CC BY
70
УДК 57.033+57.086.1+57.087.3+611.08+616.005.3 Оригинальная статья
ИМПРЕГНАЦИЯ МИКРОГЛИОЦИТОВ СОЛЬЮ СЕРЕБРА НА ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ
ГИППОКАМПА КРОЛИКОВ
В.И. Казьмин - ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» ФМБА России, старший научный сотрудник, кандидат медицинских наук; А.В. Даценко - ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» ФМБА России, заведующий лабораторией экспериментальной патологии и статистического прогнозирования, доктор медицинских наук.
MICROGLIOCYTE ARGENTATION ON HISTOLOGICAL SECTIONS OF HIPPOCAMPUS
OF RABBITS
V.I. Kazmin - Federal Medical and Biophysical Center n.a. A.I. Burnazyan of Federal Medical Biological Agency, Senior Researcher, Candidate of Medical Sciences; A.V. Datsenko - Federal Medical and Biophysical Center n.a. A.I. Burnazyan of Federal Medical Biological Agency, Head of the laboratory experimental pathology and statistical prediction, Doctor of Medical Sciences.
Дата поступления — 18.11.2016 г. Дата принятия в печать — 08.12.2016 г.
Казьмин В.И., Даценко А.В. Импрегнация микроглиоцитов солью серебра на гистологических срезах гиппокампа кроликов. Саратовский научно-медицинский журнал 2016; 12(4): 692-695.
Цель: получение морфологических данных по выявлению микроглиоцитов на гистологических срезах гип-покампов кроликов с помощью импрегнации солью серебра. Материал и методы. Гистологические срезы гип-покампов кроликов импрегнировали солью осажденного серебра. С использованием метода Рио-Гортега для выявления волокнистой глии подобран необходимый химический состав и кислотно-щелочные параметры раствора серебра и его восстановителя для выявления микроглиоцитов. Результаты. На гистологических срезах гиппокампа контрастно выявляли микроглиоциты с ветвистыми отростками и безотростчатые клетки с тонкими жгутиками. Заключение. В выездных экспериментах, проводимых в натурных условиях, решающее значение имеет проведение медико-биологических исследований в кратчайшие сроки. Необходимо получить не только результаты функциональных исследований, но и подтверждающие их морфологические данные. Представленный способ импрегнации микроглиоцитов может быть использован как экспресс-метод при морфологическом исследовании нарушений кровообращения головного мозга и развития гипоксии нервной ткани.
Ключевые слова: головной мозг, кролики, импрегнация, микроглиоциты, астроциты, гипоксия.
Kazmin VI, Datsenko AV. Microgliocyte argentation on histological sections of hippocampus of rabbits. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2016; 12(4): 692-695.
Purpose: to obtain morphological data to identify microglia on histological sections of hippocampus of rabbits using silver salt impregnation. Material and methods. Histological sections of hippocampus of rabbits impregnated with salt deposited silver. Using the Rio Hortega method for detecting fibrous glia, choose the desired chemical composition and acid-base parameters of the silver solution and reducing agent for the detection of microglia. Results. In histological sections of the hippocampus revealed microglia contrast with branched spikes and cells without shoots with thin flagellums. Conclusion. In visiting the experiments carried out in natural conditions, it is crucial to conduct biomedical research in the shortest possible time. We need to get not only the functional results of research, but also by their morphological, substantiating the data. The present method of impregnation microglia can be used as a rapid method for the morphological study of cerebral blood flow and neural tissue hypoxia.
Key words: brain, rabbits, impregnation, microglia, astrocytes, hypoxia.
Введение. Функциональные изменения, не связанные с органическими повреждениями головного мозга, часто происходят от нарушений его кровоснабжения и развития гипоксии нервной ткани. От этого страдают многие функции, связанные со структурами гиппокампа. Среди них выделяют участие в механизмах мотивации и эмоций, вегетативных реакций, в организации поведения, механизмах памяти [1]. Имеются убедительные данные о значении гиппокампа в возникновении эпилепсии [2]. Повреждение гиппокампа отрицательно влияет на когнитивное и ориентировочно-исследовательское поведение, как у животных, так и у человека: резко ухудшается краткосрочная память, затрудняются процесс обучения, ориентация во времени и пространстве [3]. В цепочках нервных клеток зубчатых извилин осуществляется нейрогенез. Наряду с корой больших полушарий гиппокамп одним из первых некротизиру-ется при увеличении тяжести гипоксии, ишемии. При нарушении мозгового кровообращения отмечается особая ранимость пирамидных слоев зоммеровского сектора гиппокампа [4, 5].
