CC BY
94
УДК 616.152.21-08-092.9
ИММУНОТРОПНОЕ И АНТИОКСИДАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ L-НОРВАЛИНА И АНТИГИПОКСАНТОВ РАЗЛИЧНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ
© Ангалев М.М.1, Авдеева Е.В.1, Быстрова Н.А.2
1 Кафедра нормальной физиологии, 2 кафедра биологической химии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: avdeyeva ev@mail.ru
Проведено изучение влияния неселективного ингибитора аргиназы L-норвалина и его комбинации с цитофлави-ном, кудесаном и гипоксеном на функциональную активность нейтрофилов, интенсивность ПОЛ и содержание стабильных метаболитов азота в сыворотке крови крыс при интервальной гипоксической гипоксии. Установлено, что введение L-норвалина и антигипоксантов с различным механизмом действия достоверно не влияет на метаболическую и фагоцитарную активности нейтрофилов, увеличивает общую антиоксидантную активность и уменьшает содержание вторичных продуктов ПОЛ. Введение L-норвалина достоверно увеличивает концентрацию стабильных метаболитов NO.
Ключевые слова: L-норвалин, цитофлавин, кудесан, гипоксен, иммунотропное, антиоксидантное действие, интервальная гипоксическая гипоксия.
IMMUNOTROPIC AND ANTIOXIDANT EFFECTS OF L-NORVALINE AND ANTIHYPOXANTS OF DIFFERENT ACTION MECHANISMS IN CONDITIONS OF HYPOXIC HYPOXIA Angalev M.M.1, Avdeyeva E. V.1, Bystrova N.A.2
1 Department of Normal Physiology, 2 Department of Biochemistry of Kursk State Medical University, Kursk
The influence of non-selective arginase inhibitor - L-norvaline and its combination with Cytoflavin, Kudesan, Hypox-enum on the functional activity of neutrophils, intensity of lipid peroxidation, and concentration of stable nitrogen metabolites in rats’ blood serum under interval hypoxic hypoxia has been studied. The investigation has shown that the administration of L-norvaline and antihypoxants with different action mechanisms does not significantly affect the metabolic and phagocytic activity of neutrophils, increases the total antioxidant activity and reduces the content of lipid peroxidation secondary products. The introduction of L-norvaline significantly increases the concentration of stable NO metabolites.
Keywords: L-norvaline, Cytoflavin, Kudesan, Hypoxen, immunotropic, antioxidant effects, interval hypoxic hypoxia.
Гипоксия представляет собой универсальный патологический процесс, сопровождающий и определяющий развитие самой разнообразной патологии. Причины нарушения продукции энергии в гипоксической клетке могут быть различными. Но в основе всех нарушений при гипоксии лежит недостаточность ведущей клеточной энергопродуцирующей системы - митохондриального окислительного фосфорилирования [4]. Развивается порочный круг: недостаток кислорода нарушает энергетический обмен и стимулирует свободнорадикальное окисление, а активация свободнорадикальных процессов, повреждая мембраны митохондрий и лизосом, усугубляет энергодефицит. При этом в сосудистое русло проникают различные эндогенные и экзогенные соединения, изменяющие функциональную активность иммунокомпетентных клеток, что приводит к изменению иммунологической активности организма [13, 12, 1].
Оправданным путем коррекции энергодефицитных состояний, возникающих при гипоксии, является использование веществ, близких к естественным редокс-переносчикам, способных
участвовать в электронном обмене между отдельными компонентами дыхательной цепи митохондрий. Одним из таких препаратов является гипо-ксен [11].
Другим путем коррекции гипоксических состояний является использование естественных компонентов цепи переноса электронов - коэнзи-ма Q10. В условиях стресса, гипоксии происходят структурные нарушения мембран митохондрий и теряется часть встроенных в нее переносчиков электронов. Коэнзим Q10 - единственный из компонентов дыхательной цепи, который не связан с белком мембраны и активно участвует в процессе стабилизации мембранных липидов [9].
