Научная статья на тему 'Иммунорегуляторные свойства метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека'

Иммунорегуляторные свойства метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
140
31
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БИФИДОБАКТЕРИИ / ЦИТОКИНЫ / АНТИЦИТОКИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ / ЭУБИОЗ / ДИСБИОЗ / BIFIDOBACTERIA / CYTOKINES / ANTI-CYTOKINE ACTIVITY / EUBIOSIS / DYSBIOSIS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Бухарин О.В., Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н., Никифоров И.А.

Цель. Оценить иммунорегуляторные свойства метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека. Материалы и методы. Изучена антицитокиновая активность метаболитов клинических штаммов бифидобактерий и их способность влиять на продукцию мононуклеарами периферической крови здорового человека прои противовоспалительных цитокинов (IL-10) с учетом микроэкологического состояния кишечника человека. Определение конечной концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводили в ИФА. Результаты. Выявлены чувствительные параметры, пригодные для оценки стабильности кишечного микросимбиоценоза человека. Для бифидобактерий в условиях эубиоза информативными оказались: уровень микробной обсемененности, концентрация TNFа и антилизоцимная активность. При формировании дисбиоза 1 3 степени значимыми параметрами явилась способность метаболитов бифидофлоры влиять на продукцию провоспалительных цитокинов (INF-y, TNF-а, IL-8) мононуклеарами человека. Заключение. Поддержание физиологического состояния кишечного гомеостаза определяется иммунорегуляторными свойствами метаболитов бифидобактерий, реализуемым через их воздействие как на цитокины (антицитокиновая активность), так и на продукцию цитокинов иммунными клетками (мононуклеарами периферической крови) хозяина.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Бухарин О.В., Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н., Никифоров И.А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

IMMUNE REGULATORY PROPERTIES OF BIFIDOBACTERIA METABOLITES DURING EUBIOSIS AND DYSBIOSIS OF THE HUMAN COLON

Aim. Evaluate immune regulatory properties ofbifidobacteria metabolites during eubiosis and dysbiosis of the human colon. Materials and methods. Anti-cytokine activity of metabolites of bifidobacteria clinical strains and their ability to influence the production of proand anti-inflammatory cytokines (IL-10) by peripheral blood mononuclear cells of healthy humans was studied, taking into account microecological state of the human intestine. Determination of final concentration of cytokines in experimental and control samples was carried out by EIA. Results. Sensitive parameters, that are suitable for evaluation of stability of human intestine microsymbiocenosis, were detected. The level of microbial seeding, concentration of TNF-а and anti-lysozyme activity turned out to be informative for bifidobacteria in eubiosis conditions. The ability of bifidoflora metabolites to influence the production of pro-inflammatory cytokines (INF-y, TNF-а, IL-8) by human mononuclears was a significant parameter during formation of 1 3 degree dysbiosis. Conclusion. The maintenance of physiological state of intestine homeostasis is determined by immune regulatory properties of bifidobacteria metabolites, that is realized via their interaction with both cytokines (anti-cytokine activity) and production of cytokines by host immune cells (peripheral blood mononuclears).

Текст научной работы на тему «Иммунорегуляторные свойства метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015

О.В.Бухарин, Е.В.Иванова, Н.Б.Перунова, И.Н.Чайникова, И.А.Никифоров, Т.А.Бондаренко

ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА МЕТАБОЛИТОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ ПРИ ЭУБИОЗЕ И ДИСБИОЗЕ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург

