^ити суттеве покращення показниюв виживання пацiентiв [3,6,9]. Проте така лкувальна тактика демонструе ефективнiсть при вiдборi паци ентiв iз карциноматозом очеревини на раных етапах розвитку, який не мае виражених кл^чних проявiв [5,8]. Визначення молекулярних предикторiв карциноматозу очеревини при КРР, зокрема 0й44, та формування на IX основi груп високого ризику дае можливiсть розробити оптимальний iндивiдуалiзо-ваний пiдхiд до спостереження па^ен^в пiсля радикального хiрургiчного л^вання з метою ранньоí дiагностики Ытраперитонеальних рецидивiв.

Висновки

Експресiя маркеру 0й44 може використовува-тись як фактор, який дозволяе прогнозувати розви-ток метахронного карциноматозу очеревини тсля радикальних операцм у хворих на КРР.

Рис. 2. Позитивна iмуногiстохiмiчна реакщя на СР44 у тканинi пухлини сигмоподiбноГ кишки. Низький рiвень експресГГ маркеру (оптичне збшьшення окуляра 10Х i об'ектива 20Х).

Рис. 3. Негативна iмуногiстохiмiчна реакцiя на СР44 у тканинi пухлини верхньоампулярного вщдту прямоГ кишки (оптичне збiльшення окуляра 10Х i об'ектива 20Х).

Вивчення бюлопчних аспек^в розвитку захворю- та вивчення взаемозв'язюв експреси маркеру з ш-

вання дозволить поглибити розумiння Ыдивщуаль- шими клiнiко-пaтологiчними факторами. Резуль-

них особливостей кгмычного пeрeбiгу КРР та розши- тати цих доcлiджeнь можуть бути використан для

рить можливост лiкувaння хворих. покращення покaзникiв виживання хворих на КРР iз

Перспективи подальших дослiджень. В по- високим ризиком iнтрaпeритонeaльного рецидиву,

дальшому плануеться проведення доcлiджeнь, шляхом удосконалення мeтодiв лiкувaння та роз-

спрямованих на порiвняльний aнaлiз eкcпрeciI робки шляхiв профiлaктики розвитку карциномато-

CD44 в тканин первинно! та метастатичних пухлин зу очеревини.

Л^ература

1. Володько Н. А. Екcпрeciя глкопроте'шу CD44 та його iзоформ в штрадуктальних та iнвaзивних раках грудно! залози / Н. А. Во-

лодько, А. Райнер, М. Рудас // Acta Medica Leopoliensia. - 1996. - Т. II, № 2. - C. 9-13.

2. Грабовий О. М. Колоректальний рак: патогенетична шформативнють пстолопчного дослщження (огляд лггератури) /

0.М. Грабовий, С. О. Антонюк, 6. А. Воробей [та ш.] // Клиническая онкология. - 2014. - Т. 4, № 16. - C. 62-69.

3. Ярема Р Р 1нтраперитонеально дисемшований рак: заюнчення ери скептицизму? / Р. Р Ярема, Т. Г. Фецич, О. Глеен [та ш.] //

Онкология. - 2013. - Т. 15, № 2. - C. 88-95.

4. De Cuba E. M. Understanding molecular mechanisms in peritoneal dissemination of colorectal cancer: future possibilities for

personalised treatment by use of biomarkers / E. M. de Cuba, R. Kwakman, M. van Egmond [et al.] // Virchows Arch. - 2012. -Vol. 461, № 3. - P. 231-243.

5. Elias D. Peritoneal colorectal carcinomatosis treated with surgery and perioperative intraperitoneal chemotherapy: retrospective

analysis of 523 patients from a multicentric French study / D. Elias, F-N. Gilly, F Boutitie [et al.] // J. Clin. Oncol. - 2010. - Vol. 28, № 1. - P. 63-68.

6. Elias D. Complete cytoreductive surgery plus intraperitoneal chemohyperthermia with oxaliplatin for peritoneal carcinomatosis of

colorectal origin / D. Elias, J. H. Lefevre, J. Chevalier [et al.] // J. Clin. Oncol. - 2009. - Vol. 27, № 5. - P. 681-685.

7. Van Gestel Y R. B. M. Metachronous peritoneal carcinomatosis after curative treatment of colorectal cancer / Y R. B. M. Van Gestel,

1. Thomassen, V. E. P. P. Lemmens [et al.] // Eur. J. Surg. Oncol. - 2014. - Vol. 40, № 8. - P. 963-969.

8. Goйrй D. Extent of Colorectal Peritoneal Carcinomatosis: Attempt to Define a Threshold Above Which HIPEC Does Not Offer Survival

Benefit: A Comparative Study / D. Go^^ A. Souadka, M. Faron [et al.] // Ann. Surg. Oncol. - 2015. - Vol. 22, № 9. - P. 2958-2964.

