CC BY
15Cellular Therapy and Transplantation (CTT). Vol. 6, No. 3 (20), 2017 Submitted: 31 August 2017, accepted: 29 September 2017
Impact of Post-Transplant Cyclophosphamide after Hematopoietic stem cell transplantation on chimerism in T-regulatory cells
Darya S. Dubnyak1, Natalya V. Risinskaya1, Mikhail Y. Drokov1, Natalia S. Kostritsa2, Julia O. Davydova1, Larisa A. Kuzmina1, Vera A. Vasilyeva1, Natalia N. Popova1, Ekaterina D. Mikhaltsova1, Olga M. Koroleva1, Nikolay М. Kapranov1, Zoya V. Konova1, Irina V. Galtseva1, Andrey B. Sudarikov1, Elena N. Parovichnikova1, Valery G. Savchenko1
'National Research Center for Hematology, Moscow, Russian Federation 2School of Medicine, Lomonosov Moscow State University
Contact: Dr. Mikhail Yu. Drokov E-mail: [email protected]
Introduction
Immunological incompatibility between donor and recipient is the main cause of alloimmune complications after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). A key role of T-regulatory cells (Treg) is supporting immunological tolerance after transplantation. This cell population prevents the development of acute graft-versus host disease (aGVHD). Activation of T cells occurs on day +3,+4 after allo-HSCT that is associated with T cell-mediated recognition of the peptides presented by donor (direct allorecog-nition) or recipient (indirect allorecognition) antigen-presenting cells. Over last years, post-transplant regimen with high-dose cyclophosphamide (PTCy) at 50 mg/kg (day +3 and +4) becomes a widespread immunosuppressive treatment which leads to GVHD prevention, due to deletion of alloreactive T-cells. However, its influence upon other subpopulations has not been studied yet. Our aim was to evaluate an impact of a high-dose PTCy after hematopoietic stem cell transplantation upon chimerism in T-regulatory cell population.
Patients and methods
The analysis included 27 patients after allo-HSCT (ALL, n=6; AML, n=20; CMML, n=l). Detailed characteristics of the group are presented in Table '. Peripheral blood samples were collected by the day +30 after allo-HSCT. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCS) were isolated using a fi-coll density gradient (1.077 g/L). CD4+CD25+ cells (T-reg cells) were isolated by means of immunomagnetic separation (CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, Milteney Bio-tec, Germany). A control test for "purity" of the enriched
Q1 CD4+CD25+
105 0.00% 94.2%
104 • ■ * •
103 " • m lg?
102
. * • * , *
0 Q4 Q3
* 0.00% 5.78%
0 102 103 104 105 CD4
Figure 1. A control test for "purity" of the enriched Treg cell population performed using flow cytometry
cell population was performed in some patients using flow cytometry (Figure 1). DNA extraction from cell suspension was carried out using DNA/RNA isolation kits "Ampli Prime RIBO-prep". Gene chimerism in DNA samples was assessed by the STR-PCR analysis (polymerase chain reaction with a panel of primers for loci of short tandem repeats). The percentage of donor chimerism was calculated using standard formulas. Statistical analysis was performed using SPSS ver 23. (IBM, Chicago,Ill., USA). A Mann-Whitney U test was used for nonparametric data analysis. Fisher's exact test was used for 2x2 tables. A p-value less than 0.05 was considered as significant.
Results
Data on genetic chimerism in T-reg cell populations are presented in Figure 2. The proportion of host hemopoiesis is significantly lower in T-reg cells in case of using PTCy on
day +3, +4, in contrast to classical immunosuppressive regimen (p=0,03*). A median proportion of these cells with host genotype (with interquartile interval) was 0% (0-2.5%) with PTCy, and 10% (5-27%) after standard immunosuppressive therapy.
Treg chimerism on day +30
p-ew
60
50
m * *
RIC MAC
RIC MAC
40
30
20
10
0
+PT/CY Classic IST
Immunosupression type
Figure 2. Chimerism in T-reg cells in case of using PTCy at +3, +4 day in contrast with classical immunosuppressive regimen
Conclusion
Using of PTCy is considered to decrease GVHD rate even in case of sufficient HLA mismatch between patient and donor. However, the mechanism of this phenomenon is still unknown. PTCy leads to deletion of alloreactive T cells as shown by several authors. In present study, we have revealed that PTCy caused deletion of T-regulatory cells, as seen from the course of post-transplant recovery of T-reg, due to predominance of donor cell genotype in the PTCy group.
Table 1. Clinical characteristics of the groups
Keywords
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, post-transplant high dose cyclophosphamide, chimerism, T-regulatory (Treg) cells, graft-versus host disease.