Цель. Оценить иммунорегуляторные свойства метаболитов бифидобактерий при эу-биозе и дисбиозе толстого кишечника человека. Материалы и методы. Изучена антици-токиновая активность метаболитов клинических штаммов бифидобактерий и их способность влиять на продукцию мононуклеарами периферической крови здорового человека про- и противовоспалительных цитокинов (IL-10) с учетом микроэкологического состояния кишечника человека. Определение конечной концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводили в ИФА. Результаты. Выявлены чувствительные параметры, пригодные для оценки стабильности кишечного микросимбиоценоза человека. Для бифидобактерий в условиях эубиоза информативными оказались: уровень микробной обсемененности, концентрация TNF- а и антилизоцимная активность. При формировании дисбиоза 1 — 3 степени значимыми параметрами явилась способность метаболитов би-фидофлоры влиять на продукцию провоспалительных цитокинов (INF-y, TNF-а, IL-8) мононуклеарами человека. Заключение. Поддержание физиологического состояния кишечного гомеостаза определяется иммунорегуляторными свойствами метаболитов бифи-добактерий, реализуемым через их воздействие как на цитокины (антицитокиновая активность), так и на продукцию цитокинов иммунными клетками (мононуклеарами периферической крови) хозяина.

Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 89—96

Ключевые слова: бифидобактерии, цитокины, антицитокиновая активность, эубиоз, дисбиоз

0.V.Bukharin, E.V.Ivanova, N.B.Perunova,

1.N.Chainikova, I.A.Nikoforov, T.A.Bondarenko

IMMUNE REGULATORY PROPERTIES OF BIFIDOBACTERIA METABOLITES DURING EUBIOSIS AND DYSBIOSIS OF THE HUMAN COLON

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

Aim. Evaluate immune regulatory properties ofbifidobacteria metabolites during eubiosis and dysbiosis of the human colon. Materials and methods. Anti-cytokine activity of metabolites of bifidobacteria clinical strains and their ability to influence the production of pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-10) by peripheral blood mononuclear cells of healthy humans was studied, taking into account microecological state of the human intestine. Determination of final concentration of cytokines in experimental and control samples was carried out by EIA. Results. Sensitive parameters, that are suitable for evaluation of stability of human intestine microsymbiocenosis, were detected. The level of microbial seeding, concentration of TNF-а and anti-lysozyme activity turned out to be informative for bifidobacteria in eubiosis conditions. The ability of bifidoflora metabolites to influence the production of pro-inflammatory cytokines (INF-y, TNF-а, IL-8) by human mononuclears was a significant parameter during formation of 1 — 3 degree dysbiosis. Conclusion. The maintenance of physiological state of intestine homeostasis is determined by immune regulatory properties of bifidobacteria metabolites, that is realized via their interaction with both cytokines (anti-cytokine activity) and production of cytokines by host immune cells (peripheral blood mononuclears).

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 89—96

Key words: bifidobacteria, cytokines, anti-cytokine activity, eubiosis, dysbiosis

ВВЕДЕНИЕ

Качественное и количественное состояние микрофлоры кишечного биотопа является важным звеном системы, поддерживающей нормальный гомеостаз организма человека. Несмотря на значительные успехи в изучении механизмов эубиоза и микроэкологических нарушений кишечника, недостаточно исследованы особенности микробиоты толстой кишки, отражающие воздействие доминантных и ассоциативных микроорганизмов на цитокиновую сеть макроорганизма в аспекте изучения взаимоотношений в системе микросимбиоценоз—хозяин. Про- и противовоспалительным цитокинам, продуцируемым эпителиальными, иммунными клетками под воздействием представителей нормобиоты, принадлежит ведущая роль в регуляции кишечного гомеостаза посредством формирования адекватного цитокинового баланса [6, 8].

В физиологических условиях штаммы доминантных бактерий стимулируют протектив-ный иммунный ответ и подавляют воспалительные реакции [9, 11]. Таким свойством обладают как непосредственно микробные клетки, так и их экзометаболиты [5, 7]. Установлено, что негативная регуляция бифидобактериями провоспалительных цитоки-нов реализуется на уровне экспрессии генов, определяя тем самым гетерогенность имму-номодулирующих свойств бифидобактерий [6, 13, 14]. Вместе с тем, имеющиеся сведения об иммуномодулирующем действии симбиотических бактерий не позволяют оценить вклад бифидобактерий в формирование кишечного гомеостаза в зависимости от микроэкологического состояния толстого кишечника человека.