В условиях энергодефицита также возможно применение средств, выполняющих в клетках организма универсальную энергосинтезирующую функцию и усиливающих сукцинатоксидазное окисление, являющееся компенсаторным путем образования АТФ. К таким средствам относится препарат цитофлавин.
Процесс формирования адаптации к гипоксии вовлекает множество систем и механизмов, одним из них является метаболизм оксида
азота (NO). Оксид азота оказывает мощное противовоспалительное и антитромбогенное действие, уменьшает инфильтрацию, агрегацию нейтрофилов и моноцитов, обладает антиокси-дантным действием [15, 3, 17]. В организме источником оксида азота служит L-аргинин. В цикле мочевины метаболизм L-аргинина протекает по двум путям. Первый путь катализирует фермент аргиназа, под действием которого L-аргинин гидролизируется в орнитин и мочевину. Другой путь превращения L-аргинина в оксид азота и цитруллин катализируется NO-синтазой. Оба фермента конкурируют между собой за общий субстрат L-аргинин. Одним из путей увеличения выработки NO является применение ингибиторов аргиназы. Наименее изученным среди неселективных ингибиторов аргиназ остается L-норвалин. Механизм действия L-норвалина сводится к восстановлению NO-синтезирующей функции и к коррекции патологических изменений при гипоксии, что обусловливает применение ингибиторов аргиназы в условиях гипоксии [16].
Учитывая вышеизложенное, представлялось перспективным сочетанное применение ингибитора аргиназы L-норвалина и антигипоксантов различного механизма действия для коррекции гипоксических состояний.
Целью настоящего исследования явилось изучение иммунотропного и антиоксидантного действия L-норвалина и его сочетанного применения с антигипоксантами различного механизма действия в условиях интервальной гипоксической гипоксии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проведены на 48 крысах Вистар массой 180-200 г с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Интервальную гипоксическую гипоксию (ИГГ) с гиперкапнией вызывали помещением крыс в гермокамеры одинакового объема до появления признаков терминальной стадии гипоксии 1 раз в сутки в течение 5 дней с интервалом 24 часа [5]. L-норвалин (WIRUD GmbH Hamburg, любезно предоставленный д.м.н., профессором М.В. Покровским) вводили внутрибрюшинно пятикратно в дозе 15 мг/кг за час до гипоксического воздействия. Цитофлавин (80 мг/кг), кудесан (10 мг/кг) вводили внутрибрюшинно, гипоксен (80 мг/кг) вводили внутрижелудочно пятикратно за час до гипоксического воздействия.
Метаболическую активность нейтрофилов оценивали в тесте восстановления нитросинего
тетразолия (НСТ). Учет результатов НСТ-теста проводили фотометрически [6]. Влияние L-норвалина на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови оценивали по фагоцитарному показателю (ФП), фагоцитарному числу (ФЧ) и индексу активности фагоцитоза (ИАФ) [8].
В сыворотке крови определяли содержание первичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - диеновых конъюгатов (ДК), вторичных - малонового диальдегида (МДА) и концентрацию стабильных метаболитов азота [14, 10]. Антиоксидантный потенциал оценивали по общей антиокислительной активности сыворотки крови и активности сывороточной ка-талазы [7].
Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления среднеарифметической (М) и ошибки средней (m). Достоверность статистических различий средних арифметических величин оценивалась с помощью однофакторного дисперсного анализа - ANOVA, критерия Ньюмена-Кейлса в програмном комплексе «БИОСТАТИСТИКА для Windows».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что в условиях гипоксической гипоксии снижаются спонтанная и стимулированная метаболическая активности нейтрофилов. Так, показатель НСТ сп. в группе интактных животных при гипоксической гипоксии уменьшается на 60%, НСТ ст. - на 62,8%. Введение L-норвалина, цитофлавина и кудесана в условиях ИГГ не изменяет сниженную кислородзависимую активность полиморфноядерных лейкоцитов. Сочетанное применение L-норвалина, цитофлавина и гипоксена увеличивает кислородзависимую активность нейтрофилов по показателю НСТ сп., приближая данный показатель к значениям контрольной группы животных (табл. 1). Однако данное сочетание препаратов не оказывает влияния на показатель НСТ ст. полинуклеаров периферической крови крыс.
Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови так же как и их метаболическая активность значительно снижается под воздействием гипоксической гипоксии. Введение исследуемых препаратов не влияет на данный показатель полинуклеаров периферической крови крыс (табл. 1).
Исследовано изменение оксидантных и анти-оксидантных показателей, уровня стабильных метаболитов азота у контрольных животных и на фоне применения L-норвалина и антиоксидантов в условиях интервальной гипоксической гипоксии. Установлено, что при гипоксической
Таблица 1
Влияние L-норвалина и антигипоксантов на функциональную активность нейтрофилов
в условиях гипоксической гипоксии
№ п/п Условия опыта НСТ сп., Ед. НСТ ст., Ед. ФП% ФЧ ИАФ
1 Контроль 0,37 ± 0,05 0,78 ± 0,06 77,5 ± 1,05 3,54 ± 0,04 2,74 ± 0,07
2 Моделирование ИГГ 0,15 ± 0,02 * 0,29 ± 0,07* 34,88 ± 1,81* 1,68 ± 0,08* 0,58 ± 0,04*
3 ИГГ + L-норвалин 0,21 ± 0,02 *1,2 0,32 ± 0,05* 32,63 ± 1,73* 1,70 ± 0,08* 0,55 ± 0,05*
4 ИГГ + L-норвалин + цитофлавин 0,22 ± 0,03*1,2 0,34 ± 0,02* 33,13 ± 0,89* 1,8 ± 0,07* 0,60 ± 0,04*
5 ИГГ + L-норвалин + цитофлавин + гипоксен 0,3 ± 0,03*2 0,37 ± 0,05* 40,0 ± 1,60*' 1,58 ± 0,06*1,4 0,63 ± 0,05*
6 ИГГ + L-норвалин + цитофлавин + кудесан 0,18 ± 0,05* 0,28 ± 0,03* 35,13 ± 0,58* 1,63 ± 0,05* 0,54 ± 0,03*
Примечание: здесь, в табл. 2 и на рис. 1: ИГГ - интервальная гипоксическая гипоксия; * - достоверность различий средних арифметических величин, р < 0,05; цифры рядом со звездочкой обозначают, по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны.
Таблица 2
Влияние L-норвалина и антигипоксантов на антиоксидантный статус и перекисное окисление липидов сыворотки крови крыс в условиях гипоксической гипоксии
N п/п Условия опыта МДА мкмоль/мл АГП (ДК) усл.ед ОАА % Каталаза мккат/мл
1 Контроль 2,4 ± 0,14 0,22 ± 0,05 42,45 ± 0,41 23,8 ± 0,7
2 Моделирование ИГГ 5,55 ± 0,16* 0,56 ± 0,09*1 30,0 ± 2,06*1 11,91 ± 0,72*1
3 ИГГ +L-норвалин 3,39 ± 0,23*1,2 0,50 ± 0,03*1 39,75 ± 0,88*2 10,47 ± 0,64*1
4 ИГГ +L-норвалин + цитофлавин 3,28 ± 0,18*1,2 0,55 ± 0,03* 42,38 ± 1,05*2 22,56 ± 0,81*2,3
5 ИГГ +L-норвалин + цитофлавин + гипоксен 2,52 ± 0,27*2,3,4 0,37 ± 0,02*1,3,4 40,13 ± 1,63*2 21,94 ± 1,16*2,3
6 ИГГ +L-норвалин + цитофлавин + кудесан 4,19 ± 0,24*1,3,4,5 0,48 ± 0,07*1 41,75 ± 0,79*2 12,44 ± 0,49*1,4,5
гипоксии происходит увеличение промежуточных и конечных продуктов ПОЛ. Концентрация МДА увеличилась с 2,4 ± 0,14 мкмоль/л в контроле до 5,55 ± 0,16 мкмоль/л в группе животных, подвергшихся гипоксии. Показатель концентрации ацилгидроперекисей (АГП) увеличился в 2,5 раза по сравнению с данными контрольной группы животных (табл. 2).