Ответственный автор - Казьмин Владимир Иванович Тел. (сот.): +79168410961 E-mail: lab92@mail.ru
Гиппокамп является удобной областью для морфологического исследования, так как имеет хорошо обозначенное послойное строение с выделением участков преимущественного расположения клеток или проводящих элементов нервной ткани. Во всех слоях гиппокампа обильно представлены сосуды микроциркуляторного русла. В экспериментах на животных после воздействия физических факторов о развитии гипоксического состояния нервной ткани можно судить по реакции клеток нейроглии, окружающих сосуды. Эти клетки, представленные популяциями астроцитов и микроглиоцитов, проявляют высокую чувствительность к недостатку кислорода, поступающего в нервную ткань. Нарушение кровоснабжения приводит к расстройству метаболизма клеток, тесно контактирующих с сосудами. В морфо-функциональном комплексе «нейрон - нейроглия» наиболее мобильными, меняющими внешний вид, являются глиальные клетки [6]. Появляются новые видоизмененные клеточные формы, которые можно выделить на гистологических срезах с помощью метода импрегнации серебром. Волокнистые астро-циты хорошо импрегнируются подкисленным раствором азотнокислого серебра с восстановлением в слабом растворе гидрохинона. Эти клетки, находящиеся в функциональной связи с нейронами и сосудами,
отличаются по набору внутриклеточных органоидов от клеток микроглиальной популяции.
Для импрегнации микроглиоцитов используют соли углекислого или другого осажденного серебра и менее оксидированные восстановители [7]. Эти методики требуют соблюдения многих условий и длительны в проведении до конечного результата. В настоящее время отдельные авторы применяют им-муноцитохимические методы с использованием по-ликлональных антител к антигену Iba-1 с целью выявления микроглиоцитов [8]. Для их использования необходимо специальное оборудование и особые реактивы, что ограничивает широкое применение.
При проведении морфологических исследований в выездных экспериментах в натурных условиях помимо мобильного лабораторного комплекса[9] нужны надежные морфологические экспресс-методы окраски структур на гистологических срезах. В этих условиях решающее значение имеют сроки проведения медико-биологических исследований. Важно получить не только результаты функциональных исследований, но и подтверждающие их морфологические данные. Качественная импрегнация гистологических срезов должна осуществляться минимальным количеством доступных реактивов и занимать небольшой отрезок времени.
Взяв за основу метод Рио-Гортега (Rio Hortega) для выявления волокнистой глии, подобрали необходимый химический состав и кислотно-щелочные параметры раствора серебра и его восстановителя для выделения микроглиоцитов.
Цель: выявление микроглиоцитов на гистологических срезах гиппокампов кроликов с помощью импрегнации солью серебра.
Материал и методы. При патологоанатомиче-ском вскрытии у пяти интактных кроликов выделяли головной мозг и фиксировали его в 10%-ном нейтральном формалине. От извлеченных гиппокампов вырезали кусочки толщиной 3-4 мм для получения поперечных срезов, отмывали водопроводной водой в течение 1,5 ч и резали на замораживающем микротоме, последовательно помещая в две порции дистиллированной воды. Срезы гиппокампа наносили на предметные стекла и на 1,5-2 мин наливали пипеткой импрегнационный раствор (первые признаки пожелтения срезов появляются через 40-50 с).
Приготовление раствора серебра: а) к 4 мл 8%-ного раствора азотнокислого серебра прибавляли 2 мл 0,5%-ного раствора бромистого аммония, выпадал осадок белого цвета, раствор становился мутным; б) добавляли при помешивании 7-8 капель крепкого аммиака, в результате формировался осадок и раствор просветлялся не полностью; в) раствор фильтровали до прозрачного состояния, рН10,4. Данного количества раствора было достаточно для обработки 7-8 предметных стекол со срезами.
После импрегнации срезы быстро (5-10 с) помещали в 2-3 порции дистиллированной воды и последовательно переносили в 2-3 емкости с 1%-ным подкисленным раствором формалина на водопроводной воде (к 50 мл раствора добавляли 2-3 капли 1%-ной уксусной кислоты). В первых порциях формалина от срезов отделялись мутные облачка и на поверхности срезов, в зависимости от их толщины, проявлялись темно-желтые, коричневые или серо-коричневые контуры слоев гиппокампа. Переносили срезы в третий раствор формалина на 2-5 мин, при этом должен сохраняться четкий послойный рисунок гиппокампа. Ополаскивали срезы в дистиллирован-
ной воде и помещали на 5-10 мин в 5%-ный раствор гипосульфита. Срезы промывали в водопроводной воде и наклеивали на предметные стекла с адгезивным покрытием, стекла подсушивали на воздухе или в термостате.
