CC BY
142
Оксана Андреевна Богомолова', Николай Николаевич Тупицын2, Валерий Витальевич Родионов3, Влада Владимировна Кометова4, Мария Валерьевна Родионова5
ИММУНОЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ ДИССЕМИНИРОВАННЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В КОСТНОМ МОЗГЕ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
' Аспирант, кафедра онкологии и лучевой диагностики Ульяновского государственного университета
(432017, РФ, г. Ульяновск, ул. Льва Толстого, д. 42) 2 Д. м. н., профессор, заведующий, лаборатория иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (''5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 Д. м. н., профессор, заведующий, кафедра онкологии и лучевой диагностики Ульяновского государственного
университета (432017, РФ, г. Ульяновск, ул. Льва Толстого, д. 42)
4 К. м. н., врач, отделение патологической анатомии Областного клинического онкологического диспансера
(432063, РФ, г. Ульяновск, ул. '2 Сентября, д. 90) 5 Аспирант, хирургическое отделение № 5 НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (''5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 432063, РФ, г. Ульяновск, ул. Кирова, д. 50, кв. 55, Богомолова Оксана Андреевна; e-mail: [email protected]
В исследование включены 50 больных раком молочной железы I—IV стадии. Костный мозг изучали как стандартными морфологическими методами, так и с помощью проточной цитометрии с применением моноклональных антител к EpCAM (CD326). Предварительно проведено иммуномагнитное обогащение клеток, связывающих антитела к EpCAM. За пороговый диагностический уровень принято считать обнаружение 1 опухолевой клетки среди 1 млн миелокариоцитов. При цитологическом и гистологическом исследованиях метастазы в костном мозге выявлены у 1 (2%) и 2 (4%) пациенток соответственно. Методом проточной цитометрии подтвердилось поражение костного мозга в обоих случаях. Метод значительно увеличил частоту выявления микрометастазов и диссеминированных опухолевых клеток: они были обнаружены у 11 (22%) из 50 пациенток. По нашему мнению, проточная цитометрия с предварительным им-муномагнитным обогащением клеток с применением моноклональных антител к EpCAM (CD326) может быть методом выбора для выявления диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге.
Ключевые слова: рак молочной железы, диссеминированные опухолевые клетки в костном мозге, микрометастазы, проточная цитометрия.
Диагностика гематогенного распространения эпителиальных опухолей на ранних стадиях — одна из главных проблем онкологии. Единичные разрозненные опухолевые клетки морфологически не определяются — для этого требуется применение высокочувствительных иммунологических методов. К таким методам в настоящее время относятся иммуноцитологические (иммуноци-тохимический, проточная цитометрия) и молекулярно-биологические (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) методы. В клинической практике пока не найдены методы обнаружения микрометастазов. Методы исследования костного мозга (КМ) нуждаются в дальнейшем развитии. Однако накапливаются данные
© Богомолова О. А., Тупицын Н. Н., Родионов В. В.,
Кометова В. В., Родионова М. В., 2014
УДК 618.19-006.6-033.2:616.71-018.46:616-076.5
о том, что количественное определение и характеристика диссеминированных опухолевых клеток (ДОК) позволяют получить важную прогностическую информацию и проводить мониторинг эффективности терапии. Стандартизация методов исследования и обеспечение их приемлемой чувствительности и специфичности позволит сделать еще один шаг к индивидуализации антиметастатической терапии [1; 2].
Целью настоящей работы явилось установление степени гематогенной диссеминации рака молочной железы (РМЖ) на основании обнаружения ДОК высокочувствительным иммуноцитологическим методом с применением моноклональных антител к эпителиальным антигенам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы материалы клинического, морфологического и иммуноцитологического обследо-
вания 50 больных РМЖ, находящихся на лечении в ГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» (г. Ульяновск) с ноября 2011 г. по настоящее время.