Целью исследования явилось изучение иммунорегуляторных свойств метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для изучения иммунорегуляторных свойств метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека в качестве исследуемых микроорганизмов использованы штаммы Bifidobacterium spp., выделенные из фекалий 38 пациентов в возрасте от 1 до 60 лет при обследовании на дисбиоз кишечника. Выделение и идентификация микроорганизмов проводились общепринятыми бактериологическими методами. Для верификации результатов идентификации все изоляты были дополнительно идентифицированы по их белковым профилям с использованием масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT c программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0 («Bruker Dal-tonics», Германия).

Для получения метаболитов суточную бульонную культуру двукратно центрифугировали при 3000 об/мин и готовили фильтрат (мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, «Millipore», USA). Результат влияния супернатантов бифидобактерий на нестиму-лированные мононуклеары оценивали по изменению концентрации цитокинов в культу-ральной среде. Мононуклеарные лейкоциты выделяли в стерильных условиях из гепари-низированной крови здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин («Pharmacia», Швеция) плотностью 1,077 г/см3. Продукцию цитокинов изучали в культурах мононуклеаров после 48-часовой инкубации клеток (2х106) при 37°C в атмосфере 5% СО2 в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma», США) и 80 мкг/мл гентамицина. Уровень TNF-a, IL-8, IFN-y и IL-10 в супер-натантах культур мононуклеарных лейкоцитов оценивали в ИФА с помощью наборов «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия).

Изучение способности метаболитов бифидобактерий в условиях in vitro вызывать изменение концентрации про- (IFN-y, TNF-a, IL-8) и противовоспалительных (IL-10) цитокинов — антицитокиновая активность (АЦА) проводилось путем соинкубирования супернатантов бактерий с рекомбинантными цитокинами («Sigma», IFN-y — I3265-1MG, TNF-a — T6674-10UG, IL-8 - I1645, IL-10 — I9276-5UG) [2]. Определение конечной концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводили в ИФА с использованием реагентов «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия), учет результатов регистрировался на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм. Количественные значения АЦА выражались в условных единицах по соотношению опытных проб к контрольным.

Статистическую обработку (общая статистика, дискриминантный анализ) полученных данных проводили средствами пакета Statistica 10 (StatSoft, USA) с оценкой различий

между средними величинами по t-критерию Стьюдента. Проверка нормального распределения переменных проводилась методом Шапиро-Уилка. Статистические результаты выражали в виде медианы (Ме), нижних (Q25) и верхних (Q75) квартилей. Уровень статистической значимости различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

Исследование распространенности антицитокиновой активности среди исследованных штаммов бифидобактерий показало, что способность изменять концентрацию провос-палительных цитокинов (IFN-y, TNF-a и хемокина IL-8) в среде сокультивирования чаще встречалась у изолятов, выделенных от пациентов с эубиозом и дисбиозом 1 степени, по сравнению со штаммами из кишечника с микроэкологическими нарушениями 2

— 3 степени. При эубиозе и дисбиозе 1 степени АЦА бифидобактерий в отношении ИНФ-у и TNF-a выявлялась у 50,0±0,4 и 83,0-94,0 % штаммов соответственно, при дисбиозе 2 степени — у 43,0±1,1 и 71,0±0,6 % изолятов и 3 степени — только у 29,0±1,8 % культур в отношении как одного, так и другого цитокина. Способность бифидобактерий снижать уровень IL-8 отмечалась у 43,0±0,5% эубиотических и у 29,0±1,8% дисбиотических штаммов.

Активность бифидобактерий в отношении противовоспалительного цитокина IL-10 также чаще встречалась у эубиотических штаммов (94,0±0,1%), однако формирование дисбиоза незначительно влияло на распространенность данного признака у бактерий, так как при тяжелой степени дисбиоза АЦА регистрировалась у 83,0±0,9% штаммов.

Таким образом, в условиях микроэкологических нарушений (при дисбиозах), по сравнению с эубиозом, из биотопа толстого кишечника реже выделялись изоляты бифидобактерий, способные изменять концентрацию цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-8 в условиях in vitro.