9. Hompes D. The treatment of peritoneal carcinomatosis of colorectal cancer with complete cytoreductive surgery and hyperthermic

intraperitoneal peroperative chemotherapy (HIPEC) with oxaliplatin: a Belgian multicentre prospective phase II clinical study / D.Hompes, A. D'Hoore, E. Van Cutsem [et al.] // Ann. Surg. Oncol. - 2012. - Vol. 19, № 7. - P. 2186-2194.

10. Huh J. W. Expression of standard CD44 in human colorectal carcinoma: Association with prognosis / J. W. Huh, H. R. Kim, Y J. Kim [et al.] // Pathol. Int. - 2009. - Vol. 59, № 4. - P. 241-246.

11. Takeuchi K. Expression of CD44 variant exons 8-10 in colorectal cancer and its relationship to metastasis / K. Takeuchi, A.Yamaguchi, T. Urano [et al.] // Japanese J. Cancer Res. - 1995. - Vol. 86, № 3. - P. 292-297.

12. Verwaal V. J. Long-Term Survival of Peritoneal Carcinomatosis of Colorectal Origin / V. J. Verwaal, S. Van Ruth, A. J. Witkamp [et al.] // Ann. Surg. - 2005. - Vol. 12, № 1. - P. 9-12.

13. Worthley D. L. Colorectal cancer: molecular features and clinical opportunities / D. L. Worthley, B. A. Leggett // Clin. Biochem. Rev. - 2010. - Vol. 31, № 2. - P. 31-38.

14. Wu Q. Evaluation of the correlation of KAI1/CD82, CD44, MMP7 and п-catenin in the prediction of prognosis and metastasis in colorectal carcinoma / Q. Wu, Y Yang, S. Wu [et al.] // Diagn. Pathol. - 2015. - Vol. 10, № 1. - P. 176-185.

15. Yae T. Alternative splicing of CD44 mRNA by ESRP1 enhances lung colonization of metastatic cancer cell / T. Yae, K. Tsuchihashi, T. Ishimoto [et al.] // Nat. Commun. - 2012. - Vol. 3. - P. 883-892.

16. Yamaguchi A. Expression of a CD44 variant containing exons 8 to 10 is a useful independent factor for the prediction of prognosis in colorectal cancer patients / A. Yamaguchi, T. Urano, T. Goi [et al.] // J. Clin. Oncol. - 1996. - Vol. 14, № 4. - P. 1122-1127.

УДК 616.345-006.6-089.169.1-06:616.381-033.2]-074-078.73

1МУНОГ1СТОХ1М1ЧНЕ ДОСЛ1ДЖЕННЯ ЕКСПРЕСИ 0й44 У ХВОРИХ НА КОЛОРЕКТАЛЬНИЙ РАК З ПЕРИТОНЕАЛЬНИМИ МЕТАСТАЗАМИ

Ревура А. П., Фецич Т. Г., Боднар Л. В., Чуба В. Я.

Резюме. Перитонеальн метастази або карциноматоз очеревини е поширеним типом прогресування за-хворювання пюля хiрургiчного л^вання в хворих на колоректальний рак. Останым часом все бшьше уваги придшяеться iмуногiстохiмiчному методу дiагностики як доповненню до рутинного пстолопчного доотджен-ня видалених пухлин товсто! кишки з метою вивчення рiзних молекулярних маркерiв. Вщповщно до нашого аналiзу, 0044 був експресований в тканин первинно! пухлини пащен^в з перитонеальними метастазами. ЕкспреЫя 0044 була вщсутня в па^ен^в без прогресування хвороби. Отже, цей маркер може використову-ватися як предиктивний фактор розвитку метахронного карциноматозу очеревини пюля радикальних опе-рацм в хворих на колоректальний рак.

Ключовi слова: iмуногiстохiмiчне доотдження, 0044, колоректальний рак, карциноматоз очеревини, хiрургiчне лкування.

УДК 616.345-006.6-089.169.1-06:616.381-033.2]-074-078.73

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ 0й44 У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕК-ТАЛЬНЫМ РАКОМ С ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМИ МЕТАСТАЗАМИ

Ревура А. П., Фецич Т. Г., Боднар Л. В., Чуба В. Я.

