CC BY
91
Фармакология, токсикология
УДК 619:615.015.4
ИММУНОТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 5%-ной СУСПЕНЗИИ
КОКЦИДОНА
Д.С. ПОСЕЛОВ аспирант М.В. АРИСОВ
Научный руководитель - доктор ветеринарных наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, 117218, г. Москва, уд. Б. Черемушкинская, д.28, e-mail: [email protected]
Изучены иммунотоксические свойства 5%-ной суспензии кокцидона в двух тестах. По результатам реакции гиперчувствительности замедленного типа индекс реакции у животных, получавших препарат в терапевтической дозе 0,4 мл/кг, составил 11,46, у животных, получавших 10-кратную дозу, - 11,31, а у животных контрольной группы - 14,26, что позволяет сделать вывод об отсутствии угнетающего действия 5%-ной суспензии кокцидона на Т-клеточное звено иммунной системы. Накожное однократное применение препарата в терапевтической и десятикратно увеличенной дозах не вызывает изменения интенсивности антителопродукции против тимусзависимого антигена. Индекс действия препарата в обеих дозах составил 0,98. Реакция гемагглютинации не выявила отрицательного влияния препарата на гуморальный иммунный ответ.
Ключевые слова: иммунотоксичность, кокцидон, иммунитет, гиперчувст-вительность, гемагглютинация, мыши, реакция.
Иммунотоксические свойства препарата «Кокцидон суспензия 5 %» оценивали на основе способности организма экспериментальных животных к индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и выработки антител в ответ на введение тимусзависимого антигена.
Клеточный иммунитет у экспериментальных животных при введении испытуемого препарата оценивали при воспроизведении реакции гиперчувствительности замедленного типа по методу Kitamura (1980). Воспроизведение реакции ГЗТ дает представление о способности лекарственных препаратов влиять на продукцию сенсибилизированными лимфоцитами медиаторов разнонаправленного действия, вовлекающих клетки системы мононуклерных фагоцитов в иммунный ответ. Эффекты ГЗТ образуются при контакте сенсибилизированных лимфоцитов с соответствующим антигеном в присутствии макрофагов. Продукцию медиаторов клеточного иммунного ответа эф-фекторными клетками ГЗТ стимулировали эритроцитами барана.
При оценке действия лекарственного препарата на иммунную систему информативным показателем является интенсивность продукции антител против тимусзависимого антигена, которая дает представление о функциональной активности трех клеточных систем - Т- и В-лимфоцитов, макрофагов и их совместном воздействии.
Цель нашей работы - изучить иммунотоксические свойства 5%-ной суспензии кокцидона.
107
Материалы и методы
Титр антител определяли в реакции гемагглютинации (РГА), основанной на специфическом склеивании антиген-несущих частиц эритроцитов барана (ЭБ) специфическими антителами, которые выработаны при сенсибилизации и содержащимися в сыворотке крови [1-5]. Кровь для получения ЭБ брали путём венопункции в стеклянную банку. Отбивали фибрин путем помешивания до образования пены в течение 15 мин, фильтровали через капроновый фильтр и затем добавляли консервант Олсфера, состоящий из глюкозы - 2,05 г, цитрата натрия - 0,8 г, хлорида натрия - 0,42 г и дистиллированной воды -100 мл в соотношении 1 : 1. Полученную кровь хранили в холодильнике.
Отмывание ЭБ проводили следующим образом. В две центрифужные пробирки добавляли по 3 мл крови и до 10 мл физиологического раствора (0,83 %), затем уравновешивали на весах. Центрифугировали при 1500 об. в течение 10-15 мин. Далее верхнюю часть супернатанта отсасывали пастеровской пипеткой и вновь добавляли физиологический раствор, взбалтывали и помещали в центрифугу. Процедуру повторяли 3-4 раза до образования прозрачного супернатанта, который также отсасывали.
Для получения 3%-ного раствора ЭБ в мерный стакан вместимостью 100 мл добавляли 40 мл 0,83%-ного физиологического раствора, затем добавляли 3 мл отмытых ЭБ и доводили общий объём до 100 мл.
Для постановки реакции ГЗТ и РГА было сформировано по три группы мышей-самцов линии CBA х C57 BL/6 по 10 голов массой тела 18 г. Животным первой группы вводили препарат в дозе 0,4 мл/кг перорально, однократно (терапевтическая доза). Животным второй группы вводили дозу 4 мл/кг перорально, однократно (десятикратная терапевтическая доза). Животные третьей группы препарат не получали и служили контролем.