Введение L-норвалина и антигипоксантов достоверно (р < 0,05) уменьшало концентрацию МДА во всех группах экспериментальных животных. Уменьшение концентрации диеновых конь-югатов наблюдалось только в группе животных, получавших L-норвалин, цитофлавин и гипоксен. Данная комбинация препаратов, а также сочета-
ние L-норвалина и цитофлавина достоверно стимулировали активность каталазы плазмы крови животных, подвергшихся гипоксии. Общая антиоксидантная активность достоверно увеличивалась во всех экспериментальных группах животных (табл. 2).
Оксид азота является регулятором множества процессов в организме [2]. Свойства оксида азота в настоящее время продолжают активно изучаться, и появляющиеся сведения берутся на вооружение фармакологами и медиками различных специальностей. Однако следует еще раз указать на полифункциональность его действия, которое нельзя сводить только к «положительным» или только к «отрицательным» эффектам.
метаболиты 8 N0
мкмоль/л ^
6
5
1 -
1ІІ
11
Яш
1
2
3
4
5
6
Рис.1. Влияние L-норвалина и антигипоксантов на уровень стабильных метаболитов N0 в условиях интервальной гипоксической гипоксии. 1 - контроль; 2 - интервальная гипоксическая гипоксия;
3 - L-норвалин + ИГГ; 4 - L-норвалин, цитофлавин + ИГГ; 5 - L-норвалин, цитофлавин, гипоксен + ИГГ; 6 - L-норвалин, цитофлавин, кудесан + ИГГ.
Биологический ответ на N0 в значительной степени определяется условиями его генерации -где, когда и в каком количестве продуцируется это соединение. Поэтому представляло интерес изучение уровня стабильных метаболитов N0 сыворотки крови в условиях гипоксической гипоксии, а также при коррекции антигипоксантами и применении ингибитора аргиназы L-норвалина, который усиливает выработку N0.
При гипоксии происходит активация ферментативных и неферментативных систем, участвующих в образовании N0 из ионов N02 , имеет место активация цикла оксида азота: L-ар-
гинин^К0^- N02 /^03 ^ N0. Поэтому гипо-ксическая гипоксия сопровождается повышением концентрации стабильных метаболитов N0 в сыворотке крови в 1,5 раза по сравнению с данными группы контрольных животных (рис. 1 ).
Введение L-норвалина еще более увеличивает концентрацию метаболитов N0 (в 2 раза к контролю). Возможно, это приводит к более выраженным компенсаторно-приспособительным изменениям, таким как индукция перераспределения белков из растворимого в мембранносвязанное состояние, активацию ферментативных систем, участвующих в синтезе АТФ. Введение антиоксидантов в комбинации с L-норвалином демонстрирует инверсный вариант действия. Концентрация метаболитов N0 снижается при сочетанном применении L-норвалина с антиоксидантами до показателей группы животных, подвергшихся ИГГ. Применение антиоксидантов
различного механизма действия корректирует метаболические нарушения, возникающие при гипоксии, что приводит к меньшей выработке метаболитов N0 и частично нивелирует эффект применения L-норвалина.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что введение L-норвалина и антигипоксантов с различным механизмом действия в условиях интервальной гипоксической гипоксии увеличивает общую антиоксидантную активность и уменьшает содержание вторичных продуктов ПОЛ в сыворотке крови экспериментальных животных. Особенно эффективным оказалось применение неселективного ингибитора аргиназы с антиокидантом и антигипоксантом -гипоксеном, обладающим электронно-
акцепторными свойствами, и метаболическим препататом, стимулирующим процессы клеточного дыхания - цитофлавином. Применение L-норвалина в комбинации с данными препаратами достоверно увеличивает метаболическую активность нейтрофилов, стимулирует активность каталазы и уменьшает концентрацию диеновых коньюгатов. Применение L-норвалина в комбинации с цитофлавином и кудесаном не влияет на метаболическую и фагоцитарную активности нейтрофилов, но увеличивает общую антиоксидантную активность и уменьшает содержание вторичных продуктов ПОЛ в сыворотке крови экспериментальных животных.