Необходимо отметить, что количество добавленного аммиака имело решающее значение. Поэтому предварительно импрегнировали 2-3 гистологических среза. В случае если преобладал темно-коричневый фон с единичными фрагментами микро-глиоцитов, на конце стеклянной палочки в раствор добавляли аммиак. Для контрастного выделения микроглиоцитов эту процедуру повторяли 2-3 раза. При избытке аммиака импрегнируются сосуды и пирамидные клетки. Для восстановления импрегнации микроглиоцитов прибавляли две капли раствора серебра и одну каплю бромистого аммония. Помутневший раствор фильтровали.
Готовили постоянные микропрепараты по общепринятой методике или использовали их как временные препараты, покрывая вазелиновым или тер-пеновым маслом для последующей микроскопии. Оставшийся или приготовленный и не использованный импрегнационный раствор серебра сохранял свои свойства в течение не менее 7 сут. Процедуры экспериментов на животных соответствовали требованиям Хельсинской декларации 1975 г (пересмотр 1983 г).
Результаты. На гистологических срезах гиппокампов микроглиоциты контрастно выделялись в виде отростчатых и безотростчатых клеток на желтом или светлом желто-коричневом фоне (рис. 1). В зависимости от их функциональной активности плотность импрегнации тел и отростков выглядела различной. В секторах, разделяющих поля пирамидного слоя, клетки были распределены неравномерно. По мере удаления от поля СА-1, где отмечается основная концентрация отростчатых клеток, количество микроглиоцитов уменьшалось. В поле СА-3 чаще встречались безотростчатые клеточные формы. Наиболее объемные клетки с множеством длинных ветвящихся отростков находились в радиарных слоях около сосудов между апикальными дендритами пирамидных клеток (рис. 2). На основных отростках, отходящих от тел, располагались более короткие прямые ответвления, также дающие несколько выростов. При больших увеличениях конечные отрезки разветвлений выглядели в виде шипиков, кисточек,
Рис. 1. Радиарные слои гиппокампа. Волокнистые микроглиоциты. Импрегнация серебром. Ув. об. x16
Рис. 2. Радиарные слои гиппокампа. Ветвистые отростки микроглиоцитов. Импрегнация серебром. Ув. об. x40
Рис. 3. Радиарные слои гиппокампа. Концевые отростки: а - шипики; б - кисточки. Импрегнация серебром. Ув. об. x40, x100 (а, б)
Рис. 4. Радиарные слои гиппокампа. Различные формы тел Рис. 5. Микроглиоциты в слое зернистых клеток зубчатых микроглиоцитов. Импрегнация серебром. Ув. об. x40 извилин. Импрегнация серебром. Ув. об. x40
уплощенных фигур (рис. 3). Клетки с ветвистыми отростками часто группировались в верхней половине радиарных слоев, примыкая к апикальным отделам пирамид. Форма тел микроглиоцитов была крайне разнообразной и соответствовала описаниям, представленным в работах по морфологическим исследованиям этих клеток [10] (рис. 4). В клеточных слоях гиппокампов (пирамидные, зернистые) ядра микроглиоцитов были округлыми или овальными с изогнутыми, ветвистыми отростками (рис. 5). В промежутках между микроглиоцитами наблюдали отдельные фрагменты ветвистых отростков клеток, попавших в срез из выше- и нижележащих участков.
На границе радиарного и лакунарного слоев вдоль стенок сосудов отдельно и в виде цепочек выстраивались безотростчатые клетки. Форма их часто была овальной с вытянутыми концевыми отделами, от которых отходили тонкие жгутики (рис. 6). В белом веществе гиппокампа (лоток, бахромка), а также на поверхности сосудов других его слоев импрегниро-вались волокнистые структуры и длиннолучистые астроциты.
Обсуждение. Для объективной оценки изменений поведенческих реакций животных необходимы морфологические данные, подтверждающие нарушения микрогемоциркуляции определенных участков головного мозга. Нужные сведения можно получить, ана-
лизируя морфологические формы нейроглиальных клеток, находящихся в тесном контакте с сосудами. Применяя предложенный способ импрегнации, на гистологических срезах гиппокампов выделяют отрост-чатые и безотростчатые микроглиоциты и астроциты, сосуды с форменными элементами крови. Быстрое
Рис. 6. Лакунарные слои гиппокампа. Безотростчатые клетки с концевыми жгутиками. Импрегнация серебром. Ув. об. x40
приготовление необходимых растворов из доступных реактивов и небольшие временные затраты для получения гистологических препаратов для микроскопии позволяют оперативно приобретать необходимую информацию о нарушениях кровоснабжения головного мозга и развитии гипоксии нервной ткани.