Исследование выраженности АЦА показало, что для штаммов бифидобактерий, колонизирующих биотоп толстого кишечника здорового человека, характерна высокая способность АЦА в отношении провоспалительных медиаторов IFN-y и TNF-a. В зависимости от микроэкологического состояния кишечника АЦА бифидобактерий в отношении IFN-y и TNF-a существенно снижалась только при 2 — 3 степени дисбиоза, при этом уровень АЦА уменьшался в ряду эубиоз, дисбиоз 1 > дисбиоз 2 > дисбиоз 3 степени. Далее данные (Ме [Q25- Q75]) приводятся в соответствии с указанным рядом по сравнению с эубиозом: для IFN-y

— (0,42 [0,28 — 0,63]), (0,6 [0,43 — 0,7], р=0,08) > (0,46 [0,45 — 0,47], р=0,37) > (0,29 [0,22 — 0,29] усл. ед., р=0,002). Для TNF-a выраженность данного свойства составляла соответственно: (0,44 [0,34 — 0,6]), (0,46 [0,24 — 0,56] усл. ед., р=0,35 > (0,32 [0,3 — 0,35], р=0,01) > (0,11 [0,11

— 0,17] усл. ед., р=0,001. Уровень выраженности АЦА супернатантов бифидобактерий в отношении IL-8 имел более низкие значения, чем для IFN-y и TNF-a, и для эубиоти-ческих штаммов составлял 0,11 [0,11 — 0,14] усл. ед., существенно не отличаясь от дисбиотических изолятов.

Анализ АЦА бифидобактерий в отношении противовоспалительного цитокина IL-10 показал, что для супернатантов эубиотических штаммов уровень ее был несколько выше показателей АЦА в отноше-

Рис. 1. Влияние метаболитов бифидобактерий на продукцию цитокинов мононуклеарами в зависимости от состояния микросимбиоценоза толстого кишечника человека.

По оси ординат — изменение продукции цитокинов мононуклеарами по отношению к контролю (базовый уровень спонтанной продукции цитокинов) (%); по оси абсцисс - □ INF-y, ^ TNF-a, ■ IL-8, В IL-10; фигурными скобками обозначены изменения в продукции цитокинов при эубиозе и дисбиозе кишечника человека.

нии IFN-y, TNF-a, составляя 0,58 [0,49 — 0,66] усл. ед., и не отличался от значений АЦА для дисбиотических изолятов, за исключением штаммов, выделенных при 3 степени дис-биоза (0,33 [0,26 — 0,49] усл. ед., р=0,003).

Таким образом, супернатанты облигатных анаэробных симбионтов толстого кишечника — бифидобактерий, изолированных от пациентов без микроэкологических нарушений, обладали выраженной способностью in vitro снижать концентрацию как провоспалитель-ных цитокинов IFN-y и TNF-a, так и противовоспалительного цитокина IL-10. Изменения в состоянии микросимбиоценоза биотопа толстого кишечника способствуют снижению выраженности и распространенности данного биологического свойства у бифидобактерий как для про-, так и противоспалительных цитокинов.

Исследование продукции цитокинов (ПЦ) нестимулированными мононуклеарами человека при взаимодействии с супернатантами штаммов бифидобактерий от пациентов, не имеющих нарушений микробиоценоза толстого кишечника, показало (рис. 1), что по отношению к контролю (мононуклеары без добавления экзометаболитов бифидобактерий) в культуральной жидкости отмечалось существенное снижение уровня IL-8 и IFN-y и, напротив, повышение IL-10, при этом изменений содержания TNF-a не выявляли. Супернатанты штаммов бифидобактерий от пациентов с дисбиозом 1 степени оказывали влияние на продукцию цитокинов мононуклеарами крови, сопоставимое с эубиотиче-скими изолятами. Наиболее выраженные отличия, как по сравнению с контролем, так и между эу- и дисбиотическими изолятами выявлялись у штаммов бифидобактерий от обследуемых со 2 и особенно 3 степенью микроэкологических нарушений толстого кишечника, что проявлялось в возрастании в культуральной среде уровня как про-, так и противовоспалительных цитокинов, наиболее значительное для TNF-a и IL-10.