В реакции ГЗТ всех животных подопытных групп иммунинизировали интраперитониально оптимальной дозой тест-антигена - тимусзависимый антиген - нативные ЭБ. Антиген вводили в объеме 0,5 мл 3%-ной суспензии ЭБ в стерильном физиологическом растворе. Для выявления сенсибилизации мышей на 5-е сутки в подушечку правой задней лапы вводили разрешающую дозу антигена в объеме 50 мкл 15%-ной суспензии ЭБ в физиологическом растворе (опыт) В контрлатеральную лапу вводили физиологический раствор в том же объеме. О степени выраженности воспалительной реакции на месте инъекции антигена судили по приросту массы лап через 24 ч.
О клеточной реакции формирования ГЗТ судили по величине сдвига индекса реакции (ИР), выраженного в процентах. Индекс реакции вычисляли для каждой мыши по формуле:
ИР = Мо - Мк / Мк х100,
где Мо - масса опытной лапы; Мк - масса контрольной лапы.
Контролем служили неиммунизированные мыши, получившие только разрешающую дозу антигена.
В РГА интенсивность продукции антител против тест-антигена после введения испытуемого препарата изучали в опытах на мышах, иммунизированных интраперитонеально оптимальной дозой антигена. В качестве антигена использовали нативные ЭБ. Антиген вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл 3%-ной суспензии ЭБ на стерильном физиологическом растворе. Испытуемый препарат вводили после иммунизации, т. е. в индуктивную фазу иммунного ответа. Титр антител определяли на пике первичного иммунного ответа (7-е сутки после иммунизации) в микроварианте прямой РГА (Sever, 1962). Титр антител выражали в виде log V числа. Для сравнения выраженности иммунного ответа в опыте и контроле определяли индекс действия препарата (ИД), который представляет собой отношение титра антител в опыте к величине титра антител в контроле. Статистическую обработку проводили с помощью программы «STUDENT 200». Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.
108
Результаты и обсуждение
Результаты тестирования способности организма экспериментальных животных к индукции реакции ГЗТ приведены в таблицах 1-3.
1. Реакция ГЗТ ( терапевтическая доза 0,4 мл/кг перорально, однократно)
№ животного Реакция ГЗТ
масса правой ла- масса левой ла- ИР, %
пы, мг (опыт) пы, мг(контроль)
1 143,0 131,0 9,16
2 145,0 131,0 10,68
3 149,0 131,0 13,74
4 150,0 128,0 17,18
5 132,0 127,0 3,93*
6 148,0 137,0 8,03
7 159,0 141,0 12,74
8 143,0 129,0 10,85
9 140,0 128,0 9,37
10 162,0 136,0 19,11*
В среднем 11,46
Примечание. * - показатель выведен из вариационного ряда при статистической
обработке.
2. Реакция ГЗТ (десятикратная терапевтическая доза 4 мл/кг перорально, од_______________________________нократно)_______________________________
№ животного Реакция ГЗТ
масса правой лапы, мг (опыт) масса левой лапы, мг(контроль) ИР, %
1 169,0 140,0 20,71*
2 147,0 137,0 7,29
3 141,0 124,0 13,71
4 152,0 138,0 10,14
5 162,0 142,0 14,08
6 155,0 125,0 24,0*
7 153,0 138,0 10,86
8 148,0 132,0 12,12
9 146,0 132,0 10,60
10 153,0 137,0 11,68
В среднем 11,31
3. Реакция ГЗТ у контрольных животных
№ животного Реакция ГЗТ
масса правой лапы, мг (опыт) масса левой лапы, мг(контроль) ИР, %
1 149,0 132,0 12,87
2 154,0 135,0 14,07
3 158,0 147,0 7,48
4 144,0 125,0 15,2
5 165,0 144,0 14,58
6 160,0 132,0 21,21*
7 152,0 130,0 16,92
8 164,0 145,0 13,10
9 160,0 137,0 16,78
10 155,0 132,0 17,42
В среднем 14,26
Пероральное однократное введение испытуемого препарата в терапевтической и десятикратно увеличенной терапевтической дозе не вызывало ста-
109
тистически достоверного сдвига ИР ГЗТ. Значения ИР не отличались от показателя контроля. Полученный результат указывает на индифферентность клеточного иммунитета к действию испытуемого препарата.
Результаты тестирования способности организма экспериментальных животных к антителопродукции против тимусзависимого антигена при введении испытуемого препарата приведены в таблицах 4-6.