В исследуемую группу вошли женщины в возрасте от 33 до 74 лет, средний возраст составил 56,7 ± 10,5 года. На момент постановки первичного диагноза пациентки распределились по стадиям следующим образом: I стадия диагностирована у 4 (8%) больных, НА — у 11 (22%), ПВ — у 9 (18%), ША — у 5 (10%), ШВ — у 7 (14%), ЕЮ— у 9 (18%), IV — у 5 (10%). В репродуктивном возрасте находились 8 (16%) пациенток, в состоянии менопаузы — 42 (74%).
Наиболее частым гистологическим вариантом был инфильтративный протоковый рак (36%). Отмечена высокая частота инфильтративного смешанного рака (30%). Реже встречались инфильтративный дольковый рак — 20% и другие формы рака (медуллярный, папиллярный, тубулярный, слизистый) — 14%.
Больным проведено стандартное клиническое обследование. Исследование КМ до начала лечения выполняли как стандартными методами — цитологическим и гистологическим, так и методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител к EpCAM (CD326). Материал для цитологического исследования и проточной цитометрии получали с помощью стернальной пункции. Объем костномозгового пунктата не превышал 0,5 мл, так как при большем объеме возрастала вероятность разбавления образца периферической кровью. Подсчет клеток миелограммы и их анализ производили в клинической лаборатории. Для гистологического исследования выполняли трепанобиопсию задневерхней ости подвздошной кости с двух сторон. Проточную ци-тометрию проводили на базе лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. Исследование выполняли в координатах CD45/CD326. Предварительно проведено иммуномагнитное обогащение клеток, связывающих антитела к CD326 (EpCAM). Это позволило оценивать почти 50 млн миелокариоцитов у одной больной. За пороговый диагностический уровень принято считать обнаружение 1 опухолевой клетки среди 1 млн миелокариоцитов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При цитологическом и гистологическом исследованиях метастазы в КМ выявлены у 1 (2%) и 2 (4%) из 50 пациенток соответственно. У первой пациентки метастазы обнаружены обоими морфологическими методами. При этом IV клиническая стадия у нее установлена до обнаружения метастатических клеток в КМ (T4N3cM1, метастазы в легких, плевре, печени). При гистологическом исследовании трепанобиоптатов подвздошной кости у данной больной выявлено двустороннее поражение КМ (рис. 1).
В другом случае исходная стадия заболевания расценена как ЕЮ (T4N3aM0), и после гистологического обнаружения метастазов в КМ проведена переоценка стадии с изменением ее на IV. При дополнительной остеосцин-тиграфии у этой пациентки выявлены множественные остеопластические метастазы в костях, не подтвержденные рентгенологически.
У обеих пациенток метастазы в КМ подтверждены методом проточной цитометрии. Кроме того, у 5 (10%)
Рисунок 1. Микрофотография метастаза инфильтрирующего РМЖ в КМ подвздошной кости у больной М., 53 лет.
Красной линией показано место инвазии клеточного КМ опухолевыми клетками.
из 50 пациенток в миелограммах обнаружены «единичные недифференцированные клетки неясного происхождения, возможно, негемопоэтической природы». Эти клетки были расценены как подозрительные на метастатические. У 2 из 5 больных микрометастазы в КМ подтверждены методом проточной цитометрии.
Кроме того, у 9 (18%) из 50 больных в трепанобиопта-тах обнаружены единичные плазматические клетки или микроочаговое их скопление. Это служит косвенным признаком поражения КМ. При проточной цитометрии у 2 из этих 9 пациенток обнаружены микрометастазы.
Единичные эпителиальные (опухолевые) клетки в образцах КМ выявлены у 8 (16%) из 50 пациенток с помощью проточной цитометрии с применением моноклональных антител к ЕрСАМ (CD326). Важно, что количество опухолевых клеток, определяемых иммуноцитологически, было очень небольшим — от 1 до 10 (в одном случае — 44) на 1 млн миелокариоцитов. Четкий кластер опухолевых клеток — микрометастаз — при проточной цитометрии диагностирован у 4 (8%) из 50 пациенток (рис. 2). При этом в 3 случаях число клеток было менее 1 на 1 млн ми-елокариоцитов.