В целом, полученные результаты по изучению влияния экзометаболитов бифидобактерий на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека в системе in vitro свидетельствуют об определенных различиях в выраженности и направленности воздействия штаммов на эффекторы иммунитета с учетом степени нарушений микробиоценоза толстого кишечника — биотопа естественного места пребывания доминантных микросимбионтов человека.

Исключительная роль бифидобактерий в микросимбиоценозе толстого кишечника человека дает основание рассматривать их как чувствительный индикатор состояния организма, описываемого посредством наиболее характерных биологических свойств. В этом качестве мы проанализировали ранее изученные свойства антилизоцимной активности (АЛА), показатель микробной обсемененности (ПМО), а также исследованные в этой работе продукцию мононуклеарами здорового человека про- (IL-8, TNF-a, IFN-y) и противовоспалительных (IL-10) цитокинов под влиянием супернатантов исследуемых бифидобактерий, включая антицитокиновую активность в отношении этих же цитоки-нов.

Эти характеристики определялись для членов выборки из 37 штаммов пациентов, которые по данным предварительного бактериологического обследования были отнесены к одной из 4 групп, условно обозначенных как эубиоз, дисбиоз 1 степени (ДБЗ 1), 2 степени (ДБЗ 2), 3 степени (ДБЗ 3). Наличие эталонной выборки позволило применить аппарат дискриминантного анализа для проверки уже известного разделения по категориям больных, бактериологически обследованных для диагностики дисбиоза толстого кишечника на основе рекомендаций [4]. Мы исходили из того, что если заявленные межгрупповые отличия сохранятся в пространстве описанных выше количественных характеристик свойств бифидобактерий, то их диагностические возможности будут подтверждены.

В результате дискриминантного анализа определились 2 канонических дискриминант-ных корня (ROOT 1 и ROOT 2), представляющие собой линейные комбинации исследуемых свойств бифидобактерий, характеризующих каждый случай эталонной выборки. Их проекция в координатах дискриминантных корней представлена на рис. 2 (вверху), где отчетливо наблюдается искомое разделение исследуемых штаммов бифидобактерий на 4 объективно существующие группы эубиоз—дисбиоз.

Суммарный анализ дискриминантных функций, на основании которых анализировался вклад изученных признаков бифидобактерий, показал почти 100% совпадение всех случаев группировки штаммов, выделяемых из кишечного биотопа при различных состояниях микросимбиоценоза: эубиоз, дисбиоз 1, 2 и 3 степени.

№№4 1 № нжг

и

-2 -а

1 1 1 О 0 1

О п СФ

° о о о ° ° О

О

ф о 4

УнПагй ЙООТ1

ЛЦ ИЛ-в ■1,00

ЛЦДОНО-а -0,9В

АЛА -л.п?

ш'

ЛЦЛЛНФ-* ■4.Н

ПЦ_ШМй

гаГ 2.ЕЮ

юэтэ

ГЩФНО-а. -0.0?

ПЦ_КЛ-Й ЧЗ.БГ

ИНФ*Г -<1,07

ЛЦА ФИО-4 -0,0В

АЛА 0,07

га^ил-Ю

гтвц^й^Ф-^4

пмо Ш

О БИСЙ О ДВД 1 А ДЕЭ2

Ж диаз

О

2 4

НмИ 1

ГнселцдуЕЫ Щ^АКТЕРИСГИКИ

( { 1 _У

щи 1 пмо ОЯШЭ

ана-тров ости со-ника нима ко-дис-ЭОТ <ема кро-етик иоз-

■ И1Д4Ы4Та|1ий

(37 ,_-(|л,тс:|

На рисунке 2 (внизу) представлена детальная интерпретация связей исследуемых характеристик, выполненная на основании структуры соответствующих дискриминантных корней (рис. 2, вверху). Согласно ей состояние эубиоза характеризуется проявлением у

бифидобактерий высокой способности инактивировать лизоцим, системный провоспа-лительный цитокин TNF-a, значительным уровнем микробной массы (ПМО). Вклад каждого из перечисленных показателей составил соответственно 8,70; 25,0 и 66,3%.