Введение L-норвалина на фоне гипоксической гипоксии достоверно увеличивает концентрацию
4
0
стабильных метаболитов N0, что по нашему
мнению связано с компенсаторно-приспособительными механизмами при гипоксии. Введение антиоксидантов в комбинации с L-норвалином демонстрирует инверсный вариант действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Афанасьев В.А., Бровкина И.Л., Быстрова Н.А.,
Конопля А.И., Лазарев А.И., Прокопенко Л.Г.
Окислительный энергетический и иммунный гомеостаз (нарушение и коррекция) / под ред.
Л.Г. Прокопенко, А.И. Лазарева, А.И. Конопли. -Курск: КГМУ, 2003. - 336 с.
2. Гилинский М.А., Брусенцев Е.Ю. Эндогенная регуляция биодоступности оксида азота. Клинические корреляты и подходы к анализу // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 3. - С. 109-115.
3. Гудков Л.Л., Шумаев К.Б., Каленикова Е.И., Губкина С.А., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Антиоксидант-ное и прооксидантное действие доноров и метаболитов оксида азота // Биофизика. - 2007. - Т. 52, № 3. - С. 503-509.
4. Евсеева М.А., Евсеев А.В., Правдивцев В.А., Шабанов П.Д. Механизмы развития острой гипоксии и пути ее фармакологической коррекции // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2008. - № 6. - С. 3-25.
5. Зеленская К.Л., Поветьева Т.И., Пашинский В.Г., Фомина Т.Н., Тимина Е.А., Перова А.В. Стрессин-дуцирующее действие гипоксии разного генеза и его коррекция вытяжкой из девясила высокого // Бюлл. экспер. биологии и медицины. - 2005. -Т. 139, № 4. - С. 406-409.
6. Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтро-фильных гранулоцитов человека // Гематология. -2004. - № 8. - С. 26-29.
7. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
8. Медведев А.Н., Чаленко В.В. Способ исследования поглотительной фазы фагоцита // Лаб. дело. -1991. - № 2. - С. 19-20.
9. Медведев О.С., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Шашурин Д.А. Коэнзим Q10 в кардиологической
практике - теоретические основы и результаты клинических исследований // Русский медицинский журнал. - 2009. - Т. 17, № 18. - С. 1177-1181.
10. Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 6. - С. 15-18.
11. Николаев С.Б., Быстрова Н.А., Конопля А.И. Иммуномодулирующие и антиоксидантные эффекты гипоксена в условиях экспериментального инфаркта миокарда // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10, № 2. - С. 286.
12. Николаев С.Б., Быстрова Н.А., Лазаренко В.А., Конопля А.И. Иммунометаболические нарушения в условиях гипоксии и их фармакологическая коррекция. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2010. - 226 с.
13. Николаев С.Б., Конопля А.И., Быстрова Н.А. Иммуносупрессия при различных видах гипоксии и механизмы ее развития // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. 16, № 3. - С. 163-166.
14. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобар-битуровой кислоты // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М. : Медицина, 1977. - С. 66-68.
15. Тюренков И.Н., Воронков А.В., Слиецанс А.А., Дор-кина Е.Г., Снигур Г.Л. Антиоксидантная терапия эндотелиальной дисфункции // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. -2013. - Т. 11, № 1. - С. 14-25.
16. Цепелева С.А., Покровский М.В., Покровская Т.Г., Корокин М.В., Денисюк Т.А., Котельникова Л.В., Лопатин Д.В., Титарева Л.В., Черноморцева Е.А., Дудина Э.Н., Коновалова Е.А., Лосенок П.И., Локтионова И.Л., Терехова Е.Г., Бабко С.А. Кардио- и эндотелиопротективные эффекты ингибитора аргиназы L-норвалина при моделировании L-NAME индуцированного дефицита оксида азота // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. -№ 4. - С.185-187.
17. Sun G.Y., Horrocks L.A., Farooqui A.A. The roles of NADPH oxidase and phospholipases A2 in oxidative and inflammatory responses in neurodegenerative diseases // J. Neurochem. - 2007. - Vol. 103, N 1. -P. 1-16.