Применение данного метода импрегнации дает возможность выявлять не только структурные перестройки клеток, но и их функциональные изменения. Плотность импрегнации возрастает при напряженном состоянии нервной ткани. Уменьшение поступления кислорода в ткани головного мозга активизирует перестройку метаболизма клеток нейроглии, что вызывает их трансформацию и изменяет плотность импрегнации серебром. Используя индикаторные свойства клеток нейроглии по отношению к дефициту кислорода, можно оценивать степень развившейся гипоксии нервной ткани головного мозга.
Заключение. Тщательное морфологическое изучение нейроглиальных клеток головного мозга у интактных животных является залогом успешного проведения сравнительного анализа с аналогичными клетками, находящимися в условиях дефицита поступающего кислорода. Морфологические данные могут быть использованы в экспериментальных исследованиях, где просматривается связь между появлением новых клеточных форм или активной их деструкцией с выявленными функциональными нарушениями. Проведение функциональных проб с экспериментальными животными после воздействия различных факторов и получение морфологических данных, подтверждающих развитие гипоксическо-го состояния нервной ткани головного мозга разной степени выраженности, служат дополнительными аргументами для выводов об эффективности или опасности их влияния на живой организм.
Конфликт интересов не заявляется.
Авторский вклад: концепция и дизайн исследования, получение и обработка данных, написание статьи - В.И. Казьмин; анализ и интерпретация результатов - В.И. Казьмин, А.В. Даценко; утверждение рукописи - А.В. Даценко.
References (Литература)
1. Arushanyan EB. Place of hippocampus in bioritmological organization of conduct. Successes of physiological sciences
2001; 32(1): 79-95. Russian (Арушанян Э.Б. Место гиппокампа в биоритмологической организации поведения. Успехи физиологических наук 2001; 32(1): 79-95).
2. Sinitskiy VN. Convulsive activity and mechanisms of epileptic attacks (kliniko-experimental research). Kiev: Naukova dumka, 1976; 180 p. Russian (Синицкий В.Н. Судорожная активность и механизмы эпилептических припадков (клинико-экспериментальное исследование). Киев: Наукова думка, 1976; 180 с.).
3. Sokolova IB, Gilerovich EG, Pavlichenko NN, Polyntsev DG. The morphological changes in the hippocampus of rats after the trauma of cerebrum. Cell Technologies in Biology and Medicine 2011; (4): 196-199. Russian (Соколова И.Б., Гилеро-вич Е.Г, Павличенко Н.Н., Полынцев Д.Г. Морфологические изменения в гиппокампе крыс после травмы головного мозга. Клеточные технологии в биологии и медицине 2011; (4): 196199).
4. Bragina NN. The clinical syndromes of defeat of hippocampus. M.: Medicine, 1974; 216 p. Russian (Брагина Н.Н. Клинические синдромы поражения гиппокампа. М.: Медицина, 1974; 216 с.).
5. Vinogradova OS. Hippocampus and memory. M.: Nauka, 1975; 239 p. Russian (Виноградова О.С. Гиппокамп и память. М.: Наука, 1975; 239 с.).
6. Hudoerkov rM, Voronkov DN. Quantification of neurons and glia by computer morphometry. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2010; 149(1): 109-112. Russian (Худоер-ков Р.М., Воронков Д.Н. Количественная оценка нейронов и нейроглии с помощью компьютерной морфометрии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2010; 149(1): 109-112).
7. Romeys B. Microscopic technique. Moscow: Foreign Literature Publishing House, 1953; 718 p. Russian (Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Издательство иностранной литературы, 1953; 718 с.).
8. Korzhevskiy DE, Otellin VA, Grigor'ev IP, et al. Structural organization of astrocits of hippocampus in a postischemic period. Morphology 2004; 125(2): 19-21. Russian (Коржевский Д.Э., Отеллин В.А., Григорьев И.П. и др. Структурная организация астроцитов гиппокампа в постишемиче-ский период. Морфология 2004; 125(2): 19-21).
9. Datsenko AV, Kazmin VI. Complex microscopic express-analysis for biomedical full-scale investigation. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2013; 9(4): 805-808. Russian (Даценко А.В., Казьмин В.И. Комплекс микроскопического экспресс-анализа для проведения медико-биологических исследований в натурных условиях. Саратовский научно-медицинский журнал 2013; 9(4): 805-808).
10. Dumbay VN. Structure and glial function: The manual for the course "Human and animal physiology". Rostov-on-Don, 2007; 30 p. Russian (Думбай В.Н. Структура и функции глии: учеб. пособие по курсу «Физиология человека и животных». Ростов-на-Дону, 2007; 30 с.).