Таким образом, метод проточной цитометрии в сочетании с иммуномагнитным обогащением популяции опухолевых клеток позволил диагностировать микрометастазы у 11 (22%) из 50 больных.
Нами проанализирована связь между наличием ДОК в КМ и некоторыми клинико-лабораторными данными, биологическими свойствами первичной опухоли и статусом регионарных лимфатических узлов. Наибольшая частота определения микрометастазов и самое высокое среднее число ДОК на 1 млн миелокариоцитов отмечены при IV стадии (11,4 ± 8,34 клетки), наименьшее (0) — при I и ШС стадиях. В целом проточная цитометрия позволила определить ДОК в КМ у 80 и 15,5% больных РМЖ со стадиями М1 и М0 соответственно. Не обнаружено статистически достоверной взаимосвязи между метастазировани-ем РМЖ в КМ и менструальной функцией пациентки.
104
103
102
101
100
Рисунок 2. Цитограмма больной Б., 74 лет, c РМЖ IIB стадии с микрометастазом в КМ, выявленным методом проточной цитометрии. R1 — «кластер» из 20 CD45-негативных клеток (ось абсцисс), положительных в реакции с антителами к EpCAM (CD326) (ось ординат). По оси абсцисс — уровни экспрессии лейкоцитарного антигена CD45. По оси ординат — уровни экспрессии эпителиального антигена EpCAM.
В нашем исследовании морфологические варианты РМЖ не влияли на диагностику ДОК в КМ: частота выявления ДОК при инфильтративном дольковом раке составила 40%, при инфильтративном протоковом раке — 27,8%, при инфильтративном смешанном раке — 13,3%, при других формах рака ДОК не были выявлены.
Статистически значимой связи между частотой выявления ДОК и размером, степенью злокачественности, рецепторным статусом, уровнем экспрессии HER2/ neu, индексом пролиферации Ki-67, воспалительной инфильтрацией и лимфоваскулярной инвазией первичной опухоли не выявлено. Кроме того, отсутствовала связь между микрометастазированием РМЖ в КМ и статусом регионарных лимфатических узлов. По данным одно-факторного дисперсионного анализа ANOVA, статистически значимая корреляция обнаружения ДОК выявлена только для такого фактора прогноза, как суммарный балл злокачественности — СБЗ первичной опухоли (р = 0,009) (рис. 3).
СБЗ — интегральный морфологический прогностический индекс для оценки прогноза эпителиальных злокачественных опухолей. Он оценивается в баллах и складывается из следующих показателей: степень дифференцировки опухоли — наличие в опухолевой ткани структур с отчетливым просветом (1—3 балла); полиморфизм опухолевых клеток (1—3 балла); митоти-ческая активность опухолевых клеток (1—3 балла); ин-фильтративный компонент (1—5 баллов); лимфоидная инфильтрация стромы опухолевого узла (0—3 балла); опухолевые эмболы в сосудах стромы (0—3 балла). СБЗ колеблется в пределах от 6 до 20 баллов. В зависимости
от СБЗ все опухоли можно разделить на 4 группы с различным прогнозом заболевания. Этот индекс разработан ульяновскими патоморфологами в 2009 г. и указывается ими в гистологическом заключении [3].
Полагая, что обнаружение одной изолированной опухолевой клетки может быть диагностически незначимым, ряд исследователей попытались количественно определить «критическую» опухолевую нагрузку, превышение которой было бы достоверно связано с увеличением частоты рецидива заболевания. Показано, что количество рецидивов РМЖ резко возрастает при обнаружении в КМ 10 или 15 изолированных опухолевых клеток [4]. В нашем исследовании не прослежена общая и безрецидивная выживаемость в связи с небольшим сроком от начала исследования. Однако 3 больные РМЖ
IV стадии, у которых были выявлены микрометастазы в КМ, умерли от прогрессирования заболевания в течение 1—12 мес с момента постановки диагноза.