4. РГА у белых мышей при введении кокцидона в терапевтической дозе 0,4
мл/кг перорально, однократно
№ животного Результаты РГА
титр антител log / титра антител
1 1/32 5,00
2 1/32 5,00
3 1/32 5,00
4 1/32 5,00
5 1/32 5,00
6 1/32 5,00
7 1/64 6,00
8 1/32 5,00
9 1/32 5,00
10 1/32 5,00
В среднем 5,11
5. РГА у белых мышей при введении кокцидона в десятикратной терапевти-______________ческой дозе 4 мл/кг перорально, однократно____________
№ животного Результаты РГА
титр антител log / титра антител
1 1/32 5,00
2 1/64 6,00
3 1/32 5,00
4 1/64 6,00
5 1/16 4,00
6 1/64 6,00
7 1/16 4,00
8 1/32 5,00
9 1/32 5,00
10 1/32 5,00
В среднем 5,10
6. РГА у белых мышей при введении кокцидона в десятикратной терапевти-
ческой дозе 4 мл/кг перорально, однократно
№ животного Результаты РГА
титр антител log / титра антител
1 1/32 5,00
2 1/64 6,00
3 1/32 5,00
4 1/32 5,00
5 1/32 5,00
6 1/32 5,00
7 1/64 6,00
8 1/32 5,00
9 1/32 5,00
10 1/32 5,00
В среднем 5,20
Полученные результаты свидетельствуют о том, что пероральное одно-
кратное применение испытуемого препарата в терапевтической и десяти-110
кратно увеличенной дозе не вызывает изменений интенсивности антителопродукции против тимусзависимого антигена. Титр гемагглютининов в сыворотке крови животных, получивших различные дозы кокцидона, не отличался от такового в контроле. На толерантность гуморального иммунного ответа к действию кокцидона в испытанных дозах указывают также индексы действия препарата, равные 0,98 (табл. 7).
7. Интенсивность антителопродукции против тимусзависимого антигена у мышей при пероральном введении 5%-ной суспензии кокцидона____
Группа животных Доза препарата, мл/кг Кратность введения log V титра антител ИД
I 0,4 Однократно 5,11±0,30 0,98
II 4 Однократно 5,10±0,52 0,98
Контроль - 5,20±0,30 -
Таким образом, по данным реакции ГЗТ пероральное однократное введение 5%-ной суспензии кокцидона в терапевтической и десятикратно увеличенной дозах не оказывает негативного действия на клеточный иммунитет. По данным РГА пероральное однократное введение препарата в терапевтической и десятикратно увеличенной дозах не оказывает негативного действия на гуморальный иммунный ответ. Препарат в испытанных дозах не обладает иммунотоксическими свойствами.
Литература
1. Daugalieva E.H. и dr. Metodicheskie rekomendacii po izucheniju vlijanija antgel’mintikov na immunnii status zhivotnih pri gel’mintozah. - М., 1989. - 12 s.
2. Petrov R. V. Immunologija. - М.: Medicina, 1987. - 387 s.
3. Haitov R.M. и dr. Metodicheskie ukazanija po izucheniju immunotropnoi aktivnosti farmakologicheskih veschestv. - М., 1998. - 10 s.
4. Kitamura K. A footpad weight assay method to evaluate delayed-type hypersensitivity in the mouse // Immunol. Methods. - 1980. - V. 39, № 3. - P. 277283.
5. Sever J.L. Application of a micro-technique to viral serological investigations // J. Immunol. - 1962. - V. 88, № 1. - P. 398-413.
Immunotoxic properties of 5 % suspension of Kokcidon
D.S. Poselov postgraduate M.V. Arisov
doctor of veterinary sciences
All-Russian Scientific Research Institute of Helmintology named after K.I. Skrya-bin, 117218, Moscow, B. Cheremushkinskaya st., 28, e-mail: [email protected]
Immunotoxic properties of 5 % suspension of kokcidon in two tests are studied. By results of reaction of hypersensitivity of the slowed-down type the reaction index at the animals receiving a preparation in a therapeutic dose of 0,4 ml/kg, has made 11,46, at the animals receiving a 10 times increased dose - 11,31, and at animals of control group - 14,26 that allows to draw a conclusion on lack of oppressing effect of 5 % suspension kokcidon on the T-cellular link of immune system. A single skin application of tested drug in a therapeutic and tenfold increased therapeutic doses doesn't cause changes of intensity of antibody production against a thymus-dependent antigen. The index of action of a preparation in both doses made 0,98. Reaction of gemagglyutination didn't reveal negative influence of a preparation on the humoral immune answer.
Keywords: immunotoxicity, kokcidon, immunity, hypersensitivity, gemag-glyutination, mice, reaction.
111