Резюме. Перитонеальные метастазы или карциноматоз брюшины является распространенным типом прогрессирования заболевания после хирургического лечения у больных колоректальным раком. В по-

следнее время все больше внимания уделяется иммуногистохимическому методу диагностики как дополнению к рутинному гистологическому исследованию удаленных опухолей толстой кишки с целью изучения различных молекулярных маркеров. Согласно нашему анализу, CD44 был экспрессирован в ткани первичной опухоли пациентов с перитонеальными метастазами. Экспрессия CD44 отсутствовала у пациентов без прогрессирования болезни. Следовательно, этот маркер может использоваться как предиктивный фактор развития метахронного карциноматоза брюшины после радикальных операций у больных колоректальным раком.

Ключевые слова: иммуногистохимическое исследование, CD44, колоректальный рак, карциноматоз брюшины, хирургическое лечение.

UDC 616.345-006.6-089.169.1-06:616.381-033.2]-074-078.73

IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF CD44 EXPRESSION IN PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER AND PERITONEAL CARCINOMATOSIS

Revura A., Fetsych T., Bodnar L., Chuba V.

Abstract. Background. Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies in Ukraine. The development of distant metastases after radical surgery or combined treatment indicates a relatively poor prognosis. Apart from the liver, which is affected most often, peritoneum is another typical site of metastases in 19-25% of patients. Recently, growing number of studies focus their attention on investigating the characteristics of malignant tumors, including CRC, at the molecular level. Adhesion molecules were shown to be important ones in the development of CRC, among which CD44 is treated as potentially useful prognostic factor. The level of its expression in colon tumors is associated with depth of invasion, lymph node and lung metastasis. Besides, CD44 overexpression was found to have a negative impact on overall survival of patients with CRC. CD44 is responsible for the formation of contacts between intraperitoneally disseminated malignant cells and peritoneal mesothelium. However, the role of this cell adhesion molecule for the development of peritoneal carcinomatosis remains unclear. Data on the clinical significance of CD44 in patients with CRC and peritoneal carcinomatosis are scarce. Recently, immunohis-tochemical method in addition to routine histology has gained increased attention aiming at evaluation of different molecular markers. The aim of this study was to examine the expression of CD44 marker in primary tumor tissue of patients with colorectal cancer with immunohistochemical analysis, and to analyze potential prognostic significance of CD44 for the development of peritoneal carcinomatosis.

Methods. To investigate the expression of CD44, tissue samples from 12 patients who had had surgery for CRC were enrolled in this study. The cohort was divided into two groups. The first (experimental) group included six patients who had peritoneal carcinomatosis as disease progression after radical surgery or combined treatment. The second (control) group consisted of 6 patients with CRC, who were not diagnosed with peritoneal carcinomatosis after radical surgery during the follow-up period (range 23 - 37 months). The level of CD44 expression was determined by immunohistochemical method. Formalin-fixed, paraffin-embedded blocks of tumor tissues were sliced into 4 |im-thick sections using a microtome. For the detection of CD44 mouse monoclonal antibody to human CD44 (clone ID 1C11H1, Sino Biological Inc) was used as the primary antibody. The immune reaction was visualized with PolyVue detection system and DAB chromogen (Diagnostic BioSystems). The level of CD44 immunoreactivity was assessed based on staining intensity and number of cells with positive staining. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 6.05 software. We used Fisher's exact test to determine the significance of the differences between proportions.

Results. In the first group of patients with CRC who developed peritoneal carcinomatosis there was a positive immunohistochemical staining for CD44 in malignant cells in 5 (83.3%) cases. Low level expression of the marker prevailed. Instead, in the second group, in 5 (83.3%) patients without peritoneal carcinomatosis there was negative immunohistochemical reaction for CD44 in tumor cells and only one (16.7%) patient had positive reaction. A high level expression of the marker was not noted in any of the investigated tumor tissue samples. Positive staining for the marker in cells of stroma and inflammatory infiltrate did not take into account. Thus, the statistically significant (p = 0.04) difference was found in the expression of CD44 in patients with and without peritoneal carcinomatosis of colorectal origin. Molecular predictors of peritoneal carcinomatosis such as CD44 could greatly facilitate identifying patients at high risk and contribute to tailoring more accurate follow-up schemes, and more adequate individualized treatment.

Conclusions. According to our research, expression of CD44 marker have emerged as have emerged as a useful predictor of metachronous peritoneal carcinomatosis after curative surgery for colorectal cancer. Further research on the biological aspects of the disease will enhance understanding of the individual features of natural history of colorectal cancer and expand opportunities for treatment of patients.

Keywords: immunohistochemical analysis, CD44, colorectal cancer, peritoneal carcinomatosis, surgical treat-

Рецензент- проф. Бойко Н. I.

Стаття надшшла 25.10.2015 року