Нами проанализированы миелограммы 50 больных РМЖ. У одной больной с метастазами РМЖ в КМ, обнаруженными обоими морфологическими методами, количество миелокариоцитов было снижено (40 000 мкл-1 при норме 41 600—195 000 мкл-1), гранулоцитарный и эритроидный ростки были относительно сохранны, но среди клеток красного ряда преобладали оксифильные формы (8,6% при норме 0,8—5,6%), отмечено увеличение количества моноцитов (4,2% при норме 0,7—3,1%).
V другой пациентки с метастазами РМЖ в КМ в миело-грамме обнаружены следующие отклонения: сужение гранулоцитарного ростка за счет зрелых форм нейтро-филов, некоторое расширение эритроидного ростка за счет оксифильных форм нормобластов (17,2% при норме 0,8—5,6%), снижение, соответственно, лейкоэри-тробластического отношения (1,2 при норме 2,1—4,5), увеличение количества лимфоцитов (22,8% при норме 4,3—13,7%).
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
А
Б
Рисунок 3. Распределение больных РМЖ в зависимости от СБЗ первичной опухоли и выявления ДОК в КМ. I — больные без ДОК в КМ; II — больные с ДОК в КМ. А. СБЗ 1—2. Б. СБЗ 3—4.
В работе О. В. Крохиной и соавт. [5] сделано предположение, что к наиболее ранним проявлениям реакции КМ на наличие отдельных опухолевых клеток можно отнести следующие изменения кроветворения по данным миело-грамм: гипоклеточность КМ, скопления плазматических клеток, обнаружение крупных клеток с гиперхромным ядром и множественными нуклеолами, повышение лей-коэритробластического отношения, увеличение среднего количества моноцитов и лимфоцитов [5].
При проведении анализа миелограмм выявлено, что в группе больных с микрометастазами снижение кле-точности КМ отмечалось чаще (36,4%), чем у пациенток без метастатического поражения (25,6%; р > 0,05). Содержание лимфоцитов в КМ у больных с микрометастазами было достоверно выше, чем в отсутствие опухолевого поражения КМ (63,6 ± 0,5 и 30,8 ± 0,47% соответственно; р = 0,048). Не исключено, однако, что увеличение количества лимфоцитов было относительным. Обнаружено снижение лейкоэритробластического отношения в группе пациенток с микрометастазами по сравнению с таковым у больных без микрометастазов, но различие статистически незначимо. Увеличение содержания моноцитов чаще наблюдалось в группе больных без микрометастазов (53,8 и 18,2% соответственно).
В анализах периферической крови не обнаружено статистически значимых различий содержания эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и гемоглобина, а также различий других показателей в зависимости от наличия или отсутствия ДОК в КМ.
ОБСУЖДЕНИЕ
Проточная цитометрия может быть методом выбора для оценки ДОК в КМ после иммуномагнитного обогащения опухолевых клеток с применением моноклональных антител к EpCAM (CD326). В то же время обнаружение малого количества опухолевых клеток при проточной цитометрии сложно трактовать в случаях, когда опухолевые клетки не формируют четкого кластера. При об-
наружении такого кластера микрометастазы могут быть констатированы даже при наличии менее 1 опухолевой клетки на 1 млн миелокариоцитов. Остается неясным, какова «критическая» опухолевая нагрузка КМ, превышение которой было бы связано с ростом частоты рецидива заболевания. На основании анализа миелограмм не удалось выявить косвенные признаки наличия единичных опухолевых клеток РМЖ.
Представленные нами данные демонстрируют необходимость внедрения в клиническую практику иммунологического исследования КМ, особенно на ранних стадиях РМЖ, для оценки распространенности опухолевого процесса и индивидуализации лечения.