PTCy (n=6) Standard immunosuppressive therapy (n=21) p-value
Age, years, Mediana (range) 34 (19-58) 38 (22-66) 0.643
Gender, n
Male 4 9 0.385
Female 2 12
Donor, n
Unrelated 4 12 >0.99
Sibling 2 9
HLA compatibility,n
HLA matched 2 21 0.001*
HLA mismatched 4 -
Влияние посттрансплантационного циклофосфамида на химеризм в популяции Т-регуляторных клеток у пациентов после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток
Дарья С. Дубняк1, Наталья В. Рисинская1, Михаил Ю. Дроков1, Наталья С. Кострица2, Юлия О. Давыдова1, Лариса А. Кузьмина1, Вера А. Васильева1, Наталья Н. Попова1, Екатерина Д. Михальцова1, Ольга М. Королева1, Николай М. Капранов1, Зоя В. Конова1, Ирина В. Гальцева1, Андрей Б. Судариков1, Елена Н. Паровичникова1, Валерий Г. Савченко1
'ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр гематологии МЗ России, г. Москва
Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова
PTCy (n=6) Standard immunosuppressive therapy (n=21) р-value
Conditioning regimen, n
RIC 3 11 >0.99
MAC 3 10
Stem cell source, n
Bone marrow 4 11 0.662
Peripheral blood 2 10
GvHD prophylaxis, n
PTCy +CSA + MMF 4 -
MMF+CSA+MTX - 19
CSA +МТХ - 2
PTCy 2 -
Введение
Главной причиной развития аллоиммунных осложнений после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) является проблема иммунологической несовместимости пары донор-реципиент. Т-регуляторные клетки (Т-рег) играют важную роль в поддержании толерантности после трансплантации. Известно, что именно эта популяция клеток препятствует развитию острой реакции трансплантат против хозяина (оРТПХ). Активация Т-клеток после алло-ТГСК происходит преимущественно на +3,+4 день и связана с распознаванием Т-клетками пептидов, презентируемых донорскими («прямое аллогенное распознавание») или хозяйскими («непрямое аллогенное распознавание») антиген-презентирующими клетками. В настоящее время у больных гемобластозами после ал-ло-ТГСК с целью преодоления иммунологической несовместимости пары донор-реципиент широко применяется циклофосфамид в дозе 50 мг/кг на +3, +4 день после трансплантации (пост-ЦФ). Как известно, его использо-
вание ведет к делеции аллореактивных Т-клеток эффекторов в эти сроки, что же касается других субпопуляций Т-клеток, то его влияние на них изучено недостаточно. Целью работы была оценка влияния пост-ЦФ на химеризм в популяции Т-рег у пациентов после алло-ТГСК.
Пациенты и методы
В исследование были включены 27 пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга (ОЛЛ n=6, ОМЛ n=20, ХММЛ n=1). Подробная характеристика групп представлена в Таблице 1. На +30 день после ал-ло-ТГСК у всех пациентов, вошедших в данное исследование, был произведен забор периферической крови. Далее было проведено выделение мононуклеаров с использованием градиента плотности фиколла (1,077 г/л). Посредством высокоактивной магнитной сепарации (CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Германия) была выделена популяция клеток, имеющих фенотип CD4+CD25+, который преимущественно ассоциирован с Т-рег клеткам. На данном этапе у части
пациентов был выполнен контроль чистоты обогащенной популяции с использованием проточной цитоме-трии (Рис. 1). Далее из полученной клеточной суспензии была произведена экстракция ДНК с использованием наборов для выделения ДНК/РНК «Ампли Прайм РИ-БО-преп». Химеризм в образцах ДНК определялся при помощи метода STR-PCR (полимеразная цепная реакция с панелью праймеров к локусам коротких тандемных повторов (short tandem repeat) человека. Процент донорского химеризма вычислялся с помощью стандартных формул. Статистический анализ данных проводился с использованием SPSS ver 23. (IBM, Chicago,Ill., USA). Для оценки статистической значимости различий между двумя независимыми выборками использовался U-кри-терий Манна-Уитни. Для анализа таблиц сопряженности 2x2 использовался точный тест Фишера. Различия признавались значимыми при p<0,05.
Результаты
Данные по химеризму в популяции Т-рег представлены на Рис. 2. Показано, что при использовании пост-ЦФ на +3,+4 день в Т-рег доля хозяйского кроветворения значимо ниже (р=0,03*), чем у пациентов, которым проводилась стандартная иммуносупрессивная терапия. При применении пост-ЦФ медиана доли Т-рег с хозяйским генотипом (с межквартильным интервалом) составила 0% (0-2,5%), при применении стандартной иммуносу-прессивной терапии - 10% (5-27%).
Заключение
Широкое применение пост-ЦФ позволило достичь значительного снижения частоты РТПХ даже у пациентов с выраженными различиями по системе HLA. Однако механизмы, которые приводят к этим эффектам, до конца не известны. Наше исследование показывает, что использование пост-ЦФ приводит не только к делеции аллореактивных Т-клеток эффекторов на +3,+4 день после алло-ТГСК, как было показано другими авторами ранее, но также и к делеции Т-регуляторных клеток, что проявляется при их реконституции: а именно преимущественном восстановление Т-рег за счет клеток донорского генотипа в группе пост-ЦФ.
Ключевые слова
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, высокодозный циклофосфамид, химеризм, Т-регуля-торные клетки, реакция трансплантат против хозяина.