Для штаммов бифидобактерий в условиях ДБЗ 1 наиболее значимым признаком оказалась способность подавлять продукцию IL-8. Далее приводится вклад каждого из информативных параметров по отношению к суммарному вкладу всех значимых показателей по всем степеням дисбиоза. Для бифидобактерий, выделенных при ДБЗ 2, как и при дис-биозе 1 степени, была свойственна способность влиять на продукцию IL-8 (21,2%) и дополнительно — на секрецию TNF-a (32,4%). При тяжелой степени нарушений микробиоценоза (ДБЗ 3) бифидобактерии проявляли наиболее выраженную способность среди других групп штаммов влиять на продукцию ИНФ-у (46,4%). Дискриминантный анализ исследуемых характеристик бифидобактерий выявил параметры со стабильными значениями (продукция IL-10, АЦА в отношении IL-10 и IL-8), не зависящими от микроэкологического состояния биотопа толстого кишечника, поэтому при обработке результатов они не вошли в группу информативных показателей, представленных на рисунке 2 (внизу).

Таким образом, использование дискриминантного анализа параметров, характеризующих способность бифидобактерий взаимодействовать с эффекторами врожденного (ли-зоцим) и адаптивного иммунитета (влияние на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека), позволило выявить информативные параметры, пригодные для оценки функционального состояния доминантной микрофлоры с учетом уровня дисбиотических нарушений.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования позволили рассмотреть роль бифидобактерий в качестве микробного регулятора кишечного гомеостаза человека. При анализе исследуемых свойств бифидобактерий с использованием дискриминантного анализа определены информативные параметры, определяющие степень устойчивости кишечного гомеостаза в условиях эубиоза и дисбиотических нарушений от 1 до 3 степени. Следует отметить, что проведенный дискриминантный анализ исследуемых биологических свойств эубиотических и дисбиотических клинических штаммов бифидобактерий распределил все исследуемые изоляты на 4 группы с почти 100% точностью, отразив их принадлежность к биотопу толстого кишечника при физиологическом состоянии микробиоценоза и при дисбио-тических нарушениях 1, 2 и наиболее тяжелой 3 степени. Полученный результат подтверждает адекватность проведенного исследования с применением указанного математического анализа и важность изученных биологических свойств бифидобактерий для оценки состояния кишечного гомеостаза, реализуемого с участием метаболитов доминантных бактерий.

Установлено, что в формировании состояния эубиоза толстого кишечника существенная роль среди всех анализируемых свойств бифидобактерий принадлежит уровню микробной обсемененности (66,3% от вклада исследуемых показателей для эубиотических штаммов), что согласуется с общепринятыми критериями микробиологической диагностики дисбиоза толстого кишечника [4]. Вторым по значимости (25,0%) оказался показатель, характеризующий способность бифидобактерий снижать концентрацию in vitro одного из ранних провоспалительных цитокинов системного действия TNF-a, что может указывать на потенциальную способность эубиотических клинических штаммов ограничивать уровень воспалительной реакции в кишечнике, минимизируя риск избыточной стимуляции иммунитета, способный нанести вред собственным клеткам хозяина. Указанное качество бифидобактерий изучалось многими авторами, преимущественно на пробиотиче-ских штаммах [12, 13], реже на клинических [5, 10], но без учета состояния микробиоценоза толстого кишечника.

Существенная роль среди изученных свойств бифидобактерий в условиях эубиоза по результатам проведенного анализа принадлежит показателю, отражающему способность инактивировать лизоцим (8,75%) — универсальный фактор врожденного иммунитета [3]. Полученный результат подчеркивает значимость данного признака в адаптационных механизмах бифидофлоры, определяющих длительное выживание и доминирование этой микрофлоры в организме хозяина [1].

Следует отметить, что другие исследованные показатели (не отраженные на рис. 2, внизу) имели примерно равное значение в характеристике эубиотических штаммов, но в меньшей степени дифференцировали их от дисбиотических изолятов, по сравнению с выявленными информативными параметрами.