Работа поддержана государственным заданием Минобрнауки РФ. Шифр государственного задания 4. 1219. 201.
ЛИТЕРАТУРА
1. Alix-Panabieres C., Pantel K. Detection and characterization of disseminating cancer cells in patients with epithelial solid malignancies // Haematopoiesis Immunol. — 2012. — Vol. 10, N 1. — P. 79—93.
2. Tupitsyn N. N. Hematogenously disseminating operable cancer as a principal problem of oncology. Immunological tumor staging // Haematopoiesis Immunol. — 2007. — Vol. 4, N 2. — P. 7—13.
3. Занкин В. В., Кометова В. В., Лазаревский М. М. Гистологическая степень злокачественности эпителиальных опухолей как фактор прогноза рецидивирования и метастазирования после радикального лечения (взгляд патоморфолога на клинические проблемы) // Матер. VI Рос. науч.-практ. конф. «Модниковские чтения», г. Ульяновск, 22—23 окт. 2009 г. — С. 48—50.
4. Calaluce R., Miedema B., Yesus Y. Micrometastasis in colorectal carcinoma: A review // J. Surg. Oncol. — 1998. — Vol. 67, N 3. — Р. 194—202.
5. Immunocytological diagnosis of micrometastatic bone marrow involvement in patients with breast cancer / Krokhina О. V., Letya-gin V. P., Tupitsyn N. N., Blindar V. N., Ermilova V. D. // Haematopoiesis Immunol. — 2007. — Vol. 4, N 2. — P. 117—131.
Поступила 22.12.2013
Oxana Andreyevna Bogomolova', Nikolay Nikolayevich Tupitsyn2, Valery Vitalyevich Rodionov3, Vlada Vladimirovna Kometova4, Maria Valeryevna Rodionova5
IMMUNOCYTOLOGICAL DETECTION OF DISSEMINATED TUMOR CELLS IN BONE MARROW OF BREAST CANCER PATIENTS
' MD, Postgraduate Student, Chair of Oncology and Radiation Diagnosis, Ulyanovsk State University (42, ul. Lva Tolstogo, Ulyanovsk, RF, 432017) 2 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Haematopoiesis Immunology Laboratory, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, ''5478) 3 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Chair of Oncology and Radiation Diagnosis, Ulyanovsk State University (42, ul. Lva Tolstogo, Ulyanovsk, RF, 432017) 4 MD, PhD, Physician, Patomorphology Department, Regional Clinical Cancer Center (90, ul. '2 Sentyabrya, Ulyanovsk, RF, 432063)
5 MD, Postgraduate Student, Surgical Department No. 5, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, ''5478)
Address for correspondence: Bogomolova Oksana Andreyevna, app. 55, bld. 50, ul. Kirova, Ulyanovsk, RF, 432063; e-mail: [email protected]
The study was performed in 50 patients with I—IV stage breast cancer. Bone marrow assessment was made prior to treatment by standard morphological methods and flow cytometry using monoclonal anti-EpCAM antibodies (CD326). Flow cytometry was conducted after immunomagnetic enrichment of cells with anti-EpCAM antibodies. The presence of one or more disseminated tumor cells per 106 myelokaryocytes was established as threshold level. Standard cytological and histological study discovered bone marrow metastases in 1 (2.0%) and 2 (4.0%) of 50 patients, respectively. Flow cytometry confirmed bone marrow involvement in both cases and significantly improved detection rate of micrometastases and disseminated tumor cells to a total of 11 patients (22.0%). In our opinion flow cytometry is the method of choice for disseminated tumor cell measurement after immunomagnetic enrichment with anti-EpCAM antibodies, especially in patients with early stage breast cancer for assessment of disease advance and personalization of treatment.
Key words: breast cancer, disseminated tumor cells in bone marrow, micrometastases, flow cytometry.