При оценке информативных параметров, определяющих вклад бифидобактерий в формирование устойчивости кишечного гомеостаза в условиях измененного микроэкологического состояния (дисбиоз), обращает на себя внимание участие свойств, характеризующих способность доминантных бактерий влиять на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарами человека: хемокина IL-8 (вклад 21,1%, информативен для дисбиоза 1 и 2 степени), TNF-a (32,4%, информативен для дисбиоза 2 степени) и IFN-y (46,4%, информативен для дисбиоза 3 степени). Полученные результаты свидетельствуют о способности бифидобактерий, основной доминантной флоры биотопа толстого кишечника, изменять продукцию провоспалительных цитокинов в большей мере в условиях нарушения микросимбиоценоза от легкой до тяжелой степени дисбиоза.

Выявленная однонаправленность изменений показателей, характеризующих продукцию IL-10 и АЦА в отношении IL-10, IL-8, независимо от состояния микросимбиоце-ноза толстого кишечника, свидетельствует о высокой степени стабильности данных признаков у доминантов. Способность бифидобактерий усиливать продукцию IL-10 в сочетании с низкой антицитокиновой активностью в отношении данного цитокина и хемокина IL-8, вероятно, характеризует значительный адаптационный потенциал доминанта в противовоспалительном эффекте и поддержании иммунологической толерантности, реализуемый даже при глубоких микроэкологических нарушениях в биотопе толстого кишечника. Вот почему полученные результаты свидетельствуют о связи цитокинового статуса хозяина с характером его взаимодействия с нормофло-рой (бифидобактериями). Таким образом, полученные материалы раскрывают механизмы иммунорегуляторного влияния метаболитов бифидофлоры в поддержании гомео-стаза кишечной микробиоты через цитокиновый и антицитокиновый профиль хозяина.

Работа выполнена при грантовой поддержке фундаментальных исследований УрО РАН — проект № 15-5-4-7«Роль бифидофлоры в формировании гомеостаза человека» и проект № 15-3-4-36 «Механизмы микробной регуляции ассоциативного симбиоза при инфекции».

ЛИТЕРАТУРА

1. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека. Екатеринбург: УрО РАН, 2014.

2. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н., Смолягин А.И., Иванова Е.В. Антицитокиновая активность микроорганизмов. Журн. микробиол. 2011, 4: 56-61.

3. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете. СПб, Наука, 2006.

4. Приказ Минздрава России от 09.06.2003 г. №231 Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ГОСТ 91500.11.0004-2003).

5. Bermudez-Brito M., Muñoz-Quezada S., Gomez-Llorente C. et al. Cell-free culture supernatant of Bifidobacterium breve CNCM I-4035 decreases pro-inflammatory cytokines in human dendritic cells challenged with Salmonella typhi through TLR activation. PLoS One. 2013, 8 (3): e59370.

6. Hardy H., Harris J., Lyon E. et al. Probiotics, prebiotics and immunomodulation of gut mucosal defences: homeostasis and immunopathology. Nutrients. 2013, 5 (6): 1869-1912.

7. Heuvelin E., Lebreton C., Grangette C. et al. Mechanisms involved in alleviation of intestinal inflammation by bifidobacterium breve soluble factors. PLoS One. 2009, 4 (4): e 5184.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

8. Imaoka A., Shima T., Kato K. et al. Anti-inflammatory activity ofprobiotic Bifidobacterium: Enhancement of IL-10 production in peripheral blood mononuclear cells from ulcerative colitis patients and inhibition of IL-8 secretion in HT-29 cells. World J. Gastroenterol. 2008, 14 (16): 2511-2516.

9. Kamada N., Núñez G. Role of the gut microbiota in the development and function of lymphoid cells. J. Immunol. 2013, 190 (4): 1389-1395.

10. López P., González-Rodríguez I., Gueimonde M. et al. Immune response to Bifidobacterium bifidum strains support Treg/Th17 plasticity. PLoS One. 2011, 6 (9): e24776.

11. Menard O., Butel M.-J., Gaboriau-Routhiau V. et al. Gnotobiotic mouse immune response induced by Bifidobacterium sp. strains isolated from infants. Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74 (3): 660-666.

12. Plantinga TS., van Maren WW, van Bergenhenegouwen J. et al. Differential Toll-like receptor recognition and induction of cytokine profile by Bifidobacterium breve and Lactobacillus strains of probiotics. Clin. Vaccine Immunol. 2011, 18 (4): 621-628.

13. Plaza-Diaz J., Gomez-Llorente C., Fontana L. et al. Modulation of immunity and inflammatory gene expression in the gut, in inflammatory diseases ofthe gut and in the liverby probiotics. World J. Gastroenterol. 2014, 20 (42): 15632-15649.

14. Zarrati M., Shidfar F., Nourijelyani K. et al. Lactobacillus acidophilus La5, Bifidobacterium BB12, and Lactobacillus casei DN001 modulate gene expression of subset specific transcription factors and cytokines in peripheral blood mononuclear cells of obese and overweight people. Biofactors. 2013, 39 (6): 63343.

Контактная информация: Перунова Н.Б.,

460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)74-50-08

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015

А.Л.Бурмистрова1, А.В.Евдокимов1, Д.С.Сташкевич1, Ю.Ю.Филиппова1, Т.А.Суслова1,2

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ДВУХЛОКУСНЫХ ГАПЛОТИПОВ ГЕНОВ СЕНСОРОВ МИКРОБНЫХ КОМПОНЕНТОВ TLR 1 И TLR 6 В ОСНОВНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ЮЖНОГО УРАЛА

Челябинский государственный университет, 2Челябинская областная станция переливания крови

Цель. Оценить долю различных гаплотипов TLR1—TLR6 в популяциях русских, башкир и нагайбаков Челябинской области. Материалы и методы. В исследование были включены потенциальные доноры стволовой клетки из реестра Челябинской областной станции переливания крови, которые были разделены на три популяции: русские (81), башкиры (78) и нагайбаки (84) чел. Во всех трех группах было проведено генотипирование по двум полиморфизмам генов TLR1 и TLR6. Точковый полиморфизм 1805T>G гена TLR 1 был определен с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, а полиморфизм 745C>T гена TLR6 — с помощью ПЦР с использованием сиквенс-специфичных праймеров. Результаты. Гаплотип TLR1 1805*G-TLR6 745*T часто встречается в популяции русских (42%) и относительно редко — среди башкир (17%). В отношении гаплотипа TLR1 1805*T-TLR6 745*C наблюдается обратная картина: более частое распространение среди башкир (65%) и относительно редкая встречаемость у русских (23%). Для нагайбаков были обнаружены частоты указанных гаплотипов, занимающие промежуточное положение по сравнению с соответствующими показателями для популяций русских и башкир, что, по-видимому, отражает сложные пути расселения их предков и влияние других неадаптационных факторов. Заключение. Впервые были определены частоты двухлокусных гаплотипов TLR1-TLR6 в основных популяциях Южного Урала. Дальнейшие исследования в этой области позволят лучше понять особенности иммунного ответа и чувствительность к инфекциям в различных популяциях.

Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 96—101

Ключевые слова: толл-подобные рецепторы, точковые полиморфизмы, гаплотипы, популяции Южного Урала, русские, башкиры, нагайбаки

A.L.Burmistrova1, A.V.Evdokimov1, D.S.Stashkevich1, Yu.Yu.Filippova1, T.A.Suslova1,2

DISTRIBUTION OF TWO-LOCUS HAPLOTYPES OF MICROBIAL COMPONENT SENSOR GENES TLR1 AND TLR6 IN MAJOR POPULATIONS OF SOUTH URALS

Chelyabinsk State University, 2Chelyabinsk Region Station of Blood Transfusion, Russia

Aim. Evaluate the fraction of various TLR1-TLR6 haplotypes in populations of Russians, Bashkir and Nagaybak of Chelyabinsk Region. Materials and methods. Potential donors of stem cells from Chelyabinsk Region Station of Blood Transfusion registry were included into the study and split into 3 populations: Russians (81), Bashkir (78) and Nagaybak (84). Genotyping by 2

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